Summary
Weefsel complexiteiten van multicellulaire systemen Verwar de identificatie van causaal verband tussen extracellulaire cues en individuele cellulaire gedragingen. Hier presenteren we een methode om de directe link tussen contact afhankelijke signalen en delings assen te bestuderen met behulp van C. elegans embryo blastomeres en zelfklevende polystyreen kralen.
Abstract
In multicellulaire systemen worden individuele cellen omringd door de verschillende fysische en chemische signalen die afkomstig zijn van naburige cellen en het milieu. Deze weefsel complexiteit constideert de identificatie van causaal verband tussen extrinsieke signalen en cellulaire dynamiek. Een synthetisch gereconstitueerd multicellulair systeem overkomt dit probleem door onderzoekers in staat te stellen voor een specifieke Cue te testen terwijl ze anderen elimineren. Hier presenteren we een methode om celcontactpatronen te reconstitueren met geïsoleerde Caenorhabditis elegans blastomere en zelfklevende polystyreen kralen. De procedures betreffen het verwijderen van eierschalen, het isoleren van blastomere door het verstoren van de celcelhechting, de bereiding van zelfklevende polystyreen kralen en de reconstitutie van celcel-of celkraal contact. Tot slot presenteren we de toepassing van deze methode om de oriëntatie van cellulaire delings assen te onderzoeken die bijdraagt aan de regulering van ruimtelijke cellulaire patronen en specificatie van het lot van cellen bij de ontwikkeling van embryo's. Deze robuuste, reproduceerbare en veelzijdige in vitro-methode maakt de studie mogelijk van directe relaties tussen ruimtelijke celcontactpatronen en cellulaire reacties.
Introduction
Tijdens multicellulaire ontwikkeling worden het cellulaire gedrag (bv. delings as) van individuele cellen gespecificeerd door verschillende chemische en fysieke aanwijzingen. Om te begrijpen hoe individuele cellen deze informatie interpreteert, en hoe ze de multicellulaire assemblage reguleren als een emergente eigenschap is een van de ultieme doelen van morfogenese studies. Het modelorganisme C. elegans heeft aanzienlijk bijgedragen tot het begrijpen van de cellulaire regulering van de morfogenese zoals cel polariteit1, Cell Division patronen1, cel Fate decision2, en weefsel schaal verordeningen zoals neuronale bedrading3 en organogenese4,5. Hoewel er verschillende genetische hulpmiddelen beschikbaar zijn, zijn weefsel engineering methoden beperkt.
De meest succesvolle weefseltechnische methode in C. elegans Study is de klassieke blastomere Isolation6; Als C. elegans embryo is omgeven door een eierschaal en een permeabiliteit barrière7, hun verwijdering is een van de belangrijkste procedures van deze methode. Hoewel deze blastomere-isolatiemethode het oplossen van celcelcontact op een vereenvoudigde manier mogelijk maakt, staat het niet toe dat ongewenste signalen worden weggenomen; celcontact vormt nog steeds zowel mechanisch (bijv. adhesie) als chemische aanwijzingen, waardoor ons vermogen om het oorzakelijke verband tussen de Cue en het cellulaire gedrag volledig te analyseren, wordt beperkt.
De in dit artikel gepresenteerde methode maakt gebruik van carboxylaat gemodificeerde polystyreen parels die covaltig kunnen binden aan elke amine-reactieve moleculen, waaronder eiwitten als liganden. Met name gebruikten we een amine-reactieve vorm van Rhodamine Red-X als een ligand om kralen zowel visueel traceerbaar en lijm aan de cel te maken. De carboxylgroepen van kraal oppervlak en primaire amine groepen van ligand molecuul worden gekoppeld door in water oplosbare Carbodiimide 1-ethyl-3-(Dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDAC)8,9. Verkregen zelfklevende kralen zorgen voor de effecten van de mechanische Cue op cellulaire Dynamics10. We hebben deze techniek gebruikt om mechanische aanwijzingen te identificeren die nodig zijn voor de oriëntatie van de celdeling10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. bereiding van zelfklevende polystyreen kraal
Opmerking: dit protocol vereist geen aseptische techniek.
- Weeg 10 mg carboxylaat gemodificeerde polystyreen kralen af in een micro centrifugebuis van 1,5 mL.
