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Developmental Biology

In vitro ricostituzione dei modelli di contatto cellulare spaziale con Caenorhabditis isolato elegans Embrione Blastomeres e Perline in polistino adesivo

doi: 10.3791/60422 Published: November 26, 2019

Summary

Le complessità tissutali dei sistemi multicellulari confondere l'identificazione della relazione causale tra segnali extracellulari e comportamenti cellulari individuali. Qui, presentiamo un metodo per studiare il legame diretto tra segnali dipendenti dal contatto e assi di divisione utilizzando i blastomeri embrionali C. elegans e le perle adesive in polistirolo.

Abstract

Nei sistemi multicellulari, le singole cellule sono circondate dai vari segnali fisici e chimici provenienti dalle cellule vicine e dall'ambiente. Questa complessità tissutale confonde l'identificazione del legame causale tra segnali estrinseci e dinamiche cellulari. Un sistema multicellulare sinteticamente ricostituito supera questo problema consentendo ai ricercatori di testare uno spunto specifico eliminandone altri. Qui, presentiamo un metodo per ricostituire i modelli di contatto cellulare con caenorhabditis elegans blastomere isolati e perline di polistirolo adesivo. Le procedure prevedono la rimozione del guscio d'uovo, l'isolamento del blastomere interrompendo l'adesione cellulare-cellula, la preparazione di perline di polistirolo adesivo e la ricostituzione del contatto cell-cell o cell-perad. Infine, presentiamo l'applicazione di questo metodo per studiare l'orientamento degli assi della divisione cellulare che contribuisce alla regolazione del patterning cellulare spaziale e delle specifiche del destino cellulare nello sviluppo degli embrioni. Questo metodo in vitro robusto, riproducibile e versatile consente di studiare le relazioni dirette tra i modelli di contatto delle cellule spaziali e le risposte cellulari.

Introduction

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Durante lo sviluppo multicellulare, i comportamenti cellulari (ad esempio, l'asse di divisione) delle singole cellule sono specificati da vari segnali chimici e fisici. Comprendere come le singole cellule interpretano queste informazioni e come regolano l'assemblaggio multicellulare come proprietà emergente è uno degli obiettivi finali degli studi di morfogenesi. L'organismo modello C. elegans ha contribuito in modo significativo alla comprensione della regolazione a livello cellulare della morfogenesi come la polarità cellulare1,la divisione cellularemodello 1, la decisione del destino cellulare2e le regolazioni su scala dei tessuti come il cablaggio neuronale3 e l'organogenesi4,5. Anche se ci sono vari strumenti genetici disponibili, i metodi di ingegneria tissutale sono limitati.

Il metodo di ingegneria tissutale di maggior successo nello studio C. elegans è il classico isolamento blastomere6; poiché l'embrione di C. elegans è circondato da un guscio d'uovo e da una barriera di permeabilità7,la loro rimozione è una delle principali procedure di questo metodo. Mentre questo metodo di isolamento del blastomere consente la ricostituzione del contatto cellulare in modo semplificato, non consente l'eliminazione di segnali indesiderati; il contatto cellulare pone ancora segnali sia meccanici (ad esempio adadimento) che chimici, limitando così la nostra capacità di analizzare completamente la relazione causale tra il segnale e il comportamento cellulare.

Il metodo presentato in questo documento utilizza perline di polistirolo modificate carboxylate che possono legarsi covalentmente a qualsiasi molecola ammine-reattiva, comprese le proteine come ligandi. In particolare, abbiamo usato una forma ammine-reattiva di Rhodamine Red-X come ligando per rendere le perline tracciabili visivamente e adesivo alla cellula. I gruppi carboxyl di superficie di perline e gruppi di ammina primaria di molecola ligando sono accoppiati da carbodiimide solubile in acqua 1-ethyl-3-(dimetilaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. Perline adesive ottenute consentono gli effetti del segnale meccanico sulla dinamica cellulare10. Abbiamo usato questa tecnica per identificare i segnali meccanici necessari per l'orientamento della divisione cellulare10.

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Protocol

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1. Preparazione del tallone adesivo in polistirolo

NOTA: questo protocollo non richiede una tecnica asettica.

