Summary
Gewebekomplexitäten multizellulärer Systeme verwirren die Identifizierung des kausalen Zusammenhangs zwischen extrazellulären Hinweisen und individuellen zellulären Verhaltensweisen. Hier stellen wir eine Methode vor, um den direkten Zusammenhang zwischen kontaktabhängigen Cues und Divisionsachsen mit C. elegans embryo blastomeres und klebenden Polystyrolperlen zu untersuchen.
Abstract
In mehrzelligen Systemen sind einzelne Zellen von den verschiedenen physikalischen und chemischen Hinweisen umgeben, die aus benachbarten Zellen und der Umgebung stammen. Diese Gewebekomplexität verwirrt die Identifizierung des kausalen Zusammenhangs zwischen extrinsischen Cues und zellulärer Dynamik. Ein synthetisch rekonstituiertes mehrzelliges System überwindet dieses Problem, indem es Forschern ermöglicht, auf einen bestimmten Hinweis zu testen und andere zu eliminieren. Hier stellen wir eine Methode zur Rekonstituierung von Zellkontaktmustern mit isolierten Caenorhabditis elegans blastomer und klebenden Polystyrolperlen vor. Die Verfahren umfassen die Entfernung von Eierschalen, blastomere Isolierung durch Unterbrechung der Zell-Zell-Adhäsion, Die Herstellung von klebenden Polystyrolperlen und die Rekonstitution von Zellzell- oder Zellperlenkontakt. Schließlich stellen wir die Anwendung dieser Methode vor, um die Ausrichtung zellulärer Teilungsachsen zu untersuchen, die zur Regulierung der räumlichen zellulären Musterung und Zellschicksalsspezifikation bei der Entwicklung von Embryonen beiträgt. Diese robuste, reproduzierbare und vielseitige In-vitro-Methode ermöglicht die Untersuchung direkter Zusammenhänge zwischen räumlichen Zellkontaktmustern und zellulären Reaktionen.
Introduction
Während der multizellulären Entwicklung werden die zellulären Verhaltensweisen (z.B. Divisionsachse) einzelner Zellen durch verschiedene chemische und physikalische Hinweise spezifiziert. Zu verstehen, wie einzelne Zellen diese Informationen interpretieren und wie sie die mehrzellige Baugruppe als auftauchende Eigenschaft regulieren, ist eines der ultimativen Ziele von Morphogenesestudien. Der Modellorganismus C. elegans hat wesentlich zum Verständnis der zellulären Regulation der Morphogenese wie Zellpolarität1,Zellteilungsmuster1, Zellschicksalsentscheidung2und Gewebe-Skala-Vorschriften wie neuronale Verdrahtung3 und Organogenese4,5beigetragen. Obwohl es verschiedene genetische Werkzeuge zur Verfügung, Gewebe-Engineering-Methoden sind begrenzt.
Die erfolgreichste Tissue-Engineering-Methode in der C. elegans-Studie ist die klassische Blastomer-Isolation6; Da C. elegans Embryo von einer Eierschale und einer Durchlässigkeitsbarriere7umgeben ist, ist ihre Entfernung eines der hauptverfahren dieser Methode. Während diese blastomere Isolationsmethode eine vereinfachte Rekonstitution des Zell-Zell-Kontakts ermöglicht, erlaubt sie nicht die Eliminierung unerwünschter Hinweise; Der Zellkontakt stellt nach wie vor sowohl mechanische (z. B. Haftung) als auch chemische Hinweise dar, wodurch unsere Fähigkeit, den kausalen Zusammenhang zwischen dem Cue und dem zellulären Verhalten vollständig zu analysieren, eingeschränkt wird.
Die in diesem Papier vorgestellte Methode verwendet Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen, die kovalent an alle amin-reaktiven Moleküle binden können, einschließlich Proteine wie Liganden. Insbesondere haben wir eine amin-reaktive Form von Rhodamine Red-X als Liganden verwendet, um Perlen sowohl visuell nachvollziehbar als auch klebend an der Zelle zu machen. Die Carboxylgruppen der Perlenoberfläche und der primären Amingruppen von Ligandenmolekülen werden durch wasserlösliches Carbodiimid 1-ethyl-3-(Dimethylaminopropyl)-Carbodiimid (EDAC)8,9gekoppelt. Erhaltene Klebeperlen ermöglichen die Auswirkungen des mechanischen Hinweises auf die Zelldynamik10. Wir haben diese Technik verwendet, um mechanische Hinweise zu identifizieren, die für die Zellteilungsausrichtung10erforderlich sind.
