Måle effekten av bakterier og kjemikalier på intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du kan måle intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans. Denne metoden er nyttig for grunnleggende biologisk forskning på intestinal helse relatert til samspillet mellom tarmbakterier og deres vert og for screening for å identifisere probiotiske og kjemiske agenter for å kurere leaky gut syndrom og inflammatoriske tarm sykdommer.
Abstract
I levende organismer, intestinal hyperpermeability er et alvorlig symptom som fører til mange inflammatoriske tarm sykdommer (IBDs). Caenorhabditis elegans er en nonmammalian dyr modell som er mye brukt som et analysesystem på grunn av sin korte levetid, åpenhet, kostnadseffektivitet, og mangel på dyreetikk problemer. I denne studien ble en metode utviklet for å undersøke virkningene av ulike bakterier og 3, 3 ‘-diindolylmethane (DIM) på intestinal permeabilitet av C. elegans med høy gjennomstrømming bildeanalyse system. Ormene var infisert med annerledes tarmen bacteria eller cotreated med svak for 48 h og matet med fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Deretter intestinal permeabilitet ble undersøkt ved å sammenligne fluorescens bilder og fluorescens intensitet inne i ormen organer. Denne metoden kan også ha potensial til å identifisere probiotiske og patogene tarmbakterier som påvirker intestinal permeabilitet i dyre modellen og er effektiv for å undersøke virkningene av skadelige eller helsefremmende kjemikalier på intestinal permeabilitet og intestinal helse. Imidlertid har denne protokollen også noen betydelige begrensninger på genetisk nivå, spesielt for å bestemme hvilke gener er endret for å kontrollere sykdom, fordi denne metoden er mest brukt for fenotypiske besluttsomhet. I tillegg er denne metoden begrenset til å bestemme nøyaktig hvilke patogene underlag forårsake betennelse eller øke permeabilitet av ormene tarmen under infeksjon. Derfor, ytterligere grundige studier, inkludert undersøkelse av den molekylære genetiske mekanismen ved hjelp av mutant bakterier og nematoder samt kjemiske komponent analyse av bakterier, er pålagt å fullt ut evaluere funksjonen av bakterier og kjemikalier for å bestemme intestinal permeabilitet.
Introduction
Intestinal permeabilitet regnes som en av de viktigste barrierene knyttet til intestinal bakterieflora og slimhinne immunitet og vil trolig bli påvirket av flere faktorer, for eksempel gut bakterieflora modifikasjoner, epitel verdifall, eller mucus lag endringer1. Aktuelle papirer har rapportert effektive protokoller for å måle intestinal permeabilitet av kultivert menneskelige tarm celler ved å analysere fluorescens Flux priser på tvers av intestinal celle lag2, men færre forskningsartikler presentere en passende prosedyre for å måle tarmen permeabilitet i nematoder, spesielt i C. elegans, ved hjelp av FITC-dextran farging.
Det er to representative protokoller for å måle tarmen permeabilitet i C. elegans bruke Nile Red3 og erioglaucine Disodium (eller Smurf analysen)4,5. I denne protokollen, brukte vi FITC-dextran (gjennomsnittlig molekylvekt 10 000), som har en mye høyere molekylvekt enn Nilen rød (MW = 318,37) og erioglaucine Disodium (MW = 792,85). FITC-dextran er mer likt enn Nilen rød eller erioglaucine Disodium fargestoffer til faktiske makro molekylære næringsstoffer som karbohydrater, som absorberes gjennom intestinal laget. Intestinal permeabilitet av C. elegans matet med erioglaucine Disodium (blå Smurf fargestoff) kan lett evalueres uten fluorescens mikroskopi. Men i Smurf analysen, kvantitativ analyse av intestinal permeabilitet er vanskelig på grunn av mangel på standardisering og bør evalueres manuelt4,5. I tilfelle av Nilen rød analysen, Nilen rød også flekker lipid dråper i celler, noe som kan forstyrre den nøyaktige bestemmelse av gut permeabilitet i C. elegans6. Den nåværende protokoller muliggjør rask og presis kvantitativ analyse av intestinal permeabilitet i C. elegans behandlet med ulike tarmbakterier og kjemikalier samtidig unngå løs lipid farging.
C. elegans er en typisk modell i biologiske felt på grunn av sin rimelige pris, enkel manipulasjon, begrenset dyreetikk problemer, og kortlevetid, noe som er gunstig for rask eksperimentering7. Spesielt etter hele C. elegans Genova ble publisert, nesten 40% av gener i C. elegans Genova ble funnet å være orthologous til gener som forårsaker menneskelige sykdommer8. Videre gjør den gjennomsiktige kroppen observasjon inne i organismen, noe som er fordelaktig for forsker på cellulære hendelser og for fluorescens anvendelser i cellebiologi, for eksempel Stamcelle farging med DAPI eller immunhistokjemi9. C. elegans blir ofte brukt som et eksperimentelt dyr for å studere samspillet mellom tarmen bakterieflora og verten; i tillegg er C. krystalldekorNS brukes til skjermen helsefremmende probiotiske bakterier10,11,12 samt kosttilskudd kjemikalier fremme intestinal helse13,14.
Pseudomonas aeruginosa og Enterococcus faecalis er velkjente gut bakterier som negativt påvirker fordøyelsessystemet, spesielt de colonic epitelceller i tarmkanalen15,16. Derfor, måle tarmen permeabilitet utløst av disse bakteriene er nødvendig for screening og utvikling av nye legemidler som kan gjenopprette og redusere skadene forårsaket av bakteriell betennelse og infeksjon. I denne protokollen, testet vi effekten av disse tarm bakteriene på intestinal permeabilitet av C. elegans.
Vi rapporterer også en optimalisert protokoll for testing kjemikalier på intestinal permeabilitet av C. elegans. For dette formålet, brukte vi 3, 3 ‘-diindolylmethane (Dim) som en modell kjemisk fordi Dim er en bioaktive metabolitten sammensatte avledet fra indol-3-carbinol, som er til stede i Brassica mat planter, og har blitt rapportert å ha terapeutiske effekter på IBD i mus17,18. I tillegg har vi nylig oppdaget at DIM forbedrer intestinal permeabilitet dysfunksjon i både kultivert menneskelige tarm celler så vel som modellen nematode C. elegans19.
I denne studien, brukte vi tre ulike eksperimentelle forhold. Først målte vi virkningene av de ulike bakteriene, P. aeruginosa og E. faecalis, på intestinal permeabilitet (figur 1). For det andre målte vi effekten av levende og varme-deaktivert P. aeruginosa på intestinal permeabilitet (figur 2). For det tredje målte vi effekten av DIM (en modell kjemisk) på intestinal permeabilitet av C. elegans matet med P. aeruginosa (Figur 3).
Målet med denne studien var å utvikle optimaliserte protokoller som måler intestinal permeabilitet av C. elegans, som er endret ved behandling med ulike tarmbakterier så vel som med kjemikalier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved å benytte denne nye metoden for å bestemme gut permeabilitet i C. elegans, som kombinerer automatiserte fluorescens mikroskopi og kvantitativ bildeanalyse, forskjellene forårsaket av tarm mikroorganismer eller kjemikalier kan fastsettes i Vivo, spesielt i C. elegans tarmen. Denne protokollen er nyttig for gut permeabilitet undersøkelser og gjelder for mange oppgaver, for eksempel reaktive oksygen arter (ROS) bestemmelse under stress forhold og morfologiske undersøkelser, på grunn av sin bekvem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av en Korea Institute of Science and Technology intramural forskningsstipend (2E29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3′-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3′-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3′-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3′-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