  1. Pesare 10 mg di carboxylate modificato perline di polistirolo in un tubo di microcentrifuga 1,5 mL.
  2. Per lavare le perline, aggiungere 1 mL di 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) tampone nel tubo. Poiché il buffer MES non contiene fosfato e acetato, che può ridurre la reattività del carbodiimide, è adatto all'uso nella reazione di accoppiamento delle proteine. Vorticare il tubo per mescolare le perline.
  3. Girare il tubo per 60 s a 2.000 x g attraverso una centrifuga panca.
  4. Scartare il supernatante pipettando con attenzione il buffer.
  5. Lavare nuovamente le perline con 1 mL di buffer MES seguendo i passaggi 1.2-1.4.
  6. Aggiungere 1 mL di buffer MES contenente 10 mg di EDAC nel tubo per attivare i gruppi carboxyl di superficie. Vorticare il tubo per mescolare le perline.
  7. Ruotare e incubare il tubo per 15 min a temperatura ambiente.
  8. Girare verso il basso le perline per 60 s a 2.000 x g.
  9. Scartare il supernatante pipettando con attenzione il buffer.
  10. Per lavare le perline, aggiungere 1 mL di fosfato tamponato salina (PBS) nel tubo. Vorticare il tubo per mescolare le perline.
  11. Girare verso il basso il tubo per 60 s a 2.000 x g.
  12. Scartare il supernatante pipettando con attenzione il buffer.
  13. Lavare nuovamente le perline con 1 mL di PBS seguendo i passaggi 1.10-1.12.
  14. La concentrazione finale di Rhodamine utilizzata dipenderà dalla deformazione che viene imageta. Preparare 1 mL di serie di diluizione di Rhodamine Red-X da 0,65 mM.
  15. Pipette 20 -L di perline in ogni tubo di diluizione seriale.
  16. Ruotare e incubare il tubo per 5 min a temperatura ambiente.
  17. Lavare le perline due volte con 1 mL di PBS ripetendo i passaggi 1.10-1.12.
  18. Aggiungere 1 mL di PBS nel tubo e conservarlo a 4 gradi centigradi per un massimo di 6 settimane. Controllare l'intensità di fluorescenza delle perline al microscopio utilizzato per l'imaging dal vivo. L'adeguata concentrazione del Succinimidyl ester Rhodamine Red-X dipende dalle condizioni di imaging (Figura 1).
    NOTA: Le perline senza il trattamento Rhodamine Red-X non aderiscono alla cellula. Rhodamine Red-X serve come marcatore di fluorescenza così come molecola adesiva. L'interazione elettrostatica tra La Rhodamine Red-X caricata positivamente e la membrana plasmatica caricata negativamente è una causa putativa di adesione.

2. Assemblaggio della pipetta della bocca

  1. Tagliare i tubi Tygon larghi (6,35 mm di diametro interno) e stretti (3,175 mm di diametro interno) a circa 25 cm e 40 cm di lunghezza, rispettivamente (Figura 2).
  2. Collegare i tubi Tygon con un filtro in politetrafluoroetilene (PTFE) (dimensione dei pori 0,2 m) (Figura 2).
  3. Smontare un tubo aspirante disponibile in commercio e attaccare il suo supporto capillare e il boccaglio alla fine dei tubi Tygon stretti e larghi, rispettivamente (Figura 2).
    NOTA: il filtro PTFE è stato utilizzato per prevenire l'inalazione di fumi di soluzione ipoclorosa tramite la pipetta bocca.

3. Isolamento del blastomere embrionale

NOTA: Indossare guanti e camice da laboratorio per evitare il taglio e il contatto con la soluzione di sbiancamento.