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Protocol
1. Herstellung von Klebstoff-Polystyrol-Perle
HINWEIS: Dieses Protokoll erfordert keine aseptische Technik.
- Wiegen Sie 10 mg Carboxylat modifizierte Polystyrolperlen in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr.
- Um die Perlen zu waschen, fügen Sie 1 ml 2-(N-Morpholino)Ethanulfonsäure (MES) Puffer in die Röhre. Da der MES-Puffer kein Phosphat und Acetat enthält, was die Reaktivität von Carbodiimid reduzieren kann, ist er für die Proteinkopplungsreaktion geeignet. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen.
- Drehen Sie das Rohr für 60 s bei 2.000 x g über eine Tischzentrifuge.
- Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer sorgfältig auspfeifen.
- Waschen Sie die Perlen erneut mit 1 ml MES-Puffer, indem Sie die Schritte 1.2-1.4 befolgen.
- Fügen Sie 1 ml MES-Puffer mit 10 mg EDAC in das Rohr, um die Oberflächen-Carboxylgruppen zu aktivieren. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen.
- Drehen und inkubieren Sie das Rohr für 15 min bei Raumtemperatur.
- Drehen Sie die Perlen für 60 s bei 2.000 x g.
- Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer sorgfältig auspfeifen.
- Um die Perlen zu waschen, fügen Sie 1 ml Phosphat gepufferte Saline (PBS) in das Rohr. Wirbel nisch die Röhre, um die Perlen zu mischen.
- Drehen Sie das Rohr für 60 s bei 2.000 x g.
- Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den Puffer sorgfältig auspfeifen.
- Waschen Sie die Perlen erneut mit 1 ml PBS, indem Sie den Schritten 1.10-1.12 folgen.
- Die endgültige Konzentration von Rhodamine verwendet wird, hängt von der Belastung abgebildet. Bereiten Sie 1 ml 1-, 10-, 100- und 1000-fache Verdünnungsserie von Rhodamine Red-X aus der 0,65 mM Rhodamine Red-X-Lagerlösung vor.
- Pipette 20 L Perlen in jedes serielle Verdünnungsrohr.
- Drehen und inkubieren Sie das Rohr für 5 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Perlen zweimal mit 1 ml PBS, indem Sie die Schritte 1.10-1.12 wiederholen.
- 1 ml PBS in das Rohr geben und bis zu 6 Wochen bei 4 °C lagern. Überprüfen Sie die Fluoreszenzintensität der Perlen unter einem Mikroskop, das für die Live-Bildgebung verwendet wird. Die entsprechende Konzentration des Rhodamine-Rot-X-Succinimidylesters hängt von den bildgebenden Bedingungen ab (Abbildung 1).
HINWEIS: Perlen ohne Rhodamine Red-X Behandlung nicht an zelle haften. Rhodamine Red-X dient als Fluoreszenzmarker sowie Als Klebemolekül. Die elektrostatische Wechselwirkung zwischen positiv geladenem Rhodamine Red-X und negativ geladener Plasmamembran ist eine vermeintliche Ursache der Adhäsion.
2. Montage der Mundpipette
- Schneiden Sie breite (6,35 mm Innendurchmesser) und schmale (3,175 mm Innendurchmesser) Tygon-Rohre auf ca. 25 cm bzw. 40 cm Länge(Abbildung 2).
- Verbinden Sie die Tygon-Röhren mit einem Polytetrafluorethylen-Filter (PTFE) (0,2 m Porengröße) (Abbildung 2).
- Zerlegen Sie ein handelsübliches Saugrohr und befestigen Sie den Kapillarhalter und das Mundstück am Ende der schmalen bzw. breiten Tygon-Rohre (Abbildung 2).
HINWEIS: PTFE-Filter wurde verwendet, um das Einatmen von Dämpfen der Hypochloritlösung über Mundpipetten zu verhindern.
3. Isolierung von Embryoblastomer
HINWEIS: Tragen Sie Handschuhe und Labormantel, um Schnitt und Kontakt mit der Bleichlösung zu vermeiden.
- Halten Sie jedes Ende einer Mikrokapillare (Kapazität; 10 L) mit der rechten und linken Hand.
- Ziehen Sie die Mikrokapillare an beiden Enden, um Spannung aufzutragen und bringen Sie die Mitte der Kapillare über einen Brenner, um zwei handgezogene Kapillaren zu machen (Abbildung 3A).