- Om de kralen te wassen, voeg 1 mL 2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur (MES) buffer toe aan de buis. Aangezien MES buffer geen fosfaat en acetaat bevat, wat de reactiviteit van Carbodiimide kan verminderen, is het geschikt om te gebruiken bij eiwit koppelingsreactie. Vortex de buis om de kralen te mengen.
- Draai de buis voor 60 s bij 2.000 x g via een tafel centrifuge.
- Gooi het supernatant weg door de buffer voorzichtig te pipetteren.
- Was de kralen opnieuw met 1 mL MES-buffer door stappen 1.2-1.4 te volgen.
- Voeg 1 mL MES buffer met 10 mg EDAC in de buis om de oppervlakte carboxylgroepen te activeren. Vortex de buis om de kralen te mengen.
- Draai en inbroed de buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Spin de kralen voor 60 s op 2.000 x g.
- Gooi het supernatant weg door de buffer voorzichtig te pipetteren.
- Om de kralen te wassen, voeg 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de buis. Vortex de buis om de kralen te mengen.
- Spin de buis voor 60 s op 2.000 x g.
- Gooi het supernatant weg door de buffer voorzichtig te pipetteren.
- Was de kralen opnieuw met 1 mL PBS met de volgende stappen 1.10-1.12.
- De uiteindelijke concentratie van Rhodamine zal afhangen van de stam die wordt imaged. Bereid 1 mL 1-, 10-, 100-en 1000-voudige verdunningsreeks van Rhodamine Red-X van de 0,65 mM Rhodamine Red-X stockoplossing.
- Pipetteer 20 μL kralen in elke seriële verdunnings buis.
- Roteer en inbroed de buis gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was de parels tweemaal met 1 mL PBS door de stappen 1.10-1.12 te herhalen.
- Voeg 1 mL PBS toe aan de buis en bewaar deze bij 4 °C gedurende maximaal 6 weken. Controleer de intensiteit van de fluorescentie van de parels onder een microscoop die wordt gebruikt voor Live-beeldvorming. De juiste concentratie van de Rhodamine Red-X succinimidyl Ester is afhankelijk van de beeldvormings condities (Figuur 1).
Opmerking: kralen zonder Rhodamine Red-X behandeling niet aan de cel hechten. Rhodamine Red-X fungeert als fluorescentie marker en lijm molecuul. De electro statische interactie tussen positief opgeladen Rhodamine Red-X en negatief geladen plasma membraan is een putende oorzaak van hechting.
2. montage van de mond pipet
- Snijbreedte (6,35 mm binnendiameter) en smalle (3,175 mm binnendiameter) Tygon buizen tot ongeveer 25 cm en 40 cm lang, respectievelijk (Figuur 2).
- Verbind de Tygon buizen met een polytetrafluorethyleen (PTFE) filter (poriegrootte 0,2 μm) (Figuur 2).
- Demonteer een in de handel verkrijgbare aspirator buis en bevestig de capillaire houder en het mondstuk aan het uiteinde van respectievelijk de smalle en brede Tygon buizen (Figuur 2).
Opmerking: PTFE-filter werd gebruikt om inademing van dampen van hypochloriet oplossing via de mond pipet te voorkomen.
3. isolatie van de embryo blastomere
Let op: Draag handschoenen en een Labcoat om te voorkomen dat u snijdt en contact met de bleek oplossing.
- Houd elk uiteinde van een micro capillair (capaciteit; 10 μL) met de rechter-en linkerhand vast.
- Trek de microcapillair naar beide uiteinden om spanning toe te passen en breng het midden van het capillair over een brander om twee met de hand getrokken capillairen te maken (Figuur 3a).
- Trim de uiteinden van de met de hand getrokken capillairen met een tang onder de Ontkoppel Microscoop en bevestig het getrokken capillair in een mondpipetteer apparaat (Figuur 2). Bereid twee soorten pipetten voor. De openingsmaten van de pipetpunt voor de pipetten moeten ongeveer 2x zijn en 1x de korte Aslengte van C. elegans embryo's (30 μm) voor de embryo overdracht en verwijdering van de eierschaal, respectievelijk Figuur 3B-D).
- Pipetteer 45 μL eizout oplossing op een put van een multi well-glijbaan (Figuur 4a; bodem).
