분리 된 예쁜 꼬마 염 철충 배아 블라스타미어와 접착 성 폴리스티렌 구슬과 공간 세포 접촉 패턴의 체외 재구성
Summary
다세포 시스템의 조직 복잡성은 세포 외 단서와 개별 적인 세포 행동 사이 인과 관계의 확인을 혼동. 여기에서, 우리는 C. elegans 배아 블라스토미어와 접착성 폴리스티렌 구슬을 사용하여 접촉 의존적 큐와 분할 축 사이의 직접적인 링크를 연구하는 방법을 제시한다.
Abstract
다세포 시스템에서, 개별 세포는 인접한 세포 및 환경에서 오는 각종 물리적 및 화학적인 단서에 의해 포위됩니다. 이 조직 복잡성은 외인성 단서와 세포 역학 사이 인과 링크의 확인을 혼동합니다. 종합적으로 재구성된 다세포 시스템은 연구원이 다른 사람을 제거하는 동안 특정 단서를 테스트할 수 있게 함으로써 이 문제를 극복합니다. 여기서, 우리는 분리 된 예쁜 꼬마염 블래스토미어 및 접착 성 폴리스티렌 구슬로 세포 접촉 패턴을 재구성하는 방법을 제시합니다. 절차는 계란 껍질 제거, 세포 세포 접착을 방해하여 blastomere 격리, 접착성 폴리스티렌 구슬의 준비, 세포 세포 또는 세포 비드 접촉의 재구성을 포함합니다. 마지막으로, 우리는 배아 개발에서 공간 세포 패터닝 및 세포 운명 사양의 조절에 기여하는 세포 분열 축의 방향을 조사하기 위해이 방법의 응용 프로그램을 제시한다. 이 견고하고 재현 가능하며 다재다능한 체외 식 방법을 통해 공간 세포 접촉 패턴과 세포 반응 사이의 직접적인 관계를 연구할 수 있습니다.
Introduction
다세포 발달 도중, 개별 적인 세포의 세포 행동 (예를 들면, 분할 축)는 각종 화학적 및 물리적 단서에 의해 지정됩니다. 개별 세포가 이 정보를 해석하는 방법, 그리고 다세포 어셈블리를 응급 재산으로 조절하는 방법을 이해하는 것은 형태 형성 연구의 궁극적인 목표 중 하나입니다. 모델 유기체 C. elegans는 세포 극성1,세포 분열 패턴1,세포 운명 결정2,신경 배선3 및 유기발생과같은 조직 규모 규정과 같은 형태 형성의 세포 수준 조절에 크게 기여하고 있다4,5. 다양한 유전 적 도구가 있지만 조직 공학 방법은 제한적입니다.
C. elegans 연구에서 가장 성공적인 조직 공학 방법은 고전적인 blastomere 격리6; C. 예쁜꼬마조충태아는 달걀 껍질과 투과성 장벽7에둘러싸여 있기 때문에 제거는이 방법의 주요 절차 중 하나입니다. 이 blastomere 절연 방법은 단순화 된 방식으로 세포 세포 접촉의 재구성을 가능하게하지만, 원치 않는 큐의 제거를 허용하지 않습니다; 세포 접촉은 여전히 기계적(예: 접착) 및 화학 적 단서를 모두 발생시켜 큐와 세포 행동 사이의 인과 관계를 완전히 분석하는 능력을 제한합니다.
이 백서에 제시된 방법은 리간드로 단백질을 포함하여 어떤 아민 반응성 분자든지에 공유하게 묶을 수 있는 carboxylate 수정된 폴리스티렌 구슬을 이용합니다. 특히, 우리는 구슬을 시각적으로 추적 할 수 있고 세포에 접착제로 만들기 위해 리간드로 로다민 레드-X의 아민 반응성 형태를 사용했습니다. 리간드 분자의 비드 표면 및 1차 아민 기의 카르복실 기는 수용성 카르보디미드 1-에틸-3-(디메틸아미노프로필) 카르보디미드(EDAC)8,9에의해 결합된다. 얻어진 접착제 비드는 세포역학(10)에기계적 큐의 효과를 허용한다. 우리는 세포 분열 방향10에필요한 기계적 단서를 식별하기 위해이 기술을 사용했다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단순화된 세포 접촉 패턴의 재구성은 연구원이 형태 형성의 다른 양상에 있는 특정 세포 접촉 패턴의 역할을 시험하는 것을 시킬 것입니다. 우리는 세포 분열 축이 접착제 비드(10)와의물리적 접촉에 의해 제어된다는 것을 보여주기 위해이 기술을 사용했다. 분할축 명세서는형태형성14, 줄기세포분열15,16,조직항상성15…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 조언과 C. elegans 균주, 돈 모어만, 코타 미즈모토, 생명 과학 연구소 이미징 코어 시설 공유 장비 및 시약, 아오이 히로야수, 리사 페르난도, 김민지 의 유지 보수에 대한 우리의 원고의 유지 보수에 대한 조언과 제공 에 대한 제임스 프리스와 브루스 Bowerman 감사합니다. 우리의 작업은 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회에 의해 지원됩니다 (NSERC), (RGPIN-2019-04442).
Materials
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
- Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
- Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
- McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
- Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
- Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
- Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
- Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
- Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
- Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
- Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
- Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
- Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
- Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
- Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
- Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
- Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
- Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
- Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
- Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).