- Schneiden Sie die Spitzen der handgezogenen Kapillaren mit Zangen unter dem Seziermikroskop und befestigen Sie die gezogene Kapillare in einem Mundpipettiergerät (Abbildung 2). Bereiten Sie zwei Arten von Pipetten vor. Die Spitzenöffnungsgrößen für die Pipetten sollten etwa 2x und 1x der kurzen Achslänge von C. elegans Embryonen (30 'm) für den Embryotransfer und die Eischalenentfernung bzw. Abbildung 3B-Dbetragen.
- Pipette 45 l Eisalzlösung auf einen Brunnen eines Multiwell-Schlittens(Abbildung 4A; unten).
- 5-10 erwachsene C. elegans auf eine gut enthaltende Eisalzlösung geben.
- Um frühe C. elegans Embryonen zu erhalten, schneiden Erwachsene in Stücke, indem Sie zwei Nadeln rechts und links des C. elegans Körpers positionieren und die Nadeln aneinander vorbeischieben(Abbildung 4A; obere Schaltpläne).
- Pipette 45 l Hypochloritlösung auf einen Brunnen neben der brunnenhaltigen Eisalzlösung(Abbildung 4B).
- Pipette 45 l des Wachstumsmediums von Sheltons auf die folgenden drei Brunnen neben der brunnenhaltigen Hypochloritlösung (Abbildung 4B).
- Übertragen Sie 1-Zell-Stadium- und frühe 2-Zellen-Embryon in die Hypochloritlösung durch Mundpipettieren mit der handgezeichneten Kapillare für embryonale Übertragung (Abbildung 4B).
- Warten Sie auf 40-55 s.
- Waschen Sie die Embryonen, indem Sie die Embryonen aus der Hypochloritlösung in Sheltons Wachstumsmedium übertragen, indem Sie mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer Pipettieren (Abbildung 4B).
- Waschen Sie die Embryonen erneut, indem Sie die Embryonen in einen neuen Brunnen von Sheltons Wachstumsmedium übertragen, indem Sie mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer Pipettieren (Abbildung 4B).
- Übertragen Sie die gewaschenen Embryonen in einen neuen Brunnen von Sheltons Wachstumsmedium durch Mundpipettieren mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer. Mit der handgezeichneten Kapillare für die Eischalenentfernung, wiederholen Sie sorgfältig die Pipettierung(Abbildung 4C; mittlere Schaltpläne). Wenn die Eierschale erfolgreich entfernt wird, werden die embryonalen Zellen kugelförmiger(Abbildung 4C;rechts).
- Trennen Sie die 2-Zellen-Stadium embryonale Blastomere durch sanfte und kontinuierliche Pipettierung mit der handgezeichneten Kapillare für die Eischalenentfernung (Abbildung 4D).
4. Rekonstitution von Kontaktmustern mit Blastomer und Perle
HINWEIS: Arbeiten Sie unter dem Bildgebungsmikroskop, um eine Trennung einer Zelle von einer Perle zu vermeiden und die rechtzeitige Bildaufnahme zu erleichtern.
- Um dies mit einem invertierten Mikroskop zu beobachten, bereiten Sie eine Bildkammer wie in Abbildung 5vor.
- Legen Sie einen Deckelslip auf einen Decksliphalter(Abbildung 5A).
- Verkleben Sie die Kanten des Deckels, um ihn zu stabilisieren. Die Seite mit Klebeband ist die "Rückseite"(Abbildung 5A,B).
- Drehen Sie den Deckelhalter auf die "Vorderseite" und ziehen Sie mit einem hydrophoben Stift einen Kreis auf den Deckel (Abbildung 5C).
HINWEIS: Jede Glasbodenschale funktioniert auch, sofern die Embryonen durch die Mundpipette manipulierbar sind.
- Fügen Sie Sheltons Wachstumsmedium innerhalb des Kreises hinzu, der vom hydrophoben Marker gezeichnet wird (Abbildung 5D).
- Übertragen Sie das isolierte Blastomer in die Bildkammer.
- Geben Sie ein kleines Volumen der chemisch funktionalisierten Perlen mit der handgezeichneten Kapillare für den Embryotransfer.
- Steuern Sie die Position der Polystyrolperlen, indem Sie in die handgezeichnete Kapillare blasen, bis die Perle an dem isolierten Blastomer befestigt wird.