- Plaats 5-10 volwassen C. elegans op een goed met ei zoutoplossing.
- Om vroege C. elegans embryo's te verkrijgen, snijd je volwassenen in stukken door twee naalden rechts en links van C. elegans body te positioneren en de naalden langs elkaar te schuiven (Figuur 4A; bovenste schema's).
- Pipetteer 45 μL van de hypochloriet oplossing op een put naast de waterhoudende oplossing met Eier zout (Figuur 4B).
- Pipetteer 45 μL van het groeimedium van Shelton op de volgende drie putjes naast de goed bevattende hypochloriet oplossing (Figuur 4B).
- Breng 1-cel-en vroege 2-celfase embryo's over in de hypochloriet oplossing door middel van het pipetteren met het hand getekende capillair voor de overdracht van embryo's (Figuur 4B).
- Wacht 40 – 55 s.
- Was de embryo's door de embryo's over te brengen van de hypochloriet oplossing naar het groeimedium van Shelton door de mond te pipetteren met het hand getekende capillair voor embryo-overdracht (Figuur 4B).
- Was de embryo's opnieuw door de embryo's over te brengen in een nieuwe put van het groeimedium van Shelton door het pipetteren met het met de hand getekende capillair voor embryo-overdracht (Figuur 4B).
- Breng de gewassen embryo's over in een nieuwe put van het groeimedium van Shelton door de mond pipetteren met de hand getekende capillair voor embryo overdracht. Gebruik de hand getekende capillair voor het verwijderen van de eierschaal en herhaal voorzichtig het pipetteren (Figuur 4C; middelste schema's). Als de eierschaal met succes wordt verwijderd, zullen de embryonale cellen bolvormig worden (Figuur 4C; rechts).
- De 2-cel fase embryonale blastomeres scheiden door zachtjes en continu pipetteren met de hand getekende capillair voor het verwijderen van de eierschaal (Figuur 4D).
4. reconstitutie van contact patronen met blastomere en kraal
Opmerking: werk onder de beeldvormings Microscoop om dissociatie van een cel van een kraal te voorkomen en om de tijdige beeld verwerving te vergemakkelijken.
- Om een omgekeerde Microscoop te observeren, bereidt u een beeldvormings kamer voor zoals in Figuur 5.
- Plaats een dekslip op een afdek houder (Figuur 5a).
- Plak de randen van de Afdeklijst om deze te stabiliseren. De zijkant met tape is de ' achter'-zijde (Figuur 5A, B).
- Draai de afdek houder naar de voorste zijde en teken een cirkel op de Afdeklijst met een hydrofobe pen (Figuur 5C).
Let op: elk glasbodem gerecht werkt ook, op voorwaarde dat de embryo's gemanipuleerd kunnen worden door de mond pipet.
- Voeg het groeimedium van Shelton toe binnen de cirkel getekend door de hydrofobe marker (Figuur 5D).
- Breng de geïsoleerde blastomere over naar de Imaging kamer.
- Verdeel een klein volume van de chemisch Gefunctionaliseerde parels met behulp van de hand getekende capillair voor embryo overdracht.
- Bedien de positie van de polystyreen kralen door in de hand getekende capillair te blazen totdat de kraal aan de geïsoleerde blastomere hecht.
- Monteer een dekslip om de verdamping van het medium te voorkomen (Figuur 5E). Voer Live Imaging uit.
5. bereiding van belangrijke reagentia
- Eier zoutoplossing (10 mL): Combineer 235 μL van 5 M NaCl en 240 μL van 2 M KCl met 9525 μL dH2O.
- Hypochloriet oplossing (10 mL): Combineer 7,5 mL Clorox (bevattende ongeveer 7,5% natriumhypochloriet) met 2,5 mL 10 N NaOH (uiteindelijke concentratie van natriumhypochloriet is ongeveer 5,625%).
Opmerking: Hoewel veel gepubliceerde methoden Chitinase hebben gebruikt om chitineuze eierschalen te verteren, hebben we een methode aangenomen met behulp van hypochloriet oplossing11. Door de batch-to-batch variaties van Chitinase activiteiten te vermijden, geloven we dat deze methode reproduceerbaar en kosteneffectiever is. - 0,81 mM inuline oplossing (40 mL)
- Voeg 0,2 g inuline toe aan 40 mL dH2O.
