Mäta effekterna av bakterier och kemikalier på tarm permeabiliteten hos Caenorhabditis elegans
Summary
Detta protokoll beskriver hur man mäter intestinal permeabilitet av Caenorhabditis elegans. Denna metod är till hjälp för grundläggande biologisk forskning om intestinal hälsa relaterade till samspelet mellan tarmbakterier och deras värd och för screening för att identifiera probiotiska och kemiska agenter för att bota läckande tarm syndrom och inflammatoriska tarmsjukdomar.
Abstract
I levande organismer, intestinal hyperpermeabilitet är ett allvarligt symptom som leder till många inflammatoriska tarmsjukdomar (IBDs). Caenorhabditis elegans är en icke däggdjur djurmodell som ofta används som ett analyssystem på grund av dess korta livslängd, transparens, kostnadseffektivitet, och brist på djur etikfrågor. I denna studie, en metod har utvecklats för att undersöka effekterna av olika bakterier och 3, 3 ‘-diindolylmethane (DIM) på intestinal permeabilitet av C. elegans med ett högt dataflöde bildanalys system. Maskarna var infekterade med olika tarmbakterier eller cobehandlad med DIM för 48 h och utfodras med fluorescein isotiocyanat (FITC)-dextran över natten. Därefter undersöktes tarm permeabiliteten genom att jämföra fluorescensbilderna och fluorescensintensiteten inuti mask kropparna. Denna metod kan också ha potential att identifiera probiotiska och patogena tarmbakterier som påverkar intestinal permeabilitet i djur modellen och är effektiv för att undersöka effekterna av skadliga eller hälsofrämjande kemikalier på intestinal permeabilitet och intestinal hälsa. Detta protokoll har emellertid också vissa avsevärda begränsningar på genetisk nivå, särskilt för att bestämma vilka gener som ändras för att kontrollera sjukdom, eftersom denna metod används främst för fenotypisk bestämning. Dessutom är denna metod begränsad till att bestämma exakt vilka patogena substrat orsaka inflammation eller öka permeabiliteten av maskar tarmarna under infektion. Därför krävs ytterligare djupgående studier, inklusive undersökning av den molekylära genetiska mekanismen med muterade bakterier och nematoder samt kemisk komponent analys av bakterier, för att fullt ut utvärdera funktionen hos bakterier och kemikalier vid bestämning av tarmpermeabilitet.
Introduction
Intestinal permeabilitet anses vara en av de viktigaste hindren i samband med intestinal bakterieflora och slemhinnor immunitet och kommer sannolikt att påverkas av flera faktorer, såsom Gut bakterieflora modifieringar, epitelial försämring, eller slemskikt förändringar1. De senaste tidningarna har rapporterat effektiva protokoll för att mäta intestinal permeabilitet av odlade mänskliga tarmceller genom att analysera fluorescensen Flux priser över tarmen cell Layer2, men färre forskningsrapporter presentera ett lämpligt förfarande för att mäta tarmpermeabilitet i nematoder, särskilt i C. elegans, genom att använda FITC-dextran färgning.
Det finns två representativa protokoll för att mäta tarmpermeabiliteten i C. elegans med hjälp av Nile Red3 och erioglaucine dinatrium (eller Smurf-analysen)4,5. I detta protokoll använde vi FITC-dextran (medelmolekylvikt 10 000), som har en mycket högre molekylvikt än Nile Red (MW = 318,37) och erioglaucine dinatrio (MW = 792,85). FITC-dextran är mer liknande än Nile röd eller erioglaucine dinatriumfärgämnen till faktiska makromolekylära näringsämnen såsom kolhydrater, som absorberas genom tarm lagret. Den intestinala permeabiliteten hos C. elegans matas med erioglaucine dinatrium (blå Smurf Dye) kan enkelt utvärderas utan fluorescens mikroskopi. Men i Smurf analysen, kvantitativ analys av intestinal permeabilitet är svårt på grund av bristen på standardisering och bör utvärderas manuellt4,5. När det gäller Nilens röda analys fläckar Nilen Red också lipiddroppar i celler, vilket kan störa den exakta bestämningen av Gut permeabilitet i C. elegans6. De nuvarande protokollen möjliggör snabb och exakt kvantitativ analys av intestinal permeabilitet i C. elegans som behandlats med olika tarmbakterier och kemikalier samtidigt som man undviker ospecifik lipidfärgning.
C. elegans är en typisk modell i biologiska områden på grund av dess rimliga priser, enkel manipulation, begränsade djur etikfrågor, och kort livslängd, vilket är fördelaktigt för snabb experiment7. I synnerhet, efter att hela c. elegans genomet publicerades, nästan 40% av gener i C. elegans genomet befanns vara ortologous för gener som orsakar mänskliga sjukdomar8. Dessutom medger den genomskinliga kroppen observation inuti organismen, vilket är fördelaktigt för att forska cellulära händelser och för fluorescenstillämpningar i cellbiologi, till exempel, stamcells färgning med DAPI eller immunohistokemi9. C. elegans används ofta som försöksdjur för att studera samspelet mellan tarmfloran och värden; Dessutom, C. rymlns används för att skärmen hälsofrämjande probiotiska bakterier10,11,12 samt kost kemikalier främja intestinal hälsa13,14.
Pseudomonas aeruginosa och Enterococcus faecalis är välkända tarmbakterier som negativt påverkar det gastrointestinala systemet, särskilt kolon epitelceller i tarmkanalen15,16. Därför är att mäta den Gut permeabilitet utlöses av dessa bakterier är nödvändigt för screening och utveckling av nya läkemedel som kan återhämta sig och minska skadorna orsakade av bakteriell inflammation och infektion. I detta protokoll testade vi effekterna av dessa tarmbakterier på tarm permeabiliteten hos C. elegans.
Vi rapporterar också ett optimerat protokoll för att testa kemikalier på tarm permeabiliteten hos C. elegans. För detta ändamål, vi använde 3, 3 ‘-diindolylmethane (dim) som en modell kemikalie eftersom dim är en bioaktiva metabolit förening som härrör från indol-3-carbinol, som finns i Brassica mat växter, och har rapporterats ha terapeutiska effekter på IBD hos möss17,18. Dessutom upptäckte vi nyligen att DIM förbättrar intestinal permeabilitet dysfunktion i både odlade mänskliga tarmceller samt modellen Nematoden C. elegans19.
I denna studie använde vi tre olika försöksbetingelser. Först mätte vi effekterna av de olika bakterierna, P. aeruginosa och E. faecalis, på tarm permeabilitet (figur 1). För det andra mätte vi effekterna av levande och Värmeinaktiverade P. aeruginosa på tarm permeabilitet (figur 2). För det tredje mätte vi effekterna av DIM (en modell kemisk) på intestinal permeabilitet av C. elegans matas med P. aeruginosa (figur 3).
Syftet med denna studie var att utveckla optimerade protokoll som mäter tarm permeabiliteten hos C. elegans, som ändras genom behandling med olika tarmbakterier samt med kemikalier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genom att utnyttja denna nya metod för att bestämma Gut permeabilitet i c. elegans, som kombinerar automatiserad fluorescens mikroskopi och kvantitativ bildanalys, kan de skillnader som orsakas av intestinal mikroorganismer eller kemikalier bestämmas in vivo, särskilt i C. elegans tarmen. Detta protokoll är användbart för Gut permeabilitet utredningar och gäller för många uppgifter, såsom reaktiva syreradikaler (ROS) bestämning under stressförhållanden och morfologiska undersökningar, på…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av ett Korea Institute of Science and Technology interna Research Grant (2e29563).
Materials
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate – dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
References
- Bischoff, S. C., et al. Intestinal permeability–a new target for disease prevention and therapy. BMC Gastroenterology. 14 (1), 189 (2014).
- Peng, L., Li, Z. R., Green, R. S., Holzman, I. R., Lin, J. Butyrate enhances the intestinal barrier by facilitating tight junction assembly via activation of AMP-activated protein kinase in Caco-2 cell monolayers. The Journal of Nutrition. 139 (9), 1619-1625 (2009).
- Ren, M., et al. Developmental basis for intestinal barrier against the toxicity of graphene oxide. Particle Fibre Toxicology. 15 (1), 26 (2018).
- Kissoyan, K. A. B., et al. Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group. Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).
- Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genetics. 12 (7), 1006135 (2016).
- Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of lipid abundance and evaluation of lipid distribution in Caenorhabditis elegans by Nile red and oil red O staining. Journal of Visualized Experiments. (133), e57352 (2018).
- Johnson, T. E. Advantages and disadvantages of Caenorhabditis elegans for aging research. Experimental Gerontology. 38 (11-12), 1329-1332 (2003).
- Culetto, E., Sattelle, D. B. A role for Caenorhabditis elegans in understanding the function and interactions of human disease genes. Human Molecular Genetics. 9 (6), 869-877 (2000).
- Hubbard, E. J. A. Caenorhabditis elegans germ line: A model for stem cell biology. Developmental Dynamics. 236 (12), 3343-3357 (2007).
- Park, M. R., et al. Probiotic Lactobacillus fermentum strain JDFM216 stimulates the longevity and immune response of Caenorhabditis elegans through a nuclear hormone receptor. Scientific Reports. 8, 7441 (2018).
- Kim, Y., Mylonakis, E. Caenorhabditis elegans immune conditioning with the probiotic bacterium Lactobacillus acidophilus strain NCFM enhances gram-positive immune responses. Infection and Immunity. 80 (7), 2500-2508 (2012).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri SBT2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Dinh, J., et al. Cranberry extract standardized for proanthocyanidins promotes the immune response of Caenorhabditis elegans to Vibrio cholerae through the p38 MAPK pathway and HSF-1. PLoS One. 9 (7), 103290 (2014).
- Vayndorf, E. M., Lee, S. S., Liu, R. H. Whole apple extracts increase lifespan, healthspan and resistance to stress in Caenorhabditis elegans. Journal of Functional Foods. 5 (3), 1236-1243 (2013).
- Huycke, M. M., Abrams, V., Moore, D. R. Enterococcus faecalis produces extracellular superoxide and hydrogen peroxide that damages colonic epithelial cell DNA. Carcinogenesis. 23 (3), 529-536 (2002).
- Laughlin, R. S., et al. The key role of Pseudomonas aeruginosa PA-I lectin on experimental gut-derived sepsis. Annals of Surgery. 232 (1), 133-142 (2000).
- Huang, Z., et al. 3,3′-Diindolylmethane decreases VCAM-1 expression and alleviates experimental colitis via a BRCA1-dependent antioxidant pathway. Free Radical Biology, Medicine. 50 (2), 228-236 (2011).
- Jeon, E. J., et al. Effect of Oral Administration of 3,3′-Diindolylmethane on Dextran Sodium Sulfate-Induced Acute Colitis in Mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 64, 7702-7709 (2016).
- Kim, J. Y., et al. 3,3′-Diindolylmethane improves intestinal permeability dysfunction in cultured human intestinal cells and the model animal Caenorhabditis elegans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67 (33), 9277-9285 (2019).
- Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (128), e56437 (2017).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Molecular Metabolism. 2 (2), 92-102 (2013).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environmental Toxicology. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Al Atya, A. K., et al. Probiotic potential of Enterococcus faecalis strains isolated from meconium. Frontiers in Microbiology. 6, 227 (2015).
- Hanchi, H., Mottawea, W., Sebei, K., Hammami, R. The Genus Enterococcus: Between Probiotic Potential and Safety Concerns-An Update. Frontiers in Microbiology. 9, 1791 (2018).
- Pollack, M. The role of exotoxin A in pseudomonas disease and immunity. Reviews of Infectious Diseases. 5, 979-984 (1983).
- Vasil, M. L., Liu, P. V., Iglewski, B. H. Temperature-dependent inactivating factor of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Infection and Immunity. 13 (5), 1467-1472 (1976).
- Horii, T., Muramatsu, H., Monji, A., Miyagishima, D. Release of exotoxin A, peptidoglycan and endotoxin after exposure of clinical Pseudomonas aeruginosa isolates to carbapenems in vitro. Chemotherapy. 51 (6), 324-331 (2005).
- Kirikae, T., et al. Biological characterization of endotoxins released from antibiotic-treated Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 42 (5), 1015-1021 (1998).
- Morlon-Guyot, J., Mere, J., Bonhoure, A., Beaumelle, B. Processing of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A is dispensable for cell intoxication. Infection and Immunity. 77 (7), 3090-3099 (2009).
- Kim, Y. H., et al. 3,3′-diindolylmethane attenuates colonic inflammation and tumorigenesis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 15 (8), 1164-1173 (2009).
- Kanmani, P., et al. Probiotics and its functionally valuable products-a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 53 (6), 641-658 (2013).
- Nguyen, M. T., Gotz, F. Lipoproteins of Gram-Positive Bacteria: Key Players in the Immune Response and Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (3), 891-903 (2016).