- Montieren Sie einen Deckelschlupf, um eine Verdunstung des Mediums zu vermeiden (Abbildung 5E). Führen Sie Live-Bildgebung durch.
5. Herstellung wichtiger Reagenzien
- Eisalzlösung (10 ml): Kombinieren Sie 235 l von 5 M NaCl und 240 l von 2 M KCl mit 9525 l dH2O.
- Hypochloritlösung (10 ml): Kombinieren Sie 7,5 ml Clorox (mit ca. 7,5 % Natriumhypochlorit) mit 2,5 ml 10 N NaOH (Endkonzentration von Natriumhypochlorit beträgt ca. 5,625%).
HINWEIS: Obwohl viele veröffentlichte Methoden Chitinase verwendet haben, um chitinöse Eierschalen zu verdauen, haben wir eine Methode mit Hypochloritlösung11angenommen. Durch die Vermeidung der Batch-zu-Batch-Variationen von Chitinase-Aktivitäten glauben wir, dass diese Methode reproduzierbarer und kostengünstiger ist. - 0,81 mM Inulin Lösung (40 ml)
- 0,2 g Inulin zu 40 ml dH2O hinzufügen.
- Autoklav aufzulösen.
HINWEIS: Hält 1 Monat bei 4 °C.
- 0,5 M MES Puffer (500 ml)
- 48,81 g MES in 400 ml destilliertem Wasser (dH2O) auflösen.
- Stellen Sie den pH-Wert auf 6,0 ein.
- Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 500 ml mit dH2O.
- PBS-Lösung (1 l)
- Um 10-fache PBS-Lösung herzustellen, lösen Sie 1 Packung PBS-Vormischungspulver in 1 L dH2O auf.
- Kombinieren Sie 100 ml 10-fach-PBS-Lösung mit 900 ml dH2O.
- 5% Polyvinylpyrrolidon (PVP) Lösung (4 ml)
- Unter sterilen Bedingungen 0,2 g PVP in 4 ml Drosophila Schneiders Medium auflösen.
HINWEIS: Öffnen Sie immer Schneider es Medium Stock in Tissue Culture (TC) Haube. 1 Monat bei 4 °C aufbewahren.
- Unter sterilen Bedingungen 0,2 g PVP in 4 ml Drosophila Schneiders Medium auflösen.
- 0,65 mM Rhodamine Red-X Stofflösung (2 ml)
- Wiegen Sie 1 mg Rhodamine Red-X.
- 2 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) zum Auflösen hinzufügen.
- Aliquot und lagern bei -20 °C.
- Shelton es Growth Medium (SGM) (10,25 ml)
- Kombinieren Sie unter sterilen Bedingungen 8 ml Medium von Drosophila Schneider, 1 ml PVP-Lösung, 1 ml Inulin-Lösung, 1 ml Basal Medium Eagle (BME)-Vitamine, 50 l Penicillin-Streptomycin und 100 l Lipidkonzentrat.
- Aliquot 325 l SGM in 1,5 ml Mikroröhren.
HINWEIS: Etwa 1 Monat bei 4 °C aufbewahren. - Am Tag der Blastomer-Isolierung 175 L fetales Rinderserum (FBS) zum SGM hinzufügen (bei einem Gesamtvolumen von 500 l).
HINWEIS: FBS bei -20 °C aufbewahren und vor Gebrauch auftauen. FBS muss nicht wärmeabgetötet werden.
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Representative Results
Für die Perlenpräparation haben wir die optimale Menge an Rhodamin-Rot-X-Succinimidylester für den transgenen Stamm bestimmt, der GFP-Myosin II und mCherry-Histon exzessiiert (Abbildung 1A-D). Wir verwendeten mCherry mit Histon als Marker für die Zellzyklusprogression. Da sowohl Rhodamine Red-X als auch mCherry mit einem 561 nm Laser beleuchtet werden, ist die optimale Intensität des Rhodamine Red-X Signals mit der von Histone vergleichbar, um eine gleichzeitige Bildgebung von Zelle und Perle zu ermöglichen. Zum Beispiel war das Fluoreszenzsignal der mit 0,005 g/ml Rhodamine Red-X-Succinimidylester behandelten Perle zu schwach, um die Perle zu visualisieren (Abbildung 1A). Auf der anderen Seite war das Fluoreszenzsignal der mit 5'g/mL Rhodamine Red-X-Succinimidylester behandelten Perlen zu stark, um mCherry-Histone abzubilden (Abbildung 1D). Wir haben festgestellt, dass 0,5 g/ml Rhodamine Red-X Succinimidylester für diesen speziellen transgenen Stamm optimal ist (Abbildung 1C).