- Autoclaaf om op te lossen.
Opmerking: houdt 1 maand bij 4 °C.
- 0,5 M MES-buffer (500 mL)
- Los 48,81 g MES op in 400 mL gedistilleerd water (dH2O).
- Stel de pH in op 6,0.
- Breng het totale volume naar 500 mL met dH2O.
- PBS-oplossing (1 L)
- Als u 10-voudige PBS-oplossing wilt maken, lost u 1 pakket PBS premix Powder op in 1 L dH2O.
- Combineer 100 mL 10-voudige PBS-oplossing met 900 mL dH2O.
- 5% Polyvinylpyrrolidon (PVP) oplossing (4 mL)
- Los onder steriele omstandigheden 0,2 g PVP op in 4 mL Drosophila Schneider-medium.
Opmerking: open altijd de medium Stock in weefselkweek (TC) van Schneider. Bewaar gedurende 1 maand bij 4 °C.
- Los onder steriele omstandigheden 0,2 g PVP op in 4 mL Drosophila Schneider-medium.
- 0,65 mM Rhodamine Red-X stockoplossing (2 mL)
- Weeg 1 mg Rhodamine rood-X af.
- Voeg 2 mL dimethylsulfoxide (DMSO) toe om op te lossen.
- Aliquot en bewaren bij-20 °C.
- Shelton's groei medium (SGM) (10,25 mL)
- Combineer onder steriele omstandigheden 8 mL Drosophila Schneider medium, 1 mL PVP-oplossing, 1 mL inuline oplossing, 1 mL basale medium Eagle (BME) vitaminen, 50 μL Penicillaire-streptomycine, en 100 μL lipide concentraat samen.
- Aliquot 325 μL SGM in 1,5 mL microbuisjes.
Opmerking: Houd voor ongeveer 1 maand bij 4 °C. - Voeg op de dag van de blastomere isolatie 175 μL foetaal runderserum (FBS) toe aan de SGM (voor een totaal volume van 500 μL).
Opmerking: Sla FBS bij-20 °C op en dooi het voor gebruik. FBS hoeft geen warmte te worden gedood.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor de bereiding van kralen, bepaalden we de optimale hoeveelheid Rhodamine Red-X succinimidyl Ester voor de transgene stam die GFP-myosin II en mCherry-histone uitdrukken (Figuur 1A-D). We gebruikten mcherry Tagged Histon als een marker van de celcyclus progressie. Omdat zowel Rhodamine Red-x en mcherry zal worden verlicht door een 561 nm laser, de optimale intensiteit van Rhodamine Red-x signaal is vergelijkbaar met die van Histon om gelijktijdige beeldvorming van cel en kraal toe te staan. Bijvoorbeeld, het fluorescentie signaal van de kraal behandeld met 0,005 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl Ester was te zwak om de kraal te visualiseren (Figuur 1A). Aan de andere kant was het fluorescentie signaal van de kralen behandeld met 5 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl ester te sterk voorbeeld mCherry-histone (Figuur 1D). We bepaalden dat 0,5 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl Ester optimaal is voor deze specifieke transgene stam (Figuur 1C).
De blastomere isolatie werd uitgevoerd volgens de in Figuur 4getoonde procedures. De volgende punten moeten worden aangepakt voor geslaagde experimenten. 1) de media in de put verdampt na verloop van tijd en wordt viscous; Dit zorgt ervoor dat de embryo's vasthouden aan het glas capillair en andere embryo's, dus een nieuwe put met verse media moet worden gebruikt. 2) in de hypochloriet oplossing zweven embryo's naar het oppervlak. Verlaag daarom de vergroting van de Microscoop en concentreer u op het oppervlak van de druppel om te verlichten met de overdracht van embryo's. 3) de effectiviteit van hypochloriet oplossing kan afwijken. Daarom moet de duur van de embryo's in de hypochloriet oplossing worden getest voor elke nieuwe partij hypochloriet oplossing die wordt gemaakt. 4) plaats de pipet zo dicht mogelijk bij het embryo om de sterkte te minimaliseren die wordt gebruikt om in de pipet te blazen, maar ook niet te dicht zodat het embryo ook wordt opgezogen (dit geldt eveneens bij het aanbrengen van kralen). 5) na het verwijderen van de eierschaal worden de embryo's zeer delicaat. Daarom moeten de krachten die op de pipet worden uitgeoefend licht worden verlaagd om te voorkomen dat embryo's barsten. 6) langdurig gebruik van de mond pipet kan het PTFE-filter dempen, en 7) 2-cel-fase embryo's mogen alleen worden gescheiden wanneer de Nucleus duidelijk is gevormd (Figuur 4C, linker schematische). In vergelijking met cellen in intacte embryo's (Figuur 4A; rechts), cellen in embryo's zonder eierschaal look ronder (Figuur 4C; rechts). Bovendien, na blastomere isolatie, wordt de vorm van blastomeres bolvormig (Figuur 4D; rechts).