  1. Tenere ogni estremità di un microcapillare (capacità; 10 l) con la mano destra e sinistra.
  2. Tirare il microcapillare verso entrambe le estremità per applicare la tensione e portare il centro del capillare su un bruciatore per fare due capillari tirati a mano (Figura 3A).
  3. Tagliare le punte dei capillari tirati a mano con pinze al microscopio dissetante e attaccare il capillare tirato in un apparato di pipettatura della bocca (Figura 2). Preparare due tipi di pipette. Le dimensioni di apertura della punta per le pipette devono essere approssimativamente 2x e 1 x la lunghezza dell'asse corto degli embrioni di C. elegans (30 m) per il trasferimento dell'embrione e la rimozione del guscio d'uovo, rispettivamente, Figura 3B-D.
  4. Pipette 45 - L di soluzione di sale d'uovo su un pozzo di una diapositiva multiwell(Figura 4A; inferiore).
  5. Mettere 5-10 C. elegan adulti su una soluzione di sale uovo contenente.
  6. Per ottenere i primi embrioni di C. elegans, tagliare gli adulti a pezzi posizionando due aghi a destra ea sinistra del corpo di C. elegans e facendo scorrere gli aghi l'uno oltre l'altro(Figura 4A; schemi superiori).
  7. Pipette 45 - L di soluzione ipoclorite su un pozzo accanto alla soluzione di sale d'uovo ben contenente (Figura 4B).
  8. Pipette 45 - L del mezzo di crescita di Shelton sui successivi tre pozzi accanto alla soluzione di ipocloresi (Figura 4B).
  9. Trasferire gli embrioni dello stadio a 1 cellula e dei primi 2 stadi nella soluzione dell'ipoclorito con il tubo a bocca con il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni (Figura 4B).
  10. Attendere 40-55 s.
  11. Lavare gli embrioni trasferendo gli embrioni dalla soluzione di ipoclorito nel mezzo di crescita di Shelton con la pipistrelli a bocca con il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni (Figura 4B).
  12. Lavare nuovamente gli embrioni trasferendo gli embrioni in un nuovo pozzo del mezzo di crescita di Shelton con il tubo a bocca con il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni (Figura 4B).
  13. Trasferire gli embrioni lavati in un nuovo pozzo del mezzo di crescita di Shelton con il pipeting a bocca con il capillare disegnato a mano per il trasferimento dell'embrione. Utilizzando il capillare disegnato a mano per la rimozione del guscio d'uovo, ripetere attentamente la pipettatura (Figura 4C; schemi medi). Se il guscio d'uovo viene rimosso con successo, le cellule embrionali diventeranno più sferiche(Figura 4C; a destra).
  14. Separare i blastomeri embrionali dello stadio a 2 celle con pipettando delicatamente e continuamente con il capillare disegnato a mano per la rimozione del guscio d'uovo (Figura 4D).

4. Ricostituzione dei modelli di contatto con blastomere e perline

NOTA: Lavorare al microscopio di imaging per evitare la dissociazione di una cellula da un tallone e per facilitare l'acquisizione tempestiva dell'immagine.

  1. Per osservare con un microscopio invertito, preparare una camera di imaging come nella Figura 5.
    1. Posizionare un coperchio su un supporto copricapista (Figura 5A).
    2. Nastro i bordi del coperchio per stabilizzarlo. Il lato con nastro è il lato 'posteriore' (Figura 5A,B).
    3. Capovolgere il supporto coverslip sul lato 'front' e disegnare un cerchio sulla coverslip con una penna idrofobica (Figura 5C).
      NOTA: Qualsiasi piatto con fondo di vetro funziona anche, a condizione che gli embrioni siano manipolati dalla pipetta della bocca.
  2. Aggiungete il mezzo di crescita di Shelton all'interno del cerchio disegnato dal marcatore idrofobico (Figura 5D).
  3. Trasferire il blastomere isolato nella camera di imaging.
  4. Distribuisci un piccolo volume delle perline chimicamente funzionalizzate usando il capillare disegnato a mano per il trasferimento degli embrioni.
  5. Controlla la posizione delle perline di polistirolo soffiando nel capillare disegnato a mano fino a quando il tallone non si attacca al blastomere isolato.
  6. Montare un coperchio per evitare l'evaporazione del supporto (Figura 5E). Eseguire l'imaging dal vivo.