Die Blastomer-Isolierung wurde nach den in Abbildung 4dargestellten Verfahren durchgeführt. Die folgenden Punkte sollten für erfolgreiche Experimente berücksichtigt werden. 1) Die Medien im Brunnen verdampfen im Laufe der Zeit und werden zähflüssig; Dies bewirkt, dass die Embryonen an der Glaskapillare und anderen Embryonen kleben, so dass ein neuer Brunnen mit frischen Medien verwendet werden muss. 2) In der Hypochloritlösung schweben Embryonen an die Oberfläche. Daher senken Sie die Vergrößerung des Mikroskops und konzentrieren Sie sich auf die Oberfläche des Tröpfchens, um die Übertragung von Embryonen zu erleichtern. 3) Die Wirksamkeit der Hypochloritlösung kann unterschiedlich sein. Daher sollte die Dauer der Embryonen, die in der Hypochloritlösung ausgegeben werden, für jede neue Charge von Hypochloritlösung getestet werden. 4) Legen Sie die Mundpipette so nah wie möglich an den Embryo, um die Stärke zu minimieren, die verwendet wird, um in die Pipette zu blasen, aber auch nicht zu nah, so dass der Embryo auch angesaugt wird (dies gilt auch beim Anbringen von Perlen). 5) Nach der Entnahme der Eierschale werden Embryonen sehr empfindlich. Daher müssen die auf die Mundpipette ausgeübten Kräfte leicht abgesenkt werden, um das Platzen von Embryonen zu verhindern. 6) Längere Verwendung der Mundpipette kann den PTFE-Filter dämpfen, und 7) 2-Zellen-Stadium-Embryonen sollten nur getrennt werden, wenn der Kern klar gebildet wurde(Abbildung 4C, linke Schaltpläne). Im Vergleich zu Zellen in intakten Embryonen(Abbildung 4A; rechts) sehen Zellen in Embryonen ohne Eierschale runder aus(Abbildung 4C;rechts). Zusätzlich wird nach blastomerer Isolation die Form der Blastomere kugelförmig(Abbildung 4D; rechts).
Um die Auswirkungen des physikalisch-kontaktabhängigen Hinweises auf die Zellteilungsorientierung zu testen, befestigten wir die von der 2-Zellen-Stufe isolierten Ab-Blastomere mit Rot-X-Beschichtung und führten Live-Imaging durch (Abbildung 6, Abbildung 7). Die Perle ohne Rhodamine Red-X-Behandlung haftete nicht an den Blastomeren, was darauf hindeutet, dass die Rhodamine Red-X als Fluoreszenzmarker und Klebemolekül dient. Für die Analyse der Zellteilungsausrichtung haben wir das Zeitrafferbild mit der Funktion "3D-Projekt" von ImageJ12 (Abbildung 6A; Kippen um Y-Achse) in 3D rekonstruiert. Um die Ebene zu bestimmen, die die mitotische Spindel (Spindelebene) enthält, identifizierten wir zunächst eine Ebene, auf der zwei Zentrosomen vertikal ausgerichtet waren(Abbildung 6B;110°): Die Ebene mit einem Winkel von 90° dieser Ebene ist die Spindelebene(Abbildung 6B;-20°). Als nächstes haben wir den Spindelwinkel (Spindelausrichtung) relativ zur Zellperlenkontaktschnittstelle (Kontaktausrichtung) nach Zytokinese gemessen (Abbildung 6C). Wenn beide Tochterzellen an die Perle angefügt wurden, wurde eine Linie, die beide Kontaktstellen übergibt, als Kontaktausrichtung verwendet.
In unserer vorherigen Studie haben wir einen anisotropen Zelloberflächenmyosinfluss während der perleninduzierten AB-Zellteilungsausrichtung10identifiziert. Es ist jedoch schwierig, den intrazellulären Myosinfluss zu messen, da sich die Zelle während der orientierten Teilung bewegt. Um dies zu tun, haben wir zuerst die Proben mit Spindel ausgewählt, die an der Bildebene ausgerichtet sind (xy-Ebene) (Abbildung 7). Zweitens wurden Z-Stacks mit der Methode der maximalen Projektion projiziert (Abbildung 7). Drittens wurden Zellbewegungen mit dem Subpixel-Registrierungsalgorithmus Stack reg Plug-in13 von ImageJ mit starrer Körperoption korrigiert (Abbildung 7B). Durch die Registrierung von Bildern wurde die Position der Zelle stabilisiert (Abbildung 7B). Schließlich wurden mit dem manuellen Tracking-Plug-in von ImageJ Myosin-Brennpunkte nachverfolgt (Abbildung 7C). Nach den Koordinateninformationen wurden die Geschwindigkeiten von Myosin entlang der Divisionsachse und der Achse senkrecht zu ihr innerhalb von 50 s nach Dem Beginn der Zytokinese berechnet.