Om de effecten van fysieke contact afhankelijke Cue te testen op de oriëntatie van de celdeling, hebben we Rhodamine rood-X gecoate kralen toegevoegd aan AB blastomeres geïsoleerd van de 2-cel fase en uitgevoerd live-Imaging (Figuur 6, Figuur 7). De kraal zonder Rhodamine Red-X behandeling niet hechten aan de blastomeres, wat suggereert dat de Rhodamine Red-X fungeert als een zowel fluorescentie marker en lijm molecuul. Voor de analyse van de oriëntatie van de celdeling hebben we 3D de timelapse-afbeelding gereconstrueerd met behulp van de functie "3D-project" van ImageJ12 (Figuur 6A; kantelen rond Y-as). Om het vlak met mitotische spil (spil vlak) te bepalen, identificeerden we eerst een vlak waar twee nucleotiderende verticaal werden uitgelijnd (Figuur 6b; 110 °): het vlak met een hoek van ± 90 ° van dit vlak is spil vlak (Figuur 6b;-20 °). Vervolgens hebben we de hoek van de spil gemeten (spil oriëntatie) ten opzichte van de cel-kraal contact interface (contact oriëntatie) na cytokinese (Figuur 6C). Wanneer beide dochtercellen aan de kraal zijn gekoppeld, is een regel die beide contact sites passeert, gebruikt als een contact oriëntatie.
In onze vorige studie, we hebben geïdentificeerd een anisotropisch celoppervlak myosin flow tijdens de kraal-geïnduceerde AB Cell Division oriëntatie10. Het is echter moeilijk om de intracellulaire myosine flow te meten als cel beweegt tijdens oriented Division. Om dit uit te voeren, hebben we eerst de samples geselecteerd met spil uitgelijnd op het Imaging Plane (xy-vlak) (Figuur 7). Ten tweede werden Z-stacks geprojecteerd met behulp van een maximale projectie methode (Figuur 7). Ten derde werden celbewegingen gecorrigeerd met behulp van de subpixel registratie algoritme stack reg plug-in13 van imagej met stijve Body optie (Figuur 7B). Door de registratie van beelden werd de positie van de cel gestoken (Figuur 7B). Tot slot werden met behulp van de Handmatige tracking plug-in van imagej myosin Foci bijgehouden (Figuur 7C). Volgens de coördinaten informatie, snelheden van myosin langs delings as, en as loodrecht op het werden berekend binnen 50 s na het begin van de cytokinese.