5. Preparazione di reagenti importanti

  1. Soluzione di sale d'uovo (10 mL): Unire 235 luna di 5 M NaCl e 240 L di 2 M KCl con 9525 L di dH2O.
  2. Soluzione ipoclorotorite (10 mL): Combinare 7,5 mL di Clorox (contenente circa 7,5% di ipoclorito di sodio) con 2,5 mL di 10 N OH (la concentrazione finale di ipoclore di sodio è di circa il 5,625%).
    NOTA: Anche se molti metodi pubblicati hanno usato la chitinasi per digerire i gusci d'uovo chitinosi, abbiamo adottato un metodo utilizzando la soluzione ipoclotorite11. Evitando le variazioni batch-to-batch delle attività di chitinasi, riteniamo che questo metodo sia un approccio più riproducibile ed economico.
  3. Soluzione Inulin da 0,81 mM (40 mL)
    1. Aggiungere 0,2 g di Inulin a 40 mL di dH2O.
    2. Autoclave per sciogliere.
      NOTA: Mantiene per 1 mese a 4 gradi centigradi.
  4. 0,5 M Buffer MES (500 mL)
    1. Sciogliere 48,81 g di MES in 400 mL di acqua distillata (dH2O).
    2. Regolare pH a 6.0.
    3. Portare il volume totale a 500 mL con dH2O.
  5. Soluzione PBS (1 L)
    1. Per creare una soluzione PBS a 10 pieghe, sciogliere 1 pacchetto di polvere di premiscela PBS in 1 L di dH2O.
    2. Combina 100 mL di soluzione PBS da 10 volte con 900 mL di dH2O.
  6. Soluzione Polivinylpyrrolidone (PVP) (4 mL)
    1. In condizioni sterili, sciogliere 0,2 g di PVP in 4 mL di Drosophila Schneider's Medium.
      NOTA: Aprire sempre lo stock Medium di Schneider nel cofano di coltura dei tessuti (TC). Mantenere per 1 mese a 4 gradi centigradi.
  7. Soluzione stock Rhodamine Red-X da 0,65 mM (2 mL)
    1. Pesare 1 mg di Rhodamine Red-X.
    2. Aggiungere 2 mL di zolfo dimetilo (DMSO) per sciogliere.
    3. Aliquota e conservare a -20 gradi centigradi.
  8. Shelton's Growth Medium (SGM) (10,25 mL)
    1. In condizioni sterili, unire 8 mL di Drosophila Schneider's Medium, 1 mL di soluzione PVP, 1 mL di soluzione Inulin, 1 mL di Vitamine Basal Medium Eagle (BME), 50L di Penicillina-Streptomycin, e 100 l di Lipid concentrato insieme.
    2. Aliquota 325 L di SGM in microtubi da 1,5 mL.
      NOTA: Conservare per circa 1 mese a 4 gradi centigradi.
    3. Il giorno dell'isolamento del blastomer, aggiungere 175 loffele di siero bovino fetale (FBS) alla SGM (per un volume totale di 500 .
      NOTA: Conservare l'FBS a -20 gradi centigradi e scongelarlo prima dell'uso. FBS non ha bisogno di essere il calore ucciso.

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Representative Results

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Per la preparazione delle perline, abbiamo determinato la quantità ottimale di Rhodamine Red-X succinimidyl ester per la deformazione transgenica che esprime GFP-myosin II e mCherry-histone (Figura 1A-D). Abbiamo usato mCherry etichettato istono come marcatore della progressione del ciclo cellulare. Poiché sia Rhodamine Red-X che mCherry saranno illuminati da un laser da 561 nm, l'intensità ottimale del segnale Rhodamine Red-X è paragonabile a quella dell'istone per consentire l'imaging simultaneo di cellule e perline. Ad esempio, il segnale di fluorescenza dal tallone trattato con 0,005 g/mL Rhodamine Red-X succinimidyl ester era troppo debole per visualizzare il tallone (Figura 1A). D'altra parte, il segnale di fluorescenza dalle perline trattate con 5 g/mL Rhodamine Red-X succinimidyl ester era troppo forte per immagine mCherry-histone (Figura 1D). Abbiamo determinato che 0,5 g/mL Rhodamine Red-X succinimidyl ester è ottimale per questo particolare ceppo transgenico (Figura 1C).