Abbildung 1: Bestimmung der Red-X-Konzentration von Rhodamine. (A-D) Embryonen, die GFP-Myosin (grün) und mCherry-histon (Magenta) exemiten, wurden in der Nähe von Perlen platziert, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Rhodamine Red-X (Magenta) gebunden waren. Die Signalintensitäten von mCherry und Rhodamine Red-X werden entlang der weißen gepunkteten Linien (untere Graphiken) dargestellt. Die Perlen und Histone-Signale wurden eindeutig für Perlen erkannt, die mit 0,5 g/ml Rhodamine Red-X behandelt wurden. Maßstabsbalken zeigen 10 m an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Montage der Mundpipette. Mundpipette wird durch Anschluss schmaler (1) und breiter (2) Tygonrohre mit einem PTFE-Filter (3) montiert. Am Ende des schmalen und breiten Tygon-Rohrs wurden Kapillarhalter (4) bzw. Mundstück (5) angebracht. Eine handgezeichnete Glaskapillare (6) kann in den Kapillarhalter eingesetzt werden. Die Maßstabsleiste ist 50 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Blastomere Isolation. (A) Handziehen der Glaskapillare. (B) Handgezeichnete Glaskapillare für embryonale Übertragung. (C) Handgezeichnete Glaskapillare zur Eischalenentfernung. (D) Schaltpläne, die die entsprechende Größe der Kapillaröffnung für die Eischalenentfernung anzeigen. Pfeile zeigen Embryonen an. Maßstabsbalken zeigen 100 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Blastomere-Isolations-Workflow. (A) Zerlegung von erwachsenen C. eleganen in Eisalzpuffer, um Embryonen zu erhalten. Fotos zeigen 2-Zellen- und 4-Zellen-Bühnenembryonen vor der Eischalenentfernung. (B) Hypochloritbehandlung und -wäsche. (C) Schemata zeigen den geeigneten Zeitpunkt für die Entnahme von Eierschalen. Foto zeigt einen 4-Zellen-Stadium-Embryo nach der Eischalenentfernung. (D) Blastomere-Trennung. Das Foto zeigt einen getrennten 2-Zellen-Stadium-Embryo. Die Größen der Pfeile in C und D geben die relativen Kräfte an, die beim Pipetieren erforderlich sind. Maßstabsbalken zeigen 50 'm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Montage der Bildkammer. (A) Anbringen von Deckelschlupf am Deckscheinhalter. (B) Bilder eines Deckscheinhalters. Der Deckelhalter vor und nach der Montage ist links bzw. rechts angezeigt. (C) Ein Kreis, der über einen hydrophoben Stift gezeichnet wird. (D) Addition des Wachstumsmediums von Sheltons und der Stichprobe innerhalb des Kreises. (E) Montage eines Deckellipss, um Verdunstung zu vermeiden. Maßstabsleisten zeigen 50 mm an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Analyse der Ausrichtung der Zellteilung. (A) Ein Diagramm der Analyse der Zellteilungsausrichtung. (B) Bestimmung der Spindelebene. Linke Bilder zeigen ein Beispiel für ein Beispiel. 3D rekonstruierte 4D-Filme wurden um die Y-Achse gedreht, um die Ebene zu bestimmen, wobei zwei Zentrosomen vertikal ausgerichtet sind (rechtes Bild; rechte obere Schaltplan). In diesem Beispiel ist die Spindelebene 90° von 110° (mittleres Bild; rechte untere Schaltplan). (C) Messung der Spindelausrichtung relativ zum Zellperlenkontakt. Anhand von Bildern der Spindelebene wurde die Spindelausrichtung nach Zytokinese anhand des Winkels zwischen den Linien bestimmt, die zwei Zentrosomen (orange gepunktete Linien im rechten Schaltplan) und Zellkontakt (blaue gepunktete Linien) verbinden. Wenn beide Tochterzellen an den Perlen befestigt wurden, war die Kontaktausrichtung der Zelle die Linie, die beide Kontaktstellen übergibt. Grün ist Myosin und Zentrom, Magenta ist Histon und Perlen. Die Skalenbalken sind 10 m. Die Zeiten sind Minuten und Sekunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Analyse