In Vitro Reconstituição de Padrões de Contato celular espacial com caenorhabditis isolado elegans embrião blastômeros e contas adesivas de poliestireno
Summary
As complexidades dos tecidos dos sistemas multicelulares confundem a identificação da relação causal entre pistas extracelulares e comportamentos celulares individuais. Aqui, apresentamos um método para estudar a ligação direta entre pistas dependentes de contato e eixos de divisão usando blastômeros de embriões c. elegans e contas de poliestireno adesivo.
Abstract
Em sistemas multicelulares, as células individuais são cercadas pelas várias pistas físicas e químicas provenientes de células vizinhas e do meio ambiente. Esta complexidade do tecido confunde a identificação da ligação causal entre sugestões extrínsecas e dinâmica celular. Um sistema multicelular reconstituído sinteticamente supera esse problema, permitindo que os pesquisadores testem uma sugestão específica, eliminando outros. Aqui, apresentamos um método para reconstituir padrões de contato celular com caltídeos elegans elegans isolados de Caenorhabditis e contas de poliestireno adesivas. Os procedimentos envolvem remoção de casca de ovo, isolamento blastômero interrompendo a adesão célula-célula, preparação de contas adesivas de poliestireno e reconstituição do contato célula-célula ou contas celulares. Finalmente, apresentamos a aplicação deste método para investigar a orientação de eixos de divisão celular que contribui para a regulação do padrão celular espacial e especificação do destino celular no desenvolvimento de embriões. Este método in vitro robusto, reproduzível e versátil permite o estudo de relações diretas entre padrões de contato de células espaciais e respostas celulares.
Introduction
Durante o desenvolvimento multicelular, os comportamentos celulares (por exemplo, eixo de divisão) de células individuais são especificados por várias pistas químicas e físicas. Para entender como a célula individual interpreta essa informação, e como eles regulam a montagem multicelular como uma propriedade emergente é um dos objetivos finais dos estudos de morgênese. O organismo modelo C. elegans contribuiu significativamente para a compreensão da regulação celular da morgênese, como a polaridade celular1,a divisão celular padrão1,a decisão do destino celular2,e regulamentos em escala de tecido, como fiação neuronal3 e organogênese4,5. Embora existam várias ferramentas genéticas disponíveis, os métodos de engenharia de tecidos são limitados.
O método de engenharia de tecidos mais bem sucedido no estudo de C. elegans é o isolamento clássico blastômero6; como o embrião c. elegans é cercado por uma casca de ovo e uma barreira de permeabilidade7,sua remoção é um dos principais procedimentos deste método. Embora este método de isolamento blastômero permita a reconstituição do contato célula-célula de forma simplificada, ele não permite a eliminação de pistas indesejadas; o contato celular ainda coloca pistas mecânicas (por exemplo, adesão) e químicas, limitando assim nossa capacidade de analisar completamente a relação causal entre a sugestão e o comportamento celular.
O método apresentado neste artigo usa contas de poliestireno modificadas carboxilaquela que podem se ligar covalentemente a quaisquer moléculas reativas de amina, incluindo proteínas como ligantes. Particularmente, usamos uma forma reativa amina de Rhodamine Red-X como um ligante para fazer contas visualmente rastreáveis e adesivos para a célula. Os grupos de carboxyl de superfície de contas e grupos primários de amina de molécula de ligand são acoplados por carbodiimide solúvel em água 1-etil-3-(dimetilaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. As contas adesivas obtidas permitem os efeitos da sugestão mecânica na dinâmica celular10. Usamos esta técnica para identificar pistas mecânicas necessárias para a orientação da divisão celular10.
Protocol
Representative Results
Discussion
A reconstituição de padrões simplificados de contato celular permitirá que os pesquisadores testem os papéis de padrões específicos de contato celular em diferentes aspectos da morfogênese. Usamos essa técnica para mostrar que o eixo da divisão celular é controlado pelo contato físico com contas adesivas10. Como a especificação do eixo de divisão é crucial para o desenvolvimento multicelular, contribuindo para a morfogênese14,divisão de células-tronco<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a James Priess e Bruce Bowerman por conselhos e fornecendo cepas de C. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto e Life Sciences Institute Imaging Core Facility por compartilhar equipamentos e reagentes, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim para a manutenção de C. elegans e leitura crítica de nosso manuscrito. Nosso trabalho é apoiado pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
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