L'isolamento del blastomere è stato eseguito secondo le procedure illustrate nella Figura 4. Per esperimenti di successo, è necessario affrontare i seguenti punti. 1) I media nel pozzo evaporano nel tempo e diventano viscosi; questo fa sì che gli embrioni si attacchino al capillare di vetro e ad altri embrioni, quindi è necessario utilizzare un nuovo pozzo con mezzi di comunicazione freschi. 2) Nella soluzione ipoclorite, gli embrioni galleggiano in superficie. Pertanto, abbassare l'ingrandimento del microscopio e concentrarsi sulla superficie della goccia per facilitare con il trasferimento di embrioni. 3) L'efficacia della soluzione ipoclorite può differire. Pertanto, la durata degli embrioni spesi nella soluzione di ipoclorite dovrebbe essere testata per ogni nuovo lotto di soluzione di ipoclorite fatta. 4) Posizionare la bocca pipetta il più vicino possibile all'embrione per ridurre al minimo la forza utilizzata per soffiare nella pipetta, ma anche non troppo vicino in modo che l'embrione venga aspirato pure (questo è vero anche quando si attaccano perline). 5) Dopo la rimozione del guscio d'uovo, gli embrioni diventano molto delicati. Di conseguenza, le forze esercitate sulla pipetta della bocca devono essere leggermente abbassate per evitare che gli embrioni scoppino. 6) L'uso prolungato della pipetta bocca può smorzare il filtro PTFE e 7) gli embrioni a stadio a 2 cellule devono essere separati solo quando il nucleo è stato chiaramente formato (Figura 4C, schemi a sinistra). Rispetto alle cellule in embrioni intatti(Figura 4A; destra), le cellule negli embrioni senza guscio d'uovo sembrano più rote(Figura 4C; destra). Inoltre, dopo l'isolamento dei blastomeri, la forma dei blastomeri diventa sferica(Figura 4D; a destra).

Per testare gli effetti del segnale fisico dipendente dal contatto sull'orientamento della divisione cellulare, abbiamo attaccato perline rivestite rhodamine Red-X ai blastomeri AB isolati dallo stadio a 2 celle ed eseguiti live-imaging (Figura 6, Figura 7). Il tallone senza rhodamine Red-X non ha aderito ai blastomeri, suggerendo che la Rhodamine Red-X serve sia come marcatore di fluorescenza che come molecola adesiva. Per l'analisi dell'orientamento della divisione cellulare, abbiamo ricostruito 3D l'immagine time-lapse utilizzando la funzione "progetto 3D" di ImageJ12 (Figura 6A;inclinamento intorno all'asse Y). Per determinare il piano contenente il mandrino mitotico (piano del mandrino), abbiamo inizialmente identificato un piano in cui due centroni sono stati allineati verticalmente (Figura 6B; 110): il piano con l'angolo di 90 gradi di questo piano è il piano del mandrino (Figura 6B; -20). Successivamente, abbiamo misurato l'angolo di mandrino (orientamento del mandrino) rispetto all'interfaccia di contatto cell-bead (orientamento del contatto) dopo la citocinesi (Figura 6C). Quando entrambe le cellule della figlia sono state attaccate al tallone, una linea che passa entrambi i siti di contatto è stata utilizzata come orientamento del contatto.

Nel nostro studio precedente, abbiamo identificato un flusso di miosina della superficie cellulare anisotropica durante l'orientamento della divisione cellulare AB indotta dal tallone10. Tuttavia, è difficile misurare il flusso intracellulare della miosina mentre la cellula si muove durante la divisione orientata. Per eseguire questa operazione, per prima cosa abbiamo selezionato i campioni con mandrino allineato al piano di imaging (piano xy) (Figura 7). In secondo luogo, gli stack z sono stati proiettati utilizzando il metodo di proiezione massima (Figura 7). In terzo luogo, i movimenti delle celle sono stati corretti utilizzando l'algoritmo di registrazione dei subpixel Stack reg plug-in13 di ImageJ con opzione corpo rigido (Figura 7B). Con la registrazione delle immagini, la posizione della cella è stata stabile (Figura 7B). Infine, utilizzando il plug-in di monitoraggio manuale di ImageJ, myosin foci sono stati tracciati (Figura 7C). Secondo le informazioni sulle coordinate, le velocità della miosina lungo l'asse di divisione e l'asse perpendicolare ad esso sono state calcolate entro 50 s dopo l'insorgenza della citocinesi.