des Myosinflusses. (A) Ein Diagramm der Myosin-Flussanalyse. (B) Korrektur der Zellteilungsausrichtung. Um die intrazelluläre Myosin-Flussdynamik zu quantifizieren, wurde die Rotation der Trennzelle mit dem ImageJ-Plugin Stack reg(Option Starrer Körper) korrigiert. Obere und untere Bilder befinden sich vor und nach der Stack-Reg-Verarbeitung. Rechts zeigen die meisten Bilder den zeitlichen Farbcode von Zeitreihen. (C) Verfolgung von Myosin-Brennpunkten. Mit den von Stack reg verarbeiteten Bildern wurden einzelne Myosin-Foci-Bewegungen durch das ImageJ Manual Tracking Plugin nachverfolgt. Die Divisionsachse und die zu ihr senkrecht zu ihr senkrecht emittende Achse wurden als x bzw. y (rechte Schaltpläne) definiert. Myosin-Fließgeschwindigkeiten in x- und y-Achse (Vx und Vy) wurden entsprechend den Koordinateninformationen gemessen. Die Skalenbalken sind 10 m. Die Zeiten sind Minuten und Sekunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Rekonstitution vereinfachter Zellkontaktmuster ermöglicht es Forschern, die Rollen bestimmter Zellkontaktmuster in verschiedenen Aspekten der Morphogenese zu testen. Wir haben diese Technik verwendet, um zu zeigen, dass die Zellteilungsachse durch den physischen Kontakt mit Klebeperlen10gesteuert wird. Da die Divisionsachsenspezifikation für die multizelluläre Entwicklung entscheidend ist, indem sie zur Morphogenese14,Stammzellteilung15,16und Gewebehomöostase15,16beiträgt, sollte diese Methode in der Lage sein, einen neuen Mechanismus der tierischen Gewebebildung zu beleuchten.
Neben der Zellteilungsorientierung hat diese Methode das Potenzial, eine Plattform zu sein, um die Beziehung zwischen mechanischen Hinweisen und Zellschicksal zu testen. Frühere Studien berichteten, dass mechanische Cue Steuert Zellschicksal Spezifikation. Menschliche mesenchymale Stammzellen unterscheiden sich in Neuron, Adipozyten, Skelettmuskelzelle und Osteoblasten, wenn sie im Substrat mit unterschiedlicher Steifigkeit kultiviert werden17. Als Reaktion auf die Substratsteifigkeit werden die Transkriptionsregulatoren Yes-associated protein (YAP) und TAZ (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) in den Kern translocate, um die Zellschicksalsspezifikation18zu regulieren. Die in diesem Papier vorgestellte Methode sollte auch nützlich sein, um die Rolle mechanischer Hinweise auf die Zellschicksalsspezifikation zu testen, indem Sie Zellen langfristig in Kontakt mit Klebeperlen kultivieren.
Diese Methode hat Einschränkungen bei der Rekapitulation bestimmter mechanischer Hinweise, die in vivo beobachtet wurden. In C. elegansdienen chitinöse Eierschale und Permeabilitätsbarriere als physische Einschränkung. Obwohl die Entfernung von Eierschalen die normale Entwicklung nicht beeinträchtigt, führt die Entfernung sowohl der Eierschale als auch der Durchlässigkeitsbarriere zu einer abnormalen Musterbildung19. In Ermangelung von Eierschale und Permeabilitätsbarriere wird die Zellform sphärischer, was darauf hindeutet, dass der Druck zwischen Zellen und Zelleierschale eine entscheidende Rolle bei der Zellverformung und -musterung spielt. Tatsächlich wurde vorgeschlagen, die Zellzellquetschenden kräfte zu regulieren, um die Zellteilungsorientierung zu regulieren20. Ohne physikalischen Druck und Putativdruck unter Geweben erwarten wir, dass diese Methode auch nicht in vivo Zellkontaktbereich rekapitulieren kann. Da bekannt ist, dass sich der Zellkontaktbereich auf notch-Signalisierung21auswirkt, muss diese Einschränkung weiter berücksichtigt werden, wenn bestimmte mechanische oder chemische Hinweise mit dieser In-vitro-Methode nicht funktionieren.
