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Developmental Biology

単離されたカエノラブディティス・エレガンス胚ブラストミアと接着剤ポリスチレンビーズを用いた空間細胞接触パターンのインビトロ再構成

doi: 10.3791/60422 Published: November 26, 2019

Summary

多細胞系の組織複合体は、細胞外キューと個々の細胞挙動との因果関係の同定を混同した。ここでは、C.エレガンス胚ブラストメアと接着剤ポリスチレンビーズを用いて接触依存性キューと分割軸との直接的なリンクを研究する方法を提示する。

Abstract

多細胞系では、個々の細胞は、隣接する細胞や環境から来る様々な物理的および化学的手掛かりに囲まれています。この組織の複雑さは、外因性キューと細胞ダイナミクスとの間の因果関係の同定を混同する。合成再構成された多細胞システムは、研究者が他の人を排除しながら、特定の手掛かりをテストできるようにすることで、この問題を克服します。ここでは、単離されたカエノラブディティス・エレガンス・ブラストミアおよび接着剤ポリスチレンビーズを用いて細胞接触パターンを再構成する方法を提示する。手順は、卵殻除去、細胞細胞接着を破壊することによってブラストミア分離、粘着性ポリスチレンビーズの調製、および細胞細胞または細胞ビーズ接触の再構成を含む。最後に、この方法の応用により、胚の発達における空間細胞パターニングと細胞運命仕様の調節に寄与する細胞分裂軸の向きを調べる。この堅牢で再現性があり、多目的なin vitro法により、空間セル接触パターンと細胞応答との直接的な関係の研究が可能になります。

Introduction

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多細胞発達の間、個々の細胞の細胞挙動(例えば、分裂軸)は、様々な化学的および物理的手掛かりによって指定される。個々の細胞がこの情報をどのように解釈し、それらが多細胞集合体を創発的性質として調節するかを理解することは、形態形成研究の究極の目標の一つです。モデル生物C.エレガンスは、細胞極性1、細胞分裂パターン1、細胞運命決定2、および神経配線3および有機新生4、5などの組織規模の調節などの形態形成の細胞レベル調節の理解に大きく寄与している。様々な遺伝的ツールがありますが、組織工学の方法は限られています。

C.エレガンス研究で最も成功した組織工学法は、古典的なブラストミア分離6である。C.エレガンス胚は卵殻および透過性バリア7に囲まれているので、その除去はこの方法の主要な手順の1つである。このブラストミア単離方法は、簡略化された方法で細胞細胞接触の再構成を可能にしますが、不要な手掛かりを排除することはできません。細胞接触は依然として機械的(例えば、接着性)と化学的手掛かりの両方を有し、それによってキューと細胞行動との因果関係を完全に分析する能力を制限する。

本論文で提示する方法は、リガンドとしてタンパク質を含む任意のアミン反応性分子に共有結合することができるカルボン酸修飾ポリスチレンビーズを使用する。特に、リガンドとしてローダミンRed-Xのアミン反応性を用いて、ビーズを細胞に視覚的に追跡可能かつ接着剤としました。リガンド分子のビーズ表面および第一級アミン基のカルボキシル基は、水溶性カルボジイミド1-エチル-3-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)8、9によって結合される。得られた接着剤ビーズは、機械的キューが細胞ダイナミクス10に及ぼす影響を可能にする。この技術を用いて、細胞分裂配向10に必要な機械的手掛かりを同定した。