Figure 1
Figura 1: Determinazione della concentrazione di Rhodamine Red-X. (A-D) Gli embrioni che esprimono GFP-myosin (verde) e mCherry-histone (magenta) sono stati collocati in prossimità di perline legate con diverse concentrazioni di Rhodamine Red-X (magenta). Le intensità del segnale di mCherry e Rhodamine Red-X vengono tracciate lungo le linee tratteggiate bianche (grafici in basso). Le perline e i segnali itoni sono stati chiaramente rilevati per le perline trattate con 0,5 g/mL Rhodamine Red-X. Le barre della scala mostrano 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Assemblaggio della pipetta della bocca. La pipetta a bocca viene assemblata collegando tubi Tygon stretti (1) e larghi (2) con un filtro PTFE (3). Alla fine del tubo Tygon stretto e largo, il supporto capillare (4) e il pezzo di bocca (5) sono stati attaccati, rispettivamente. Un capillare di vetro disegnato a mano (6) può essere inserito nel supporto capillare. barra della scala è 50 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Isolamento del Blastomere. (A) Trazione a mano di vetro capillare. (B) Capillare di vetro disegnato a mano per il trasferimento di embrioni. (C) Vetro disegnato a mano capillare per la rimozione del guscio d'uovo. (D) Gli schemi che mostrano la dimensione appropriata dell'apertura capillare per la rimozione del guscio d'uovo. Le frecce indicano gli embrioni. Le barre della scala mostrano 100 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: flusso di lavoro di isolamento Blastomere. (A) Dissezione dei C. elegan adulti nel tampone di sale d'uovo per ottenere embrioni. Le fotografie mostrano embrioni a 2 e 4 stadi a 4 celle prima della rimozione del guscio d'uovo. (B) Trattamento e lavaggio dell'ipocloto. (C) Gli schemi illustrano i tempi appropriati per la rimozione del guscio d'uovo. La fotografia mostra un embrione di stadio a 4 celle dopo la rimozione del guscio d'uovo. (D) Separazione del Blastomere. La fotografia mostra un embrione separato dello stadio a 2 cellule. Le dimensioni delle frecce in C e D indicano le forze relative necessarie durante la pipettatura. Le barre della scala mostrano 50 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Assemblaggio della camera di imaging. (A) Attacco coverslip al supporto della coverslip. (B) Immagini di un supporto per cover. Il supporto coverslip prima e dopo l'assemblaggio è indicato rispettivamente a sinistra e a destra. (C) Un cerchio disegnato attraverso una penna idrofobica. (D) Aggiunta del mezzo di crescita di Shelton e del campione all'interno del cerchio. (E) Montare un coperchio per evitare l'evaporazione. Barre della scala mostrano 50 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Analisi dell'orientamento della divisione cellulare. (A) Diagramma dell'analisi dell'orientamento della divisione cellulare. (B) Determinazione del piano del mandrino. Le immagini a sinistra mostrano un esempio di esempio. I filmati 4D ricostruiti 3D sono stati ruotati attorno all'asse Y per determinare il piano in cui due centrosomi si allineano verticalmente (immagine a destra; schemi superiori a destra). In questo esempio, il piano del mandrino è di 90 gradi di 110 gradi (immagine centrale; schemi in basso a destra). (C) Misurazione dell'orientamento del mandrino rispetto al contatto cell-perlè. Utilizzando le immagini del piano del mandrino, l'orientamento del mandrino dopo la citochina è stato determinato in base all'angolo tra le linee che collegano due centronici (linee tratteggiate arancioni negli schemi giusti) e al contatto cellulare (linee tratteggiate blu). Quando entrambe le cellule figlie sono state attaccate alle perline, l'orientamento del contatto cell-perline era la linea che passa entrambi i siti di contatto. Il verde è miosina e centroficatore, magenta è istono e perline. Le barre della scala sono di 10 m. I tempi sono minuti e secondi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Analisi del flusso di miosina. (A) Un diagramma dell'analisi del flusso della miosina. (B) Correzione dell'orientamento della divisione cellulare. Per quantificare la dinamica del flusso di miosina intracellulare, la rotazione della cella divisoria è stata corretta utilizzando il plugin ImageJ Stack reg ( Opzionecorpo rigido). Le immagini superiore e inferiore sono prima e dopo l'elaborazione Stack reg. La maggior parte delle immagini a destra mostra il codice di colore temporale temporale temporale. (C) Tracciamento dei foci di miosina. Utilizzando le immagini elaborate da Stack reg, singoli movimenti foci myosin sono stati tracciati da ImageJ Manual tracking plugin. L'asse di divisione e l'asse perpendicolare ad esso sono stati definiti rispettivamente come x e y (schemi a destra). Le velocità di flusso della miosina nell'asse x e y (Vx e Vy) sono state misurate in base alle informazioni sulle coordinate. Le barre della scala sono di 10 m. I tempi sono minuti e secondi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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La ricostituzione dei modelli di contatto cellulare semplificati consentirà ai ricercatori di testare i ruoli di specifici modelli di contatto cellulare in diversi aspetti della morfogenesi. Abbiamo usato questa tecnica per dimostrare che l'asse di divisione cellulare è controllato dal contatto fisico con perline adesive10. Poiché la specifica dell'asse di divisione è fondamentale per lo sviluppo multicellulare contribuendo alla morfogenesi14, divisione delle cellule staminali15,16e omeostasi dei tessuti15,16, questo metodo dovrebbe essere in grado di illuminare un nuovo meccanismo di formazione dei tessuti animali.

Oltre all'orientamento della divisione cellulare, questo metodo ha il potenziale per essere una piattaforma per testare la relazione tra segnali meccanici e destino cellulare. Studi precedenti hanno riferito che il segnale meccanico controlla le specifiche del destino cellulare. Le cellule staminali mesenchyvarie umane si differenziano in neurone, adipocito, cellule muscolari scheletriche e osteoblasti quando coltivate in substrato con rigidità diversa17. In risposta alla rigidità del substrato, i regolatori trascrizionali Proteine associazione sì (YAP) e TAA (co-attivatore trascrizionale con motivo legante PD) si traslocheranno nel nucleo, per regolare le specifiche del destino cellulare18. Il metodo presentato in questo documento dovrebbe anche essere utile per testare il ruolo dei segnali meccanici sulla specifica del destino cellulare, coltivando le cellule a lungo termine a contatto con perline adesive.

Questo metodo ha limitazioni nella ricapitolazione di alcuni segnali meccanici osservati in vivo. In C. elegans,guscio d'uovo chitinoso e barriera di permeabilità servono come vincolo fisico. Anche se la rimozione del guscio d'uovo non influisce sullo sviluppo normale, la rimozione sia del guscio d'uovo che della barriera di permeabilità provoca la formazione di modelli anomali19. In assenza di guscio d'uovo e barriera di permeabilità, la forma delle cellule diventa più sferica, suggerendo che la pressione tra le cellule e il guscio dell'uovo delle cellule svolge un ruolo critico nella deformazione e nel patterning delle cellule. Infatti, sono state proposte forze di spremitura cellulare per regolare l'orientamento della divisione cellulare20. Senza avere vincolo fisico e pressione putativa tra i tessuti, ci aspettiamo che anche questo metodo non possa ricapitolare nell'area di contatto delle cellule in vivo. Poiché l'area di contatto cellulare è nota per influenzare la segnalazione21di Notch , questa limitazione deve essere ulteriormente presa in considerazione quando alcuni segnali meccanici o chimici non funzionano con questo metodo in vitro.

Finora abbiamo testato l'orientamento della divisione cellulare di AB isolato, P1, EMS, P2, Cellule ABa, ABp (cellule fino a 6 stadi cellulari) nelle nostre mani10, ma il metodo può essere applicato allo sviluppo successivo per quanto la singola cellula può essere isolata. Un recente studio di sequenziamento a singola cellula ha usato la digestione pronasi del corpo del verme per isolare la cellula larvale22. Pertanto, potenzialmente si può usare il trattamento pronase per isolare le cellule embrionali e le cellule larvali dello stadio successivo.

In questo studio, abbiamo mostrato l'esempio di interazione tra spunto meccanico e orientamento di divisione cellulare, ma la comunicazione cellulare-cellula è mediata anche da segnali chimici come Wnt23, Notch24, adezione recettori accoppiati25 e così via. È importante sottolineare che il metodo di preparazione delle perline qui presentato può accoppiare le perline con qualsiasi proteina, consentendo così la ricostituzione di segnali chimici. Studi precedenti hanno anche usato perline sepharose26 e perline magnetiche27 proteiche rivestite con proteina Wnt per dimostrare i processi di sviluppo dipendenti da Wnt. Tuttavia, queste perline non sono disponibili in commercio in varie dimensioni rispetto alle perle in polistirolo modificate dal carboxylato. Quindi, la ricerca futura può utilizzare il metodo presentato come piattaforma per testare il ruolo di entrambi i segnali chimici e fisici in modi più regolabili. Nel loro insieme, questo metodo è adatto per i ricercatori, che stanno studiando i comportamenti cellulari e le risposte che derivano da modelli di contatto delle cellule spaziali e desiderano eliminare altri segnali cellulari.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Ringraziamo James Priess e Bruce Bowerman per la consulenza e la fornitura di ceppi C. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto, e Life Sciences Institute Imaging Core Facility per la condivisione di attrezzature e reagenti, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim per la manutenzione di C. elegans e la lettura critica del nostro manoscritto. Il nostro lavoro è supportato dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Alfa Aesar AAA1080703 For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) KISKER Biotech PPS-30.0COOHP For the bead preparation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals) Fisher BioReagents BP300-100 For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder Fisher BioReagents BP665-1 For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer Molecular Probes R6160 For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. Intelligent Imaging Innovation N.A. For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