Figuur 1: bepaling van de rode-X-concentratie in Rhodamine. (a-D) Embryo's die GFP-myosin (groen) en mCherry-Histon (magenta) uitdrukken, werden in de nabijheid geplaatst van kralen die gebonden waren aan verschillende concentraties Rhodamine rood-X (magenta). De signaal intensiteiten van mCherry en Rhodamine Red-X worden uitgezet langs de witte stippellijnen (onderste grafieken). De parels en Histon-signalen werden duidelijk gedetecteerd voor kralen behandeld met 0,5 μg/mL Rhodamine rood-X. Schaalbalken tonen 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: assemblage van de mond pipet. Mond pipet wordt geassembleerd door nauwe (1) en brede (2) Tygon buizen met een PTFE filter (3) aan te sluiten. Aan het einde van de smalle en brede Tygon buis werden respectievelijk capillaire houder (4) en mondstuk (5) bevestigd. Een hand getekende Glazen capillair (6) kan in de capillaire houder worden ingebracht. De schaalbalk is 50 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Blastomere isolatie. A) het hand trekken van glas capillair. B) hand getekende Glazen capillair voor de overdracht van embryo's. C) hand getekende Glazen capillair voor verwijdering van de eierschaal. D) Schematische voorstelling van de juiste grootte van de capillaire opening voor de verwijdering van de eierschaal. Pijlen duiden op embryo's. Schaalbalken tonen 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Blastomere Isolation workflow. A) dissectie van volwassen C. elegans in de Eier zout buffer om embryo's te verkrijgen. Voor het verwijderen van de eierschaal vertonen Foto's 2-cel-en 4-cel-fase embryo's. B) behandeling en wassen van hypochloriet. C) Schematische weergave van de juiste timing voor het verwijderen van eierschalen. Foto toont een 4-cel fase embryo na verwijdering van de eierschaal. D) scheiding van blastomere. Foto toont een gescheiden 2-cel fase embryo. De afmetingen van de pijlen in C en D geven de relatieve krachten aan die nodig zijn tijdens het pipetteren. Schaalbalken tonen 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: assemblage van de beeldvormings kamer. A) afdekraam aan de afdek houder bevestigen. B) afbeeldingen van een dekslip houder. De afdek houder voor en na de montage wordt respectievelijk aan de linker-en rechterkant aangegeven. C) een cirkel die via een hydrofobe pen wordt getekend. D) toevoeging van het groeimedium van Shelton en het monster in de kring. E) montage van een dekslip om verdamping te voorkomen. Schaalbalken tonen 50 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: analyse van de oriëntatie van de celverdeling. A) eendiagram van de oriëntatie analyse van de celdeling. B) bepaling van het spil vlak. Linker afbeeldingen tonen een voorbeeld van een monster. 3D gereconstrueerde 4-D-films werden geroteerd rond de Y-as om het vlak te bepalen waarin twee nucleotiderende verticaal uitlijnen (rechter afbeelding; rechter bovenste schema's). In dit voorbeeld is spil vlak ± 90 ° van 110 ° (middelste afbeelding, rechtsonder schema). C) meting van de spil oriëntatie ten opzichte van het celkraal contact. Het gebruik van afbeeldingen van het spil vlak, spindel oriëntatie na cytokinese werd bepaald op basis van de hoek tussen lijnen die twee nucleotiderende verbinden (oranje stippellijnen in de juiste schema's) en celcontact (blauwe stippellijnen). Toen beide dochtercellen aan de kralen waren bevestigd, was de contact oriëntatie van de celkraal de lijn die beide contact sites passeert. Groen is myosin en centrosome, magenta is Histon en kralen. Schaalbalken zijn 10 μm. tijden zijn minuten en seconden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: analyse van myosine flow. A) eendiagram van de myosine flow-analyse. B) correctie van de oriëntatie van de celverdeling. Om de intracellulaire myosin-stromings dynamiek te kwantificeren, werd de rotatie van het verdelen van cellen gecorrigeerd met behulp van de ImageJ plugin stack reg (Rigid Body optie). Bovenste en onderste afbeeldingen zijn voor en na de stack reg-verwerking. Rechts de meeste afbeeldingen tonen temporele kleurcode van time series. C) het opsporen van myosine Foci. Met behulp van de afbeeldingen verwerkt door stack reg, individuele myosin Foci bewegingen werden bijgehouden door ImageJ Manual tracking plugin. Delings-as en de as loodrecht op het werden gedefinieerd als x en y, respectievelijk (rechts schema's). Myosin-stromingssnelheden in x-en y-as (VX en Vy) werden gemeten volgens de coördinaten informatie. Schaalbalken zijn 10 μm. tijden zijn minuten en seconden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reconstitutie van vereenvoudigde celcontactpatronen laat onderzoekers de rollen van specifieke celcontactpatronen in verschillende aspecten van de morfogenese testen. We hebben deze techniek gebruikt om te laten zien dat de celdelings as wordt bestuurd door het fysieke contact met lijm parels10. Aangezien de specificatie van de delings assen cruciaal is voor multicellulaire ontwikkeling door bij te dragen aan morphogenesis14, stamcel divisie15,16en weefselhomeostase15,16, moet deze methode een nieuw mechanisme van de vorming van dierlijke weefsels kunnen verlichten.