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Protocol

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1. 接着剤ポリスチレンビーズの調製

注: このプロトコルは無菌技術を必要としません。

  1. 1.5 mLマイクロ遠心管内のカルボキシル酸変性ポリスチレンビーズの重量を10mg。
  2. ビーズを洗浄するには、2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液を1mLチューブに加えます。MES緩衝液はリン酸塩や酢酸塩を含まないので、カルボジイミドの反応性を低下させることができ、タンパク質カップリング反応に用いることが好適である。ビーズを混ぜるためにチューブをボルテックス。
  3. ベンチトップ遠心分離機を介して2,000 x gで60 sのチューブを回転させます。
  4. 慎重にバッファをピペットで取り出して上清を捨てます。
  5. 手順 1.2 ~ 1.4 に従って、MES バッファーを 1 mL 使用してビーズをもう一度洗います。
  6. 10 mgのEDACを含むMESバッファーをチューブに1mL加え、表面カルボキシル基を活性化します。ビーズを混ぜるためにチューブをボルテックス。
  7. 室温でチューブを15分間回転させてインキュベートします。
  8. 2,000 x gで 60 s のビーズをスピンダウンします。
  9. 慎重にバッファをピペットで取り出して上清を捨てます。
  10. ビーズを洗浄するには、リン酸緩衝生理食塩分(PBS)を1mLチューブに加えます。ビーズを混ぜるためにチューブをボルテックス。
  11. 2,000 x gで 60 s のチューブをスピンダウンします。
  12. 慎重にバッファをピペットで取り出して上清を捨てます。
  13. 手順 1.10~1.12 に従って、1 mL の PBS でビーズをもう一度洗います。
  14. 使用されるローダミンの最終的な濃度は、画像化される株に依存する。0.65 mM ローダミン Red-X 原液からローダミン Red-X の 1 mL、10 倍、1000 倍希釈シリーズを準備します。
  15. 各シリアル希釈チューブにビーズのピペット20°L。
  16. 室温でチューブを5分間回転させてインキュベートします。
  17. 手順1.10~1.12を繰り返して、1mLのPBSでビーズを2回洗浄します。
  18. チューブに1 mLのPBSを加え、4 °Cで最大6週間保存します。ライブイメージングに使用する顕微鏡でビーズの蛍光強度を確認します。ローダミン赤-Xコハク酸ジミジルエステルの適切な濃度は、撮像条件に依存する(図1)。
    注:ローダミンRed-X治療を行わないビーズは細胞に付着しません。ローダミン赤-Xは、蛍光マーカーならびに接着分子として機能する。正に帯電したローダミンRed-Xと負電荷プラズマ膜との間の静電気的相互作用は、接着の原因である。

2. 口ピペットの組み立て

  1. タイゴンチューブをそれぞれ長さ約25cmと40cmに広くカット(内径6.35mm)と狭い(内径3.175mm)(図2)。
  2. タイゴンチューブをポリテトラフルオロエチレン(PTFE)フィルター(0.2μmの細孔サイズ)で接続します(図2)。
  3. 市販のアスピレーターチューブを分解し、キャピラリーホルダーとマウスピースをそれぞれ狭くて広いタイゴンチューブの端に取り付けます(図2)。
    注:PTFEフィルタは、口のピペットを介して次亜塩素酸塩溶液の煙の吸入を防ぐために使用されました。

3. 胚ブラストミアの単離

メモ:漂白液の切断や接触を避けるため、手袋とラボコートを着用してください。

  1. マイクロキャピラリーの両端(容量;10°L)を左右の手で持たします。
  2. マイクロキャピラリーを両端に引っ張って張力を加え、バーナーの上に毛細血管の中心を持って2本の手で引っ張られた毛細血管を作ります(図3A)。
  3. 解剖顕微鏡下の鉗子で手で引っ張った毛細血管の先端をトリミングし、引っ張った毛細血管を口管装置に取り付ける(図2)。2種類のピペットを用意します。ピペットの先端開口部サイズは、胚移植および卵殻除去のためのC.エレガンス胚の短軸長(30μm)の約2倍と1倍である必要があります。
  4. ピペット45μLの卵塩溶液をマルチウェルスライドのウェル上に(図4A;底部)。
  5. 5-10大人C.エレガンスを卵塩溶液を含む井戸の上に置きます。
  6. 初期のC.エレガンス胚を得るためには、C.エレガンス体の左右に2本の針を配置し、針を互いにスライドさせて大人を粉々に切る(図4A;上回路図)。
  7. 次亜塩素酸塩溶液のピペット45μLを、卵塩溶液を含む井戸の隣の井戸に(図4B)。
  8. 次亜塩素酸塩溶液を含む井戸の隣のその後の3つの井戸にシェルトンの成長培地のピペット45μL(図4B)。
  9. 1細胞期および初期の2細胞期胚を、胚移植のための手描き毛細血管を用いてマウスピペットすることにより次亜塩素酸塩溶液に移す(図4B)。
  10. 40~55s待ちます。
  11. 次亜塩素酸塩溶液からシェルトンの成長培地に胚を移し、胚移植用の手描き毛細血管を用いてマウスピネットして胚を洗浄する(図4B)。
  12. 胚移植用の手描きキャピラリーをマウスピネットしてシェルトンの成長培地の新しい井戸に移して胚を再度洗浄する(図4B)。
  13. 洗浄した胚を、胚移植用の手描きキャピラリーでマウスピネットすることで、シェルトンの成長培地の新しい井戸に移します。卵殻除去に手描きのキャピラリーを使用して、ピペットを慎重に繰り返します(図4C/中間回路図)。卵殻が正常に除去されると、胚細胞はより球状になります(図4C;右)。
  14. 卵殻除去のための手描きキャピラリーで2細胞段階胚性芽球を穏やかに連続的にピペットで分離する(図4D)。