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References

  1. Herman, M. Hermaphrodite cell-fate specification. WormBook. (2006).
  2. Rose, L., Gonczy, P. Polarity establishment, asymmetric division and segregation of fate determinants in early C. elegans embryos. WormBook. (2014).
  3. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences. 314, (1165), 1 (1986).
  4. Mango, S. The C. elegans pharynx: a model for organogenesis. WormBook. (2007).
  5. McGhee, J. The C. elegans intestine. WormBook. (2007).
  6. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and Manipulation of Embryonic Cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  7. Stein, K. K. The C. elegans eggshell. WormBook. (2018).
  8. Quash, G., et al. The preparation of latex particles with covalently bound polyamines, IgG and measles agglutinins and their use in visual agglutination tests. Journal of Immunological Methods. 22, (1), 165-174 (1978).
  9. Miller, J. V., Cuatrecasas, P., Brad, T. E. Purification of tyrosine aminotransferase by affinity chromatography. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 276, (2), 407-415 (1972).
  10. Sugioka, K., Bowerman, B. Combinatorial contact cues specify cell division orientation by directing cortical myosin flows. Developmental Cell. 46, (3), 257-270 (2018).
  11. Park, F. D., Priess, J. R. Establishment of POP-1 asymmetry in early C. elegans embryos. Development. 130, (15), 3547-3556 (2003).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  13. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7, (1), 27-41 (1998).
  14. Gillies, T. E., Cabernard, C. Cell Division Orientation in Animals. Current Biology. 21, (15), 599-609 (2011).
  15. Poulson, N. D., Lechler, T. Asymmetric cell divisions in the epidermis. International Review of Cell and Molecular Biology. 295, 199-232 (2012).
  16. Knoblich, J. A. Asymmetric cell division: recent developments and their implications for tumour biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, (12), 849-860 (2010).
  17. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, (4), 677-689 (2006).
  18. Dupont, S., et al. Role of YAP/TAZ in mechanotransduction. Nature. 474, (7350), 179-183 (2011).
  19. Schierenberg, E., Junkersdorf, B. The role of eggshell and underlying vitelline membrane for normal pattern formation in the early C. elegans embryo. Roux's Archives of Developmental Biology. 202, (1), 10-16 (1992).
  20. Wang, Z., Wang, D., Li, H., Bao, Z. Cell neighbor determination in the metazoan embryo system. Proceedings of the 8th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology, and Health Informatics. 305-312 (2017).
  21. Shaya, O., et al. Cell-cell contact area affects notch signaling and notch-dependent patterning. Developmental Cell. 40, (5), 505-511 (2017).
  22. Cao, J., et al. Comprehensive single cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357, (6352), 661-667 (2017).
  23. Goldstein, B., Takeshita, H., Mizumoto, K., Sawa, H. Wnt signals can function as positional cues in establishing cell polarity. Developmental Cell. 10, (3), 391-396 (2006).
  24. Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. (2005).
  25. Müller, A., et al. Oriented cell division in the C. elegans embryo is coordinated by G-protein signaling dependent on the adhesion GPCR LAT-1. PLOS Genetics. 11, (10), 1005624 (2015).
  26. Marston, D. J., Roh, M., Mikels, A. J., Nusse, R., Goldstein, B. Wnt signaling during Caenorhabditis elegans embryonic development. Methods in Molecular Biology. 469, 103-111 (2008).
  27. Habib, S. J., et al. A localized Wnt signal orients asymmetric stem cell division in vitro. Science. 339, (6126), 1445-1448 (2013).
In vitro ricostituzione dei modelli di contatto cellulare spaziale con <em>Caenorhabditis isolato elegans</em> Embrione Blastomeres e Perline in polistino adesivo
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Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).More

Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).

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