פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד חדירות המעי של האלגיה. שיטה זו מועילה למחקרים ביולוגיים בסיסיים על בריאות המעיים הקשורים לאינטראקציה בין בקטריה מעיים למארחים שלהם ולהקרנה כדי לזהות פרוביוטיקה וחומרים כימיים כדי לרפא תסמונת המעיים הדולף ומחלות המעי דלקתיות.
באורגניזמים חיים, היפרסטרוביליות מעיים היא סימפטום רציני המוביל למחלות מעיים דלקתיות רבות (IBDs). האלגיה היא מודל בעלי חיים שאינו מדיה , המשמש רבות כמערכת שיטת שיטה, בשל תוחלת החיים הקצרה, השקיפות, העלות והאפקטיביות, והיעדר בעיות באתיקה בעלי ממון. במחקר זה, פותחה שיטה כדי לחקור את ההשפעות של חיידקים שונים 3, 3 ‘-diindolylmethane תאן (עמום) על חדירות המעיים של C. אלגיה עם מערכת ניתוח תמונה בתפוקה גבוהה. התולעים נדבקו בחיידקים שונים או מטופלים עם DIM עבור 48 h וניזון עם fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran לילה. לאחר מכן נבדק חדירות המעי על ידי השוואת הדימויים הפלואורסצנטית ועוצמת הקרינה הפלואורסצנטית בתוך גופי התולעת. שיטה זו עשויה להיות גם הפוטנציאל לזהות פרוביוטיקה וחיידקים מעיים פתוגניים המשפיעים על חדירות המעי במודל החי והוא יעיל לבדיקת ההשפעות של מזיקים או בריאות לקידום הכימיקלים על חדירות המעי ובריאות המעיים. עם זאת, פרוטוקול זה יש גם כמה מגבלות משמעותיות ברמה הגנטית, במיוחד לקביעת אילו גנים משתנים לשלוט במחלות, כי שיטה זו משמשת בעיקר להגדרה פנוטימית. בנוסף, שיטה זו מוגבלת לקביעת בדיוק איזה מצעים פתוגניים לגרום לדלקת או להגדיל את החדירות של המעיים של התולעים במהלך הזיהום. לכן, מחקרים מעמיקים יותר, כולל חקירה של המנגנון הגנטי המולקולרי באמצעות חיידקים מוטציה, נמטודות, כמו גם ניתוח מרכיב כימי של חיידקים, נדרשים להעריך באופן מלא את התפקוד של חיידקים וכימיקלים בקביעת חדירות המעי.
חדירות המעי נחשב אחד המחסומים העיקריים הקשורים המעי microbiota וחסינות רירית והוא צפוי להיות מושפע על ידי מספר גורמים, כגון שינויים microbiota בטן, ליקוי אפיתל, או שינוי שכבת ריר1. העיתונים האחרונים דיווחו על פרוטוקולים יעילים כדי למדוד את חדירות המעי של תאי מעיים אנושיים על ידי ניתוח שיעורי השטף הזריחה על פני שכבת התא מעיים2, אבל מחקרים פחות להציג הליך מתאים למדידת חדירות הבטן ב nematodes, במיוחד ב -C. אלגיה, על ידי שימוש בצביעת fitc-dextran.
קיימים שני פרוטוקולים מייצגים למדידת חדירות הבטן ב -C. אלגיה באמצעות הנילוס האדום3 ואריאולאוצין דינתרן (או שיטת הדרדס)4,5. בפרוטוקול זה, השתמשנו FITC-dextran (משקל מולקולרי ממוצע 10,000), אשר יש משקל מולקולרי הרבה יותר גבוה מאשר הנילוס אדום (MW = 318.37) ו-dioglaucine דינתרן (MW = 792.85). Fitc-dextran דומה יותר הנילוס האדום או erioglaucine ניתרן חומרי מזינים macromolecular בפועל כגון פחמימות, אשר נספגים דרך שכבת המעי. ניתן להעריך בקלות את חדירות המעיים של מערכת המזון המומנת של המעי הקיסרי . עם זאת, בתוך שיטת הדרדס, ניתוח כמותי של חדירות המעי קשה עקב חוסר סטנדרטיזציה ויש להעריך ידנית4,5. במקרה של הסדר האדום של הנילוס, אדום הנילוס כתמי גם טיפות שומנים בתאים, אשר עלול להפריע להגדרה המדויקת של חדירות הבטן בג6. הפרוטוקולים הנוכחיים מאפשרים ניתוח כמותי מהיר ומדויק של חדירות המעיים ב -C. אלגיה המטופלת בחיידקים וכימיקלים שונים תוך הימנעות מהכתמים שומנים בלתי ספציפיים.