Naast de oriëntatie van de celdeling, heeft deze methode een potentieel om een platform te zijn om de relatie tussen mechanische signalen en het lot van cellen te testen. Eerdere studies rapporteerden dat mechanische cue de specificatie van het lot van cellen regelt. Humane mesenchymale stamcellen differentiëren in neuron, adipocyte, skeletspieren cel, en osteoblast wanneer gekweekt in substraat met verschillende stijfheid17. Als reactie op de stijfheid van het substraat, zullen de transcriptionele regulatoren ja-geassocieerde eiwitten (YAP) en TAZ (transcriptionele co-Activator met PDZ-bindend motief) translokaliseren naar Nucleus, om het lot van cellen specificatie18te reguleren. De methode in dit document moet ook nuttig zijn om te testen van de rol van mechanische aanwijzingen op de specificatie van het lot van cellen, door het kweken van cel lange termijn in contact met zelfklevende kralen.
Deze methode heeft beperkingen in het recapituleren van bepaalde mechanische signalen die in vivo zijn waargenomen. In C. elegans, chitineuze eierschaal en permeabiliteit barrière dienen als een fysiek beperken. Hoewel het verwijderen van de eierschaal geen invloed heeft op de normale ontwikkeling, resulteert het verwijderen van zowel de eierschaal als de permeabiliteit barrière in abnormale patroonvorming19. Bij afwezigheid van een eierschaal en permeabiliteit barrière wordt de celvorm bolvormig, wat suggereert dat de druk tussen cellen en cel-eierschaal een cruciale rol speelt in celvervorming en patronen. Inderdaad, Cell-cel knijpen krachten is voorgesteld om de celdeling oriëntatie te reguleren20. Zonder fysieke beperkingen en putende druk onder de weefsels, verwachten we dat deze methode ook niet kan worden samengevat in vivo celcontactgebied. Als het gebied van de cel contact is bekend dat invloed inkeping signalering21, deze beperking moet verder worden overwogen wanneer bepaalde mechanische of chemische Cue werkt niet met behulp van deze in vitro methode.
We hebben tot nu toe getest de celverdeling oriëntatie van geïsoleerde AB, P1, EMS, P2, ABa, ABp cellen (cellen tot 6 cel stadia) in onze handen10, maar de methode kan worden toegepast op latere ontwikkeling voor zover individuele cel kan worden geïsoleerd. Recente sequentie studie van één cel heeft gebruik gemaakt van pronase vertering van worm lichaam om larvale Cell22te isoleren. Daarom, potentieel kan men gebruik maken van pronase behandeling te isoleren later stadium embryonale cellen en larvale cellen.
In deze studie, we toonden het voorbeeld van de interactie tussen mechanische Cue en Cell Division oriëntatie, maar celcelcommunicatie wordt ook gemedieerd door chemische aanwijzingen zoals WNT23, notch24, hechting gekoppeld receptoren25 enzovoort. Belangrijk is dat de kralen bereidingsmethode hier gepresenteerd kan de kralen met eventuele eiwitten te koppel, waardoor de reconstitutie van chemische aanwijzingen. Eerdere studies hebben ook gebruikt Sepharose kraal26 en eiwitten-een magnetische kraal27 gecoat met WNT eiwit om te demonstreren WNT-afhankelijke ontwikkelingsprocessen. Echter, deze kralen zijn niet commercieel verkrijgbaar in verschillende maten in vergelijking met carboxylaat gemodificeerde polystyreen kralen. Vandaar dat toekomstig onderzoek de gepresenteerde methode kan gebruiken als een platform om de rol van zowel chemische als fysieke aanwijzingen in meer afstemmingen te testen. Samen genomen, deze methode is geschikt voor onderzoekers, die zijn het bestuderen van cellulaire gedrag en reacties die voortvloeien uit ruimtelijke cel contact patronen en willen elimineren andere cellulaire signalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
We bedanken James Priess en Bruce Bowerman voor advies en het verstrekken van c. elegans stammen, Don Moerman, Kota Mizumoto, en Life Sciences Institute Imaging Core faciliteit voor het delen van apparatuur en reagentia, aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, min JEE Kim voor het onderhoud van c. elegans en kritische lezing van ons manuscript. Ons werk wordt ondersteund door de Raad voor Natuurwetenschappen en ingenieurs onderzoek van Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
- Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