4. ブラストミアとビーズによる接触パターンの再構成

メモ:ビーズからの細胞の解離を避け、タイムリーな画像取得を容易にするために、イメージング顕微鏡の下で作業します。

  1. 反転顕微鏡を用いて観察するには、図5のように撮像室を用意する。
    1. カバースリップをカバースリップホルダーに置きます(図5A)。
    2. カバースリップの端にテープを貼って安定させます。テープ付きの側面は「背面」側です(図5A,B)。
    3. カバースリップホルダーを「前面」側に反転し、疎水性ペンでカバースリップに円を描きます(図5C)。
      注:胚が口のピペットによって操作可能である場合、任意のガラス底皿も動作します。
  2. 疎水性マーカーによって描画された円の中にシェルトンの成長培地を追加します(図5D)。
  3. 単離されたブラストミアを撮像室に移す。
  4. 胚移植用の手描きキャピラリーを使用して、化学的に機能化されたビーズの少量を分配する。
  5. ビーズが単離されたブラストミアに付着するまで、手描きの毛細血管に吹き込むことによって、ポリスチレンビーズの位置を制御します。
  6. 媒体の蒸発を避けるためにカバースリップを取り付ける(図5E)。ライブ イメージングを実行します。

5. 重要試薬の調製

  1. 卵塩溶液(10mL):5 M NaClの235 μLと2M KClの240°LをdH2Oの9525°Lと組み合わせます。
  2. 次亜塩素酸塩溶液(10mL):クロロックス(次亜塩素酸ナトリウム約7.5%を含む)を10 N NaOHの2.5 mL(次亜塩素酸ナトリウムの最終濃度は約5.625%)と組み合わせます。
    注:多くの公表された方法はキチナゲを用いてキチナスの卵殻を消化しているが、次亜塩素酸塩溶液11を用いた方法を採用した。チチナゼ活性のバッチ間の変動を回避することにより、この方法はより再現性と費用対効果の高いアプローチであると考えています。
  3. 0.81 mM イヌリン溶液 (40 mL)
    1. 0.2 gのイヌリンを dH2O の 40 mL に加えます。
    2. 溶解するオートクレーブ。
      注:4°Cで1ヶ月間保持します。
  4. 0.5 M MES バッファ(500 mL)
    1. 48.81gのMESを蒸留水400mL(dH2O)に溶解する。
    2. pH を 6.0 に調整します。
    3. dH2Oで総容積を500mLにします。
  5. PBS溶液(1 L)
    1. 10倍のPBS溶液を作製するには、pbSプレミックス粉末の1パッケージをdH2Oの1Lに溶解する。
    2. 10 倍の PBS 溶液を dH2O の 900 mL と組み合わせます。
  6. 5% ポリビニルピロリドン (PVP) 溶液 (4 mL)
    1. 滅菌条件下で、ショウジョウバエシュナイダーの培地の4 mLにPVPの0.2gを溶解する。
      注:常にティッシュ培養(TC)フードでシュナイダーのミディアムストックを開きます。4 °Cで1ヶ月間保管してください。
  7. 0.65 mM ローダミン レッド X ストックソリューション (2 mL)
    1. ローダミン赤-Xの体重1mg。
    2. 2 mL のジメチルスルホキシド (DMSO) を加えた溶解します。
    3. アリコートと-20°で保存します。
  8. シェルトン成長培地 (SGM) (10.25 mL)
    1. 滅菌条件下では、ショウジョウバエシュナイダーのミディアム8mL、PVP溶液1mL、イヌリン溶液1mL、基底培地イーグル(BME)ビタミン1mL、ペニシリンストレプトマイシン50μL、脂質100μLを一緒に濃縮します。
    2. 1.5 mLマイクロチューブにSGMのアリクォート325°L。
      注:4°Cで約