Wir haben bisher die Zellteilungsausrichtung von isolierten AB, P1, EMS, P2, ABa, ABp-Zellen (Zellen bis zu 6 Zellstadien) in unseren Händen10getestet, aber die Methode kann auf die spätere Entwicklung angewendet werden, soweit einzelne Zellen isoliert werden können. Jüngste Einzelzell-Sequenzierungstudie hat Pronase Verdauung des Wurmkörpers verwendet, um Larvenzelle zu isolieren22. Daher kann man möglicherweise eine Pronase-Behandlung verwenden, um spätere embryonale Zellen und Larvenzellen im späteren Stadium zu isolieren.
In dieser Studie zeigten wir das Beispiel der Interaktion zwischen mechanischer Cue und Zellteilungsorientierung, aber Zell-Zell-Kommunikation wird auch durch chemische Hinweise wie Wnt23, Notch24, Adhäsion gekoppelte Rezeptoren25 und so weiter vermittelt. Wichtig ist, dass die hier vorgestellte Perlenvorbereitungsmethode die Perlen mit allen Proteinen koppeln kann, wodurch die Rekonstitution chemischer Hinweise ermöglicht wird. Frühere Studien haben auch Sepharose Perle26 und Protein-A magnetische Perle27 mit Wnt-Protein beschichtet verwendet, um Wnt-abhängige Entwicklungsprozesse zu demonstrieren. Allerdings sind diese Perlen nicht kommerziell in verschiedenen Größen im Vergleich zu Carboxylat modifizierten Polystyrolperlen erhältlich. Daher kann die zukünftige Forschung die vorgestellte Methode als Plattform nutzen, um die Rolle sowohl chemischer als auch physikalischer Hinweise auf abstimmigere Weise zu testen. Zusammengenommen ist diese Methode für Forscher geeignet, die zelluläre Verhaltensweisen und Reaktionen untersuchen, die aus räumlichen Zellkontaktmustern resultieren und andere zelluläre Hinweise beseitigen möchten.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken James Priess und Bruce Bowerman für die Beratung und Bereitstellung von C. elegans Stämmen, Don Moerman, Kota Mizumoto und Life Sciences Institute Imaging Core Facility für den Austausch von Geräten und Reagenzien, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim für die Wartung von C. elegans und die kritische Lektüre unseres Manuskripts. Unsere Arbeit wird vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride | Alfa Aesar | AAA1080703 | For the bead preparation |
| Aspirator Tube Assembly | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation. |
| Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type | Caenorhabditis Genetics Center | N2 | Strain used in this study |
| Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 | in house | KSG5 | Strain used in this study |
| Calibrated Mircopipets, 10 µL | Drummond | 21-180-13 | For the blastomere isolation |
| Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) | KISKER Biotech | PPS-30.0COOHP | For the bead preparation |
| CD Lipid Concentrate | Life Technologies | 11905031 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Clorox | Clorox | N. A. | For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well. |
| Coverslip holder | In house | N.A. | For the blastomere isolation. |
| Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. | Carl Zeiss | Stemi 508 | For the blastomere isolation. |
| Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin | Gibco | A3160701 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge | BD | 14-826AA | For the blastomere isolation |
| Inulin | Alfa Aesar | AAA1842509 | For the blastomere isolation |
| MEM Vitamin Solution (100x) | Gibco | 11120052 | For the blastomere isolation. |
| MES (Fine White Crystals) | Fisher BioReagents | BP300-100 | For the bead preparation |
| Multitest Slide 10 Well | MP Biomedicals | ICN6041805 | For the blastomere isolation |
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder | Fisher BioReagents | BP665-1 | For the bead preparation |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140148 | For the blastomere isolation. |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher BioReagents | BP431-100 | For the blastomere isolation |
| Potassium Chloride | Bioshop | POC888 | For the blastomere isolation |
| Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer | Molecular Probes | R6160 | For the bead preparation |
| Schneider’s Drosophila Sterile Medium | Gibco | 21720024 | For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood. |
| Sodium Chloride | Bioshop | SOD001 | For the blastomere isolation |
| Sodium Hydroxide Solution, 10 N | Fisher Chemical | SS255-1 | For the blastomere isolation |
| Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. | Intelligent Imaging Innovation | N.A. | For live-imaging |
| Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile | Basix | 13100115 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-862 | For the blastomere isolation. |
| Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm | Saint Gobain Performance Plastics | 89403-854 | For the blastomere isolation. |
References
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