Summary

בחוקת חוץ גופית דפוסי יצירת קשר מרחבי המרחב עם מבודדים העובר בלייסטומרים וחרוזי קלקר

Published: November 26, 2019
doi:

Summary

רקמות המורכבות של מערכות רב-תאיים לבלבל את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים החילוץ והתנהגויות הסלולר הפרט. כאן, אנו מציגים שיטה לבחון את הקשר הישיר בין הרמזים תלויי הקשר וצירי החלוקה באמצעות שימוש בשיטת C. אלגיה העובר בלסטומרים וחרוזי פוליסטירן מוקצף.

Abstract

במערכות רב-תאיים, תאים בודדים מוקפים ברמזים פיזיים וכימיים שונים המגיעים מתאים שכנים ומהסביבה. מורכבות רקמות זה מבלבלת את הזיהוי של הקשר הסיבתי בין רמזים חיצוניים ודינמיקה סלולרית. מערכת מלאכותית מחדש מתגבר על בעיה זו בכך שהיא מאפשרת לחוקרים לבדוק אות מסוים תוך חיסול אחרים. כאן, אנו מציגים שיטה ליצור מחדש דפוסי קשר של התאים עם האלגיה הבודד Caenorditis בלייסטורה ומחרוזות פוליסטירן מוקצף. ההליכים כוללים הסרת קליפת ביצה, בידוד בלסטורה על ידי שיבוש תא תא הדבקה, הכנת חרוזים פוליסטירן מוקצף, והחוקה של תא תא או קשר עם חרוז תא. בסופו של דבר, אנו מציגים את היישום של שיטה זו כדי לחקור את הכיוון של צירי החטיבה התאית התורמת לוויסות הריבוב הסלולר המרחבי ואת מפרט הגורל התא בפיתוח עוברים. שיטת החשיבה האיתנה והמגוונת מאפשרת ללמוד יחסים ישירים בין דפוסי קשר של תאים מרחביים ותגובות סלולריות.

Introduction

במהלך פיתוח רב-תאיים, התנהגויות הסלולר (למשל, ציר החלוקה) של תאים בודדים מצוינים באמצעות רמזים כימיים ופיזיים שונים. כדי להבין כיצד תא בודד מפרש מידע זה, וכיצד הם מסדירים הרכבה רב-תאיים כמאפיין מתהווה מהווה אחת המטרות הסופיות של לימודי הורפוגנזה. האורגניזם מודל C. אלגיה תרם באופן משמעותי להבנת הרגולציה ברמה התאית של מורפוגנזה כגון קוטביות תא1, תא הניתוח1, החלטה של תא הגורל2, ותקנות בקנה מידה של רקמות כגון החיווט העצבי3 ו אורגנוגנזה4,5. למרות שיש כלים גנטיים שונים זמינים, שיטות הנדסת רקמות מוגבלות.

שיטת הנדסת הרקמה המוצלחת ביותר בחקר ה -C. אלגיה היא הבידוד הקלאסי של6; כמו העובר C. אלגיה מוקפת קליפת ביצה וחדירות מחסום7, הוצאתם היא אחת הפרוצדורות העיקריות של שיטה זו. בעוד שיטת הבידוד הבלסטורה מאפשרת ליצור מחדש את הקשר של תא התא באופן פשוט, הוא אינו מאפשר חיסול של רמזים לא רצויים; קשר התא עדיין מהווה הן מכני (למשל, הדבקה) ורמזים כימיים, ובכך להגביל את היכולת שלנו לנתח באופן מלא את הקשר הסיבתי בין האות והתנהגות תאית.

השיטה המוצגת במאמר זה משתמשת carboxylate אוחר שונה פוליסטירן מחרוזות שיכול לאגד באופן מיטבי לכל מולקולות של האמין-תגובתי כולל חלבונים כמו ליגנדס. במיוחד, השתמשנו בצורה של מין מגיב-מאמין של rhodamine אדום-X כמו ליגנד כדי לעשות חרוזים הן העקיבה החזותית ודבק לתא. קבוצות קרבוקסילי של משטח חרוז וקבוצות אמין הראשי של ליגנד מולקולה הם ביחד על ידי מסיס מים קרבודיאימיד 1-אתיל-3-(dimethylaminopropyl) קרבודיאימיד (edac)8,9. חרוזים מקבל דבק לאפשר את ההשפעות של הרמז המכני על דינמיקה סלולרית10. השתמשנו בטכניקה זו כדי לזהות רמזים מכניים הנדרשים לכיוון חלוקת תאים10.

Protocol

1. הכנת פוליסטירן מוקצף לחרוז הערה: פרוטוקול זה אינו דורש טכניקה אספזיהומית. שוקל 10 מ ג של carboxylate אוחר שונה פוליסטירן חרוזים בשפופרת מיקרוצנטריפוגה 1.5 mL. כדי לשטוף את החרוזים, להוסיף 1 מ ל 2-(N-מורגואולנו) מאגר חומצה ethanesulfonic (MES) לתוך השפופרת. מאז מאגר MES אינו מכיל פוספט ?…

Representative Results

עבור הכנת חרוזים, קבענו את הכמות האופטימלית של הרדאמלין אדום-X מסוג הרמדמידימאדיל עבור הזן הטרנסגניים המבטא GFP-רירן II ו-mCherry-histone (איור 1א-ד). השתמשנו mcherry מתויג היסטון כסמן של התקדמות מחזור התא. מכיוון הן rhodamine אדום-x ו-mcherry יהיה מואר על ידי 561 ננומטר לייזר, האינטנסיביות…

Discussion

החוקה החוזרת של דפוסי קשר של תא מפושט יאפשר לחוקרים לבדוק את התפקידים של דפוסי קשר תאים ספציפיים בהיבטים שונים של הורפוגנזה. השתמשנו בטכניקה זו כדי להראות כי ציר החלוקה של התאים נשלט על ידי מגע פיזי עם חרוזים הדבק10. כמו מפרט ציר החלוקה הוא חיוני עבור פיתוח רב-תאיים על ידי תורם ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לג פרינס ולברוס בוקרמן לקבלת ייעוץ ולמתן זנים של C. אלגיה , דון מירמן, קוטה מיזומוטו, ומכון למדעי החיים במכון לעיבוד ציוד וריאגנטים, אחאי הירוסו, ליסה פרננדו, מין ג’י קים למען תחזוקת הג והקריאה הקריטית של כתב היד שלנו. העבודה שלנו נתמכת על ידי מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה של קנדה (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

Materials

1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Alfa Aesar AAA1080703 For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) KISKER Biotech PPS-30.0COOHP For the bead preparation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals) Fisher BioReagents BP300-100 For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder Fisher BioReagents BP665-1 For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer Molecular Probes R6160 For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. Intelligent Imaging Innovation N.A. For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

References

  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. , (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. , (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. , (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. , (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. , (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22 (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Enzymology. 276 (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46 (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130 (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21 (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474 (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux’s Archives of Developmental Biology. 202 (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. , 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40 (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10 (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11 (10), 1005624 (2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339 (6126), 1445-1448 (2013).

Play Video

Cite This Article
Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).

View Video