ג. אלגיה הוא מודל אופייני בתחומים ביולוגיים בשל מחירו הסביר, מניפולציה קלה, בעיות מוגבלות בבעלי חיים, ותוחלת חיי קצר, המועילה לניסויים מהירים7. בפרט, לאחר הוצאת הגנום c. אלגיה , כמעט 40% מהגנים בגנום c. אלגיה הינם אורתוולוגי לגנים הגורמים למחלות אנושיות8. יתר על כן, הגוף השקוף מאפשר התבוננות בתוך האורגניזם, אשר יתרון עבור מחקר אירועים סלולריים ליישומים הפלואורסצנטית בביולוגיה התא, למשל, תא גזע מכתים עם DAPI או אימונוהיסטוכימיה9. ג. אלאנים משמשים לעתים קרובות כבעל חיים ניסיוני כדי ללמוד את האינטראקציה בין מיקרוביוטה הבטן לבין הפונדקאי; בנוסף, C. אלגיהns משמש למסך בריאות לקידום חיידקים פרוביוטיקה10,11,12 , כמו גם כימיקלים תזונתיים לקידוםבריאותהמעיים 13,14.
פסאודומונס aeruginosa ובידור faecalis הם חיידקים ידועים הבטן כי לרעה להשפיע על מערכת העיכול, במיוחד את התאים האפיתל חוקן של בדרכי המעיים15,16. לכן, מדידת חדירות הבטן המופעל על ידי חיידקים אלה הוא הכרחי להקרנה ופיתוח של תרופות חדשות שיכולות להתאושש ולהפחית את הנזק שנגרם על ידי דלקת בקטריאלי וזיהום. בפרוטוקול זה בדקנו את ההשפעות של חיידקי המעי האלה על חדירות המעיים של הג.
כמו כן אנו מדווחים על פרוטוקול אופטימלי לבדיקת כימיקלים על חדירות המעיים של הג. למטרה זו, השתמשנו 3, 3 ‘-diindolylmethane תאן (DIM) כמו מודל כימי משום עמום הוא מתחם אקטיביים מטבוליט נגזר של אינדול-3-carbinol, אשר קיים בצמחי מזון הבהקרוסי, ו דווח כי יש השפעות טיפוליות על ibd בעכברים17,18. בנוסף, גילינו לאחרונה כי DIM משפר את התפקוד הלקוי של חדירות המעי בתאי מעיים אנושיים, כמו גם את מודל נמטודות C. אלגיה19.
במחקר זה, השתמשנו בשלושה תנאים ניסיוניים שונים. ראשית, מדדנו את ההשפעות של החיידקים השונים, P. aerginosa ו -E. faecalis, על חדירות מעיים (איור 1). שנית, מדדנו את ההשפעות של P. aeruginosa בשידור חי וחום על חדירות המעי (איור 2). שלישית, מדדנו את ההשפעות של הדים (מודל כימי) על חדירות המעיים של ס. ל. פ . (איור 3).
מטרת מחקר זה היתה לפתח פרוטוקולים ממוטבים המודדים את חדירות המעיים של ה -C. אלגיה, אשר משתנה על ידי טיפול עם חיידקים מעיים שונים, כמו גם עם כימיקלים.
על ידי ניצול השיטה החדשה הזאת לקביעת חדירות הבטן ב -C. אלגיה, המשלבת מיקרוסקופית קרינה אוטומטית וניתוח דימוי כמותי, ניתן לקבוע את ההבדלים הנגרמים על-ידי מיקרואורגניזמים או כימיקלים בvivo, במיוחד במעיים של מעיים. פרוטוקול זה שימושי עבור חקירות המעיים והחלים על משימות רבות, כגון מיני …
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה היה נתמך על ידי מכון קוריאה של מדע וטכנולוגיה מענק מחקר בתחום הציור (2E29563).
3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
Cholesterol | Sigma | C3045 | |
Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |