Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegansgemessen wird. Diese Methode ist hilfreich für die biologische Grundlagenforschung zur Darmgesundheit im Zusammenhang mit der Wechselwirkung zwischen Darmbakterien und ihrem Wirt und für das Screening, um probiotische und chemische Wirkstoffe zu identifizieren, um leckartigedarme Syndrome und entzündliche Darmerkrankungen zu heilen.
Abstract
In lebenden Organismen ist die Darmhyperpermeabilität ein ernstes Symptom, das zu vielen entzündlichen Darmerkrankungen (IBDs) führt. Caenorhabditis elegans ist ein nichtmammalisches Tiermodell, das aufgrund seiner kurzen Lebensdauer, Transparenz, Kostenwirksamkeit und des Mangels an tierethischen Fragen weithin als Assay-System verwendet wird. In dieser Studie wurde eine Methode entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Bakterien und 3,3'-Diindolylmethane (DIM) auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans mit einem Hochdurchsatz-Bildanalysesystem zu untersuchen. Die Würmer wurden mit verschiedenen Darmbakterien infiziert oder 48 h lang mit DIM kobehandelt und über Nacht mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Dextran gefüttert. Anschließend wurde die Darmdurchlässigkeit durch Vergleich der Fluoreszenzbilder und der Fluoreszenzintensität in den Schneckenkörpern untersucht. Diese Methode kann auch das Potenzial haben, probiotische und pathogene Darmbakterien zu identifizieren, die Diedarmdurchlässigkeit im Tiermodell beeinflussen und ist wirksam für die Untersuchung der Auswirkungen von schädlichen oder gesundheitsfördernden Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit und Darmgesundheit. Dieses Protokoll hat jedoch auch einige erhebliche Einschränkungen auf genetischer Ebene, insbesondere zur Bestimmung, welche Gene zur Kontrolle von Krankheiten verändert werden, da diese Methode hauptsächlich zur phänotytypischen Bestimmung verwendet wird. Darüber hinaus beschränkt sich diese Methode darauf, genau zu bestimmen, welche pathogenen Substrate Entzündungen verursachen oder die Durchlässigkeit des Darms der Würmer während der Infektion erhöhen. Daher sind weitere eingehende Studien, einschließlich der Untersuchung des molekulargenetischen Mechanismus mit mutierten Bakterien und Nematoden sowie der chemischen Komponentenanalyse von Bakterien, erforderlich, um die Funktion von Bakterien und Chemikalien bei der Bestimmung der Darmdurchlässigkeit vollständig zu bewerten.
Introduction
Darmdurchlässigkeit gilt als eine der Hauptbarrieren im Zusammenhang mit der Darmmikrobiota und Schleimhautimmunität und wird wahrscheinlich von mehreren Faktoren beeinflusst werden, wie Darm-Mikrobiota-Modifikationen, Epithel-Inbußen, oder Schleimschicht-Änderungen1. Jüngste Arbeiten haben über wirksame Protokolle zur Messung der Darmdurchlässigkeit kultivierter menschlicher Darmzellen berichtet, indem die Fluoreszenzflussraten in der Darmzellschicht2analysiert werden, aber weniger Forschungsarbeiten stellen ein geeignetes Verfahren zur Messung der Darmdurchlässigkeit in Nematoden, insbesondere in C. elegans,durch Verwendung von FITC-dextran Färbung dar.
Es gibt zwei repräsentative Protokolle zur Messung der Darmdurchlässigkeit in C. elegans mit Nilrot3 und Erioglindinatrium (oder dem Schlumpftest)4,5. In diesem Protokoll verwendeten wir FITC-Dextran (durchschnittliches Molekulargewicht 10.000), das ein viel höheres Molekulargewicht hat als Nilrot (MW = 318,37) und Erioglindinatrium (MW = 792,85). FITC-Dextran ähnelt eher als Nilrot- oder Erioglin-Dinatriumfarbstoffe tatsächlichen makromolekularen Nährstoffen wie Kohlenhydraten, die durch die Darmschicht absorbiert werden. Die Darmdurchlässigkeit von C. elegans, die mit Erioglindinatrium (blauer Schlumpffarbstoff) gefüttert werden, kann ohne Fluoreszenzmikroskopie einfach ausgewertet werden. Im Schlumpftest ist die quantitative Analyse der Darmdurchlässigkeit jedoch aufgrund fehlender Standardisierung schwierig und sollte manuell bewertet werden4,5. Im Falle des Nilrot-Assays färbt Nilrot auch Lipidtröpfchen in Zellen, die die genaue Bestimmung der Darmdurchlässigkeit in C. elegans6stören können. Die vorliegenden Protokolle ermöglichen eine schnelle und präzise quantitative Analyse der Darmdurchlässigkeit bei C. elegans, die mit verschiedenen Darmbakterien und Chemikalien behandelt werden, und vermeiden dabei unspezifische Lipidfärbungen.
C. elegans ist ein typisches Modell in biologischen Bereichen aufgrund seines erschwinglichen Preises, einfacher Manipulation, begrenzter tierethischer Fragen und kurzer Lebensdauer, was für schnelle Experimente von Vorteil ist7. Insbesondere nach der Veröffentlichung des gesamten C. elegans Genoms wurden fast 40% der Gene im C. elegans Genom als orthologous für Gene gefunden, die menschliche Krankheiten verursachen8. Darüber hinaus ermöglicht der transparente Körper die Beobachtung im Inneren des Organismus, was für die Erforschung zellulärer Ereignisse und für Fluoreszenzanwendungen in der Zellbiologie von Vorteil ist, z.B. Stammzellfärbung mit DAPI oder Immunhistochemie9. C. elegans wird oft als Versuchstier verwendet, um die Wechselwirkung zwischen der Darmmikrobiota und dem Wirt zu untersuchen; darüber hinaus, C. elegans wird verwendet, um gesundheitsfördernde probiotische Bakterien zu überprüfen10,11,12 sowie diätetische Chemikalien zur Förderung der Darmgesundheit13,14.
Pseudomonas aeruginosa und Enterococcus faecalis sind bekannte Darmbakterien, die das Magen-Darm-System negativ beeinflussen, insbesondere die Kolonepithelzellen des Darmtraktes15,16. Daher ist die Messung der Darmdurchlässigkeit, die von diesen Bakterien ausgelöst wird, für das Screening und die Entwicklung neuer Medikamente notwendig, die sich erholen und die Schäden reduzieren können, die durch bakterielle Entzündungen und Infektionen verursacht werden. In diesem Protokoll haben wir die Auswirkungen dieser Darmbakterien auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegansgetestet.
Wir berichten auch über ein optimiertes Protokoll zur Prüfung von Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans. Zu diesem Zweck verwendeten wir 3,3'-Diindolylmethane (DIM) als Modellchemikalie, da DIM eine bioaktive Metabolitverbindung ist, die aus Indol-3-Carbinol gewonnen wird, das in Brassica-Lebensmittelpflanzen vorhanden ist und nachweislich therapeutische Wirkungen auf IBD bei Mäusen17,18hat. Darüber hinaus entdeckten wir vor kurzem, dass DIM die Darmdurchlässigkeitsfunktionsstörung sowohl in kultivierten menschlichen Darmzellen als auch im Modell Nematode C. elegans19verbessert.
In dieser Studie haben wir drei verschiedene experimentelle Bedingungen verwendet. Zuerst haben wir die Auswirkungen der verschiedenen Bakterien, P. aeruginosa und E. faecalis, auf die Darmdurchlässigkeit gemessen (Abbildung 1). Zweitens haben wir die Auswirkungen von lebender und hitzeinaktivierter P. aeruginosa auf die Darmdurchlässigkeit gemessen (Abbildung 2). Drittens haben wir die Auswirkungen von DIM (einer Modellchemikalie) auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans gemessen, die mit P. aeruginosa gefüttert werden (Abbildung 3).
Ziel dieser Studie war es, optimierte Protokolle zu entwickeln, die die Darmdurchlässigkeit von C. elegansmessen, die durch die Behandlung mit verschiedenen Darmbakterien sowie mit Chemikalien verändert wird.
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Protocol
1. Zubereitung von P. aeruginosa PAO1 und Escherichia coli OP50 Kultur
- Bereiten Sie 500 ml sterilisierte Luria-Bertani (LB) medium (Tabelle 1) und impfen Sie eine einzelne Kolonie von P. aeruginosa in das Medium. Inkubieren Sie die Kultur für 14 bis 15 h bei 37 °C mit einer Schüttelgeschwindigkeit von 150 Rprossen.
- Gleichmäßig verteilen Sie die Bakterienkultur in zwei 500 ml Zentrifugenröhren und zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.220 x g bei 4 °C für 30 min.
- Entfernen Sie den Überstand, bis das Volumen 50 ml (ein Zehntel des Anfangsvolumens) beträgt, und setzen Sie das bakterielle Pellet wieder auf.
- Bewahren Sie die konzentrierte Bakterienkultur bei 4 °C bis zur Anwendung auf. Die Lagerzeit von P. aeruginosa Kultur kann bis zu 1 Monat sein, aber frische Kultur ist besser für die Induktion Darmschäden.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Zusätzlich zu den gesamten lebenden Bakterien kann der Überstand der Bakterienkultur verwendet werden, um die Wirkung der Darmbakterien zu testen19. - Zur Vorbereitung von E. coli OP50, Kultur E. coli OP50 in DYT medium (Tabelle 1) und dann ähnliche Schritte wie die oben beschriebenen anwenden, aber verringern Sie das Volumen auf ein Sechstel des ursprünglichen Volumens. Wenn das Anfangsvolumen z. B. 500 ml beträgt, beträgt das verbleibende Volumen nach dem Entfernen des Überstands etwa 83 ml.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
2. Vorbereitung von Enterococcus faecalis KCTC 3206 Kultur
- Bereiten Sie 500 ml sterilisierte Hirninfusion (BHI) Brühe(Tabelle 1).
- Eine Kolonie in 500 ml BHI-Brühe impfen und die Kultur für 14–15 h in einem Schüttelbrutor bei 37 °C und 150 U/min bebrüten.
- Gleichmäßig verteilen Sie die Bakterienkultur in zwei 500 ml Zentrifugenröhren und zentrifugieren Sie die Rohre bei 3.220 x g bei 4 °C für 30 min.
- Entfernen Sie den Überstand, bis das Volumen 50 ml (ein Zehntel des Anfangsvolumens) beträgt, und setzen Sie das Pellet wieder auf.
- Bewahren Sie die konzentrierte Bakterienkultur bei 4 °C bis zur Anwendung auf. Die frische Kultur ist besser, um die Auswirkungen auf die Darmdurchlässigkeit zu testen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
3. Herstellung von wärmeinaktivierten E. coli OP50 und wärmeinaktivierten P. aeruginosa PAO1 Kulturen
- Kultur und Ernte der Bakterien wie oben beschrieben (Schritte 1.1–1.3).
- Wärmeinaktivieren der E. coli OP50 oder P. aeruginosa PAO1 Kultur, wie zuvor beschrieben20,21,22. Zur Wärmeinaktivierung die resuspendierten Bakterien bei 65 °C (Wasserbad) 30 min inkubieren.
- Kühlen Sie die konzentrierte Bakterienkultur auf Raumtemperatur und lagern Sie sie bei 4 °C bis zum Gebrauch. Die Lagerdauer kann bis zu 1 Monat betragen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
4. Herstellung von Nematode Growth Medium (NGM) Platten zur Prüfung der Auswirkungen verschiedener Bakterien auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans
- 1,25 g Pepton, 1,5 g NaCl, 8,5 g Agar, einen Magnetrührer und 487,5 ml destilliertes Wasser in eine 500 ml Glasflasche geben (Tabelle 1).
- Mischen Sie die Mischung gut, autoklavieren Sie die Mischung für 15 min bei 121 °C und kühlen Sie die Mischung auf 55 °C in einem Wasserbad für 30 min.
- Entfernen Sie das Medium aus dem Wasserbad, fügen Sie die Komponenten (0,5 ml von 1 M CaCl2, 0,5 ml Cholesterin, 0,5 ml MgSO4, 12,5 ml KPO4) (Tabelle 1) zum NGM hinzu und mischen Sie sie gut.
HINWEIS: Alle Einzelkomponenten müssen autoklaviert sein, mit Ausnahme von Cholesterin (in absolutem Ethanol gelöst), und jeder Versuchsschritt muss auf einer sauberen Bank durchgeführt werden. - 20 ml NGM auf jede 90 x 15 mm Petrischale verteilen und den Agar auf einer sauberen Bank bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) erstarren lassen. Die NGM-Platten können bis zu einem Monat bei 4 °C gelagert werden.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Die NGM-Platten, die für die FITC-dextran-Färbung verwendet werden, wurden nach demselben Verfahren hergestellt (von den Schritten 4.1–4.3). 10 ml NGM wurden auf jede 60 x 15 mm Petrischale verteilt und auf einer sauberen Bank bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) erstarren lassen. - Entfernen Sie die Bakterienkultur aus dem 4 °C Kühlschrank und wirbeln Sie die Kultur gründlich aus, bevor Sie die Kultur auf die NGM-Platten verteilen.
- Fügen Sie jeder frischen NGM-Platte insgesamt 800 l der Bakterienkultur hinzu und lassen Sie die Platten über Nacht in einem 20 °C-Inkubator trocknen.
HINWEIS: Für das erste Experiment (Abbildung 1)wurden zwei NGM-Platten mit E. coli OP50, eine NGM-Platte mit P. aeruginosa PAO1 und eine NGM-Platte mit E. faecalis KCTC3206 hergestellt. Für das zweite Experiment (Abbildung 2) wurden zwei NGM-Platten mit lebendem E. coli OP50, eine NGM-Platte mit Lebend P. aeruginosa PAO1 und eine NGM-Platte mit wärmeinaktiviertem P. aeruginosa PAO1 hergestellt.
5. Herstellung von NGM-Platten zur Prüfung der Auswirkungen einer Chemikalie (DIM) auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans Fed mit P. aeruginosa
- 0,5 g Pepton, 0,6 g NaCl, 195 ml destilliertes Wasser, einen Magnetrührer und 6,8 g Agar zu einer 500 ml Glasflasche (NGM-Agar) geben.
- 0,5 g Pepton, 0,6 g NaCl, 195 ml destilliertes Wasser und einen Magnetrührer ohne Agar zu einer weiteren 500 ml Glasflasche (NGM-Brühe) geben.
- Autoklavieren Sie die beiden Flaschen (von den Schritten 5.1–5.2), eine leere 100 ml Glasflasche und eine leere 500 ml Glasflasche für 15 min bei 121 °C. Dann lassen Sie das Medium mit Flaschen im Wasserbad 30 min auf 55 °C abkühlen. Bewahren Sie das Agarmedium im Wasserbad auf und entfernen Sie die mit Brühe (ab Schritt 5.2) enthaltende Flasche für den nächsten Schritt.
- Fügen Sie die Zusatzchemikalien in die NGM-Brühe: 0,4 ml von 1 M CaCl2, 0,4 ml Cholesterin in Ethanol (ml), 0,4 ml von 1 M MgSO4 und 10 ml von 1 M KPO4 hinzu (alle diese Komponenten müssen außer dem Cholesterin in Ethanol sterilisiert werden). Anschließend die Mischung bei 55 °C mit einem Magnetrührer gründlich rühren.
- Beschriften Sie die autoklavierte leere 500 ml Glasflasche mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und die autoklavierte leere 100 ml Glasflasche mit DIM.
- 50 ml NGM-Brühe in die DIM-etikettierte 100 ml Flasche geben. 500 l dIM 20 mM DIM-Lager in die Flasche geben und gut vermischen.
HINWEIS: DIM wird in DMSO (20 mM DIM-Lager) aufgelöst. - Das NGM-Agarmedium schnell aus dem Wasserbad nehmen, 50 ml des NGM Agarmediums in die DIM-markierte Flasche geben und gründlich vermischen.
- Legen Sie eine 20 ml Aliquot DIM-haltigen NGM-Medium in jede 90 mm x 15 mm Petrischale. Aus diesem Schritt können etwa fünf DIM-haltige NGM-Platten hergestellt werden.
HINWEIS: Die Endkonzentration von DIM in jeder NGM-Platte beträgt 100 m. - Zur Herstellung des DMSO-haltigen NGM-Tellers 150 ml NGM-Brühe in die DMSO-etikettierte 500 ml-Flasche geben. 1,5 ml DMSO in die Flasche geben und gut vermischen.
- 150 ml des NGM Agarmediums in die DMSO-etikettierte Flasche geben und gründlich vermischen.
- Legen Sie ein 20 ml Aliquot DMSO-haltiges NGM-Medium in jede 90 mm x 15 mm Petrischale. Aus diesem Schritt können etwa fünfzehn DMSO-haltige NGM-Platten hergestellt werden.
HINWEIS: Die Endkonzentration von DMSO in jeder NGM-Platte beträgt 0,5%. - Erstarren Sie die Platten bei Raumtemperatur mindestens 3 h und lagern Sie sie bei 4 °C bis zum Gebrauch.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Entfernen Sie die E. coli OP50 oder P. aeruginosa PAO1-Kultur aus dem 4 °C-Kühlschrank (ab Schritt 1.4) und wirbeln Sie die Kultur richtig aus, bevor Sie sich auf die NGM-Platten ausbreiten.
- 800 L der E. coli OP50 oder P. aeruginosa PAO1-Bakterienkultur auf jede frische NGM-Agarplatte geben und die Platten über Nacht in einem 20 °C-Inkubator trocknen lassen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Für das dritte Experiment (Abbildung 3) wurden zwei DMSO-haltige NGM-Platten mit lebendem E. coli OP50, eine DMSO-haltige NGM-Platte, die mit lebendem P. aeruginosa PAO1 beschichtet ist, und eine DIM-haltige NGM-Platte mit lebendem P. aeruginosa PAO1 hergestellt.
6. Vorbereitung alterssynchronisierter C. elegans
- Würmer auf einer festen NGM-Platte anbauen und mit E. coli OP50 füttern, bis die gewünschte Population erreicht ist.
- Synchronisieren Sie die Eier entweder mit der zeitgezeitium festgelegten Eiablagemethode oder der Bleichlösungsbehandlung, wie zuvor beschrieben20,23,24.
7. Behandlung von Bakterien oder DIM und FITC-Dextran Fütterung
- Die alterssynchronisierten Eier bei 20 °C für 64 h auf NGM-Platten, ergänzt mit lebendem E. coli OP50, als Nahrung inkubieren.
- Waschen Sie die alterssynchronisierte L4-Larve mit S-Puffer und übertragen Sie sie (mehr als ca. 500 Würmer) auf die Behandlung von NGM-Platten, die verschiedene Bakterien und Chemikalien enthalten (siehe ANMERKUNG nach Schritt 4.6 und 5.14,). Inkubieren Sie sie bei 20 °C für 48 h.
HINWEIS: Die Behandlungszeit kann von 24 bis 72 h, je nach den verwendeten Bakterien und Chemikalien. Die therapeutische oder präventive Wirkung von DIM kann auch bewertet werden, indem die Würmer mit Krankheitserregern vorbehandelt und dann die Würmer mit DIM (die therapeutische Wirkung) behandelt oder die Würmer mit DIM vorbehandelt und dann mit Krankheitserregern behandelt werden (die präventive Wirkung)19. - Zur Herstellung der FITC-dextran-ergänzten Platten 2 ml wärmeinaktivierte E. coli OP50 mit 4 mg FITC-Dextran mischen. Dann 100 l des Gemischs FITC-dextran und E. coli OP50 in zwanzig frische NGM-Agarplatten (60 mm x 15 mm) aufteilen und die Platten auf einer sauberen Bank 1 h trocknen lassen.
HINWEIS: Die Endkonzentration von FITC-Dextran in jeder NGM-Platte beträgt 20 g/ml. - Bereiten Sie fünf E. coli OP50-haltige NGM-Platten ohne FITC-Dextran für die Fahrzeugsteuerungsbehandlung vor. Zu diesem Zweck 100 l wärmeaktivierte E. coli OP50 auf jede frische NGM Agarplatten (60 mm x 15 mm) aufteilen und die Platten auf einer sauberen Bank 1 h trocknen lassen.
HINWEIS: Für jedes unabhängige Experiment werden 15 FITC-dextran-ergänzte NGM-Platten und fünf NGM-Platten ohne FITC-Dextran benötigt. - Nach 48 h Behandlung (ab Schritt 7.2) die Würmer mit S-Puffer waschen, die Würmer ohne FITC-Dextran auf die FITC-dextran-ergänzten Platten und die NGM-Platten übertragen und die Platten über Nacht (14-15 h) inkubieren.
HINWEIS: Für jede Behandlungsgruppe sind 5 Nachbildungen der FITC-Dextran-Färbung (oder Fahrzeugsteuerungszuführung) erforderlich. - Waschen Sie die Würmer mit S-Puffer und lassen Sie sie in der frischen NGM AgarPlatte für 1 h kriechen.
HINWEIS: Für jedes unabhängige Experiment werden insgesamt 20 frische NGM-Platten benötigt. In diesem Schritt können Sie die NGM-Platte ohne oder mit E. coli OP50 ergänzen. - Fügen Sie jedem Brunnen einer schwarzen 96-Well-Flachbodenplatte 50 l 4% Formaldehydlösung hinzu. Übertragen Sie etwa 50 Würmer von jeder NGM-Platte in jeden Brunnen für Fluoreszenzmessungen. Nach 1 bis 2 min, gründlich entfernen Sie das gesamte Formaldehyd aus jedem Brunnen und fügen Sie 100 l Montagemedium, um die Brunnen zu beschichten.
HINWEIS: Formaldehydlösung (4%) wird verwendet, um die Würmer zu immobilisieren und zu fixieren. Für jede Behandlungsgruppe werden 5 Brunnen (5 Replikationen) für die Bildanalyse verwendet.
8. Bildgebung C. elegans mit dem Operetten-Bildgebungssystem und Bestimmung der Darmdurchlässigkeit durch Messung der FITC-dextran Fluoreszenzaufnahme
HINWEIS: Die fluoreszierende Stereomikroskopie kann anstelle des Operettensystems für die Bildanalyse verwendet werden.
- Erfassen Sie Fluoreszenzbilder und messen Sie die Fluoreszenzintensität mit dem Opetta High-Content Imaging System und analysieren Sie die Bilder mit der Harmony-Software.
- Drücken Sie in der Harmony-Software das Symbol Deckel öffnen, um den Deckel zu öffnen und die Platte in die Maschine zu legen.
- Richten Sie die Parameter ein.
- Klicken Sie auf Einrichten, wählen Sie den Plattentyp (96-well corning flat-bottom) und fügen Sie die Kanäle (Hellfeld- und EGFP-Kanäle) hinzu.
- Passen Sie das Layout an. Wechseln Sie zur Layoutauswahl, und wählen Sie dann Spur und passen Sie die Parameter an (erstes Bild bei 1 m, Anzahl der Ebenen sind 10, Abstand 1 m).
- Wählen Sie eine der Behandlungsbrunnen und ein Aufnahmefeld aus, und drücken Sie Test, um zu überprüfen, ob die Bilder im Abschnitt Ausführen von Experimenten zufriedenstellend sind.
- Wenn die Bilder zufriedenstellend sind, kehren Sie zum Abschnitt Einrichten zurück, und drücken Sie das Symbol Zurücksetzen am Ende des Bildschirms. Wählen Sie dann alle Zielbrunnen und eine geeignete Anzahl von Erfassungsfeldern aus.
- Gehen Sie erneut zu Experiment ausführen und geben Sie den Plattennamen ein, und drücken Sie dann Start, um mit der Verarbeitung zu beginnen.
- Um die Intensität der Fluoreszenz zu messen, gehen Sie zum Abschnitt Bildanalyse und geben Sie das Bild ein. Finden Sie die Zelle, indem Sie den EGFP-Kanal und die Methode B wählen. Passen Sie den gemeinsamen Schwellenwert auf 0,5, Fläche auf >200 m2,Split-Faktor auf 3,0, einzelbelagigen Schwellenwert auf 0,18 und Kontrast zu mehr als 0,18 an. Berechnen Sie dann die Intensitätseigenschaften, und wählen Sie den Mittelwert als Ausgabe aus. Drücken Sie das Symbol Anwenden, um das Setup zu speichern.
- Wechseln Sie zum Abschnitt Auswertung, um die Intensität zu messen, indem Sie eine Heatmap- und Datentabelle abrufen. Legen Sie den Parameter Auslesewert auf Zellen – Intensitätszelle EGFP-Mittelwert – Mittelwert pro Brunnen fest, und starten Sie die Auswertung.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Um die Daten aus der Operette zu extrahieren, klicken Sie auf die Schaltfläche Einstellen und wählen Sie Datenverwaltung.
- Wählen Sie Archiv schreiben, und öffnen Sie dann den Durchsuchen, und wählen Sie die Datei aus.
- Um die Datei auszuwählen, klicken Sie auf das kleine + Signal in der linken Ecke, und klicken Sie dann auf Messen und wählen Sie Plattenname.
- Wählen Sie die Datei aus, und klicken Sie auf OK.
- Wählen Sie den Pfad zum Speichern der Datei aus, indem Sie auf das Suchsignal am aktiven Pfad klicken.
- Klicken Sie auf Start, um die Datendatei zu speichern.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
9. Statistische Analyse der FITC-dextran Fluoreszenz von C. elegans
- Importieren Sie die Daten und berechnen Sie den Mittelwert und die Standardabweichung (SD) mit einer Statistiksoftware.
- Analysieren Sie den signifikanten Unterschied bei der einwegigen Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest.
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Representative Results
Nach der Inkubation mit P. aeruginosa PAO1 zeigten C. elegans eine signifikante Zunahme der FITC-Dextran-Fluoreszenz im Wurmkörper im Vergleich zur fluoreszenz, die nach der Inkubation mit den beiden anderen Bakterienstämmen gezeigt wurde (Abbildung 1). Die Fluoreszenzintensitäten von Würmern, die mit E. coli OP50, P. aeruginosa PAO1 und E. faecalis KCTC3206 gefüttert wurden, betrugen 100,0 x 6,6, 369,7 x 38,9 bzw. 105,6 x 10,6 %. Die Daten betonen, dass P. aeruginosa mehr lebenswichtige Schäden an der epitheliale Darmbarriere verursachte, und daher zeigten die Würmer eine dramatische Zunahme ihrer Darmdurchlässigkeit. Basierend auf diesem Ergebnis kann FITC-Dextran leicht durch die Darmschicht eindringen, so dass P. aeruginosa als potenzieller Kandidaten-Erreger für das Screening der Auswirkungen von DIM ausgewählt wurde. Obwohl E. faecalis ein Darmpathogen ist, der extrazelluläres Superoxid und Wasserstoffperoxid produzieren kann, die Diekolonische Epithelzelle DNA15schädigen, ist E. faecalis in einigen Fällen auch als potenzielle sprobiotische Bakterien bekannt, da es möglich ist, Bakteriziine gegen einige Erreger zu produzieren25,26. Die Funktionen eines Probiotikums umfassen die Einhaltung epithelialer Oberflächen, Persistenz im menschlichen Magen-Darm-Trakt, Immunstimulation und antagonistische Aktivität gegen Darmerreger26. Daher blieb die Darmdurchlässigkeit von Würmern, die mit E. faecalis bebrütet wurden, im Vergleich zu denen der Fahrzeugkontrollwürmer unverändert. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Menge der Infektion durch die Erhöhung der Fluoreszenzintensität untersucht werden kann, und P. aeruginosa verursacht mehr Darmdurchlässigkeit als andere Stämme.
Abbildung 2 zeigt den Unterschied zwischen lebender und hitzeinaktivierter P. aeruginosa PAO1 basierend auf der Intensität der FITC-Dextran-Fluoreszenz im Wurmkörper. Sowohl die Fluoreszenzbilder als auch die statistischen Daten deuten darauf hin, dass der Erreger nach der Hitzeinaktivierung keine Toxizität für Nematoden auslösen konnte. P. aeruginosa kann Exotoxin A produzieren – ein starkes extrazelluläres Zytotoxin, das für viele Tiere tödlich ist27. Exotoxin A kann durch Erhitzen bei 45 °C bis 60 °C28schnell abgeschafft werden. Daher war die hitzeinaktivierte P. aeruginosa nicht in der Lage, die Durchlässigkeit der Darmepithelien der Würmer zu schädigen. Der Überstand der P. aeruginosa PAO1-Kultur hat die Darmdurchlässigkeit erheblich geschädigt, und daher kann der Kulturüberstand anstelle ganzer P. aeruginosa-Zellen verwendet werden, um Darmdurchlässigkeitsfunktionsstörungen zu induzieren19. Der Überstand enthält Endotoxine, Exotoxin A und Lipopolysaccharide29, und diese Komponenten sind dafür bekannt, Zelltoxizität30,31zu induzieren. Daher können diese Komponenten des Überstandes die Darmdurchlässigkeit beeinflussen, obwohl wir die direkte Wirkung von Exotoxinen und Lipopolysacchariden auf die Darmdurchlässigkeit bei C. elegansnicht überprüft haben.
Die DIM-Kobehandlung für 48 h verringerte die FITC-Dextran-Fluoreszenzintensität im Darm von Würmern im Vergleich zur P. aeruginosa Einzelbehandlung signifikant (Abbildung 3C,D). Statistische Analysen durch einseitige ANOVA und Tukeys Mehrfachvergleichstest zeigten, dass nach der Behandlung mit DIM die mittlere Fluoreszenzintensität im Vergleich zur Fluoreszenzintensität der Reinenbehandlung P. aeruginosasignifikant verringert wurde. Die Fluoreszenzintensitäten der mit P. aeruginosa-only und P. aeruginosa plus DIM behandelten Würmer betrugen 486,3 x 41,7 bzw. 414,2 x 25,0 %(Abbildung 3E). Basierend auf diesem Ergebnis, DIM kann als ein gutes natürliches Produkt zur Heilung Darmdurchlässigkeit Dysfunktion durch bakterielle Infektionen verursacht werden. Dieses Ergebnis deutete darauf hin, dass DIM Zellentzündungen in Darmzellen abmildern kann, was die Durchlässigkeit des Darms19reduziert. Dieses Ergebnis ähnelt den Ergebnissen eines Mausmodells, bei dem DIM eine signifikante Verringerung der Entzündung im Dickdarm32zeigte.
Abbildung 1: Die Auswirkungen verschiedener Bakterien auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans. Mikroskopiebilder der Würmer, einschließlich Hellfeld, FITC-Fluoreszenz (grüner Kanal) und zusammengeführte Bilder. Mikroskopiebilder von Würmern aus (A) E. coli OP50 ohne FITC-dextran Fütterung, (B) E. coli mit FITC-dextran Fütterung, (C) P. aeruginosa PAO1 mit FITC-dextran Fütterung, und (D) E. faecalis KCTC3206 mit FITC-dextran Fütterung. Skalenstange = 1 mm (weiß) und 200 m (schwarz). Alterssynchrone L4-Larven wurden für 48 h in NGM-Platten mit E. coli (A, B), P. aeruginosa (C) und E. faecalis (D) bebrütet. Anschließend wurden die Würmer auf Platten mit FITC-Dextran (B-D) übertragen, mit Ausnahme der Fahrzeugsteuerung (A). (E) Die FITC-Fluoreszenzintensität der verschiedenen bakteriellen Behandlungen. Ein höherer Prozentsatz der FITC-Fluoreszenz deutete auf eine höhere Darmdurchlässigkeit hin. Spalten und Fehlerbalken geben den Mittelwert sD an. ***P < 0,001 für signifikante Differenz von der Fahrzeugsteuerung. P < 0,001 für signifikante Nxen von den FITC-dextran behandelten Würmern, die mit P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5) gefüttert werden. Diese Grafik ist repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Auswirkungen von lebender und hitzeinaktivierter P. aeruginosa PAO1 auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans. Mikroskopiebilder von Würmern aus (A) lebender E. coli OP50 ohne FITC-dextran Fütterung, (B) lebende E. coli mit FITC-dextran Fütterung, (C) live P. aeruginosa PAO1 mit FITC-dextran Fütterung, und (D) hitzeaktiviertE P. aeruginosa mit FITC-dextran Fütterung. Skalenstange = 1 mm (weiß) und 200 m (schwarz). Alterssynchrone L4-Larven wurden für 48 h in NGM-Platten mit lebenden E. coli (A, B), live P. aeruginosa (C) und hitzeinaktivierten P. aeruginosa (D) bebrütet. Anschließend wurden die Würmer auf Platten mit FITC-Dextran (B-D) übertragen, mit Ausnahme der Fahrzeugsteuerung (A). (E) FITC-Fluoreszenzintensität zum Vergleich von lebender und hitzeinaktivierter P. aeruginosa PAO1. Spalten und Fehlerbalken geben den Mittelwert sD an. ***P < 0,001 und **P < 0,01 für signifikante Differenz ender Fahrzeugsteuerung. P < 0,001 für signifikante ndextranbehandelte Würmer, die mit lebendem P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5) gefüttert werden. Diese Grafik ist repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Wirkung von DIM auf die Darmdurchlässigkeit von C. elegans gefüttert P. aeruginosa. Mikroskopiebilder von Würmern aus (A) E. coli OP50 ohne FITC-dextran Fütterung, (B) E. coli mit FITC-dextran Fütterung, (C) P. aeruginosa PAO1 mit FITC-dextran Fütterung, und (D) P. aeruginosa und DIM (100 'M) Cotreatment mit FITC-dextran Fütterung. Skalenstange = 1 mm (weiß) und 200 m (schwarz). Alterssynchrone L4-Larven wurden für 48 h in NGM-Platten mit lebenden E. coli (A, B), live P. aeruginosa (C), live P. aeruginosa und DIM (D) bebrütet. Anschließend wurden die Würmer auf Platten mit FITC-Dextran (B-D) übertragen, mit Ausnahme der Fahrzeugsteuerung (A). (E) Die FITC-Fluoreszenzintensität zeigt an, dass die Darmdurchlässigkeit von C. elegans durch DIM beeinflusst wurde. Spalten und Fehlerbalken geben den Mittelwert sD an. ***P < 0,001 für signifikante Differenz von der Fahrzeugsteuerung. P< 0,001 und P < 0,01 für signifikanten Unterschied zu den FITC-dextran-behandelten Würmern, die mit P. aeruginosa PAO1 (ANOVA, n = 5) gefüttert werden. Diese Grafik ist repräsentativ für zwei unabhängige Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Durch die Verwendung dieser neuen Methode zur Bestimmung der Darmpermeabilität in C. elegans, die automatisierte Fluoreszenzmikroskopie und quantitative Bildanalyse kombiniert, können die Unterschiede, die durch Darmmikroorganismen oder Chemikalien verursacht werden, in vivo bestimmt werden, insbesondere im Darm von C. elegans. Dieses Protokoll ist nützlich für Darmdurchlässigkeitsuntersuchungen und gilt für viele Aufgaben, wie die Bestimmung der reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) unter Stressbedingungen und morphologische Untersuchungen aufgrund ihrer Bequemlichkeit und einfachen Manipulation. Darüber hinaus kann diese Methode verwendet werden, um die Wirkung von therapeutischen und präventiven Methoden gegen mehrere Krankheitserreger in C. elegans zu bestimmen. Insbesondere kann es ein effizientes Protokoll sein, um die Mechanismen verschiedener Bakterienstämme zu untersuchen, einschließlich schädlicher und nützlicher Bakterien. Einige Krankheitserreger und probiotische Bakterien mit ähnlichen Strukturen üben unterschiedliche Auswirkungen auf den Wirt33,34. Dieses Verfahren kann bei der Bewertung helfen, welchen Mechanismus die Bakterien nutzen und wo die zielgerichteten Substrate extrazellulär oder intrazellulär abgesondert werden können. Darüber hinaus kann diese Methode auch dazu beitragen, die Hypothese zu stärken, dass wärmebehandlung eine wichtige Rolle bei der Inaktivierung von Krankheitserregern spielt.
Allerdings gibt es auch einige Schwierigkeiten während dieses Verfahrens. Erstens ist die Anzahl der Würmer in jeder Platte wichtig für statistisch aussagekräftige Ergebnisse und eine robuste Wurmerkennung, sodass 70–90 % Konfluenz (mindestens 50 Würmer pro Bohrloch) empfohlen werden. Dementsprechend sollten Versuchsversuche durchgeführt werden, um geeignete Würmer zu erhalten. Zweitens sind die Platteneigenschaften einer der wichtigen Faktoren, die die Bildqualität und die Intensitätsbestimmung beeinflussen, insbesondere für das Bodenmaterial. In einigen fortgeschrittenen Experimenten ist ein Glasboden aufgrund seiner hervorragenden optischen Qualität die beste Option für die Messung der Fluoreszenz. Aufgrund des hohen Preises wird jedoch oft ein Polystyrolboden verwendet, obwohl die Qualität nicht so hoch ist wie die des Glasbodens. Schließlich müssen die Plattenbeschichtungsverfahren für C. elegans optimiert werden. In diesem Experiment wurde ein fluoreszierendes Montagemedium angewendet, weil es die Kennzeichnung von Gewebeabschnitten erhalten und verbessern kann, aber es ist nicht in der Lage, die Würmer auf dem Plattenboden richtig zu fixieren.
Dieses Protokoll hat Einschränkungen. Da C. elegans ein Nematode ist, sollten weitere Experimente, wie die Auswertung in menschlichen Darmzellmonolayern und bei Säugetieren, durchgeführt werden. Bei dieser Methode wurden die phänotypischen Veränderungen in C. elegans gefütterten pathogenen Bakterien und Chemikalien bestimmt. Daher sollten die molekularen und genetischen Mechanismen, die der pathogenen oder probiotischen Wirkung von Darmbakterien sowie der therapeutischen Wirkung von Chemikalien zugrunde liegen, weiter aufgeklärt werden. Spezifische Signalwege, die durch pathogene bakterielle Infektionen und therapeutische Wirkungen von Chemikalien ausgeübt werden, können sowohl mit verschiedenen mutierten Bakterien als auch mit mutierten Würmern bewertet werden. Darüber hinaus wären weitere eingehende Studien zur Identifizierung der chemischen Komponenten, die für die pathogenen und probiotischen Wirkungen von Darmbakterien verantwortlich sind, von Vorteil.
Hier berichten wir über ein experimentelles Protokoll zur Messung der Darmdurchlässigkeit bei C. elegans, die mit verschiedenen Bakterien und Chemikalien behandelt werden, indem wir FITC-dextran-Fütterung verwenden. Wir glauben, dass diese Protokolle für die biologische Grundlagenforschung hilfreich sein werden, wie die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen der Darmbiota und Darmgesundheit, sowie für die Entwicklung von Probiotika und Nutraceuticals für die Prävention und Behandlung von Darmgesundheitsproblemen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von einem Intramural Research Grant des Korea Institute of Science and Technology (2E29563) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3’-diindolylmethane | Sigma | D9568 | |
| 90×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| 60×15 mm Petri dishes | SPL Life Sciences, South Korea | 10060 | |
| Bactor Agar | Beckton Dickinson | REF. 214010 | |
| Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | REF. 237500 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma | C3045 | |
| Costa Assay Plate, 96 Well Black With Clear Flat Bottom Non-treated, No Lid Polystyrene | Corning Incorporated | REF. 3631 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Enterococcus faecalis KCTC 3206 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 3206 | Falcutative anaerobic |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescein isothiocyanate - dextran | Sigma | FD10S | |
| Harmony software | PerkinElmer | verson 3.5 | |
| Luria-Bertani LB medium | Merck | VM743185 626 1.10285.5000 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Bioreagents | BP2213-1 | |
| Fluoromount aqueous mounting medium | Sigma | F4680 | |
| Operetta CLS High-Content Analysis System | PerkinElmer | HH16000000 | |
| Peptone | Merck | EMD 1.07213.1000 | |
| Pseudomonas aeruginosa PA01 | Korean Collection for Type Culture | KCTC NO. 1637 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagents | BP358-1 | |
| Stereo Microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | REF. 212750 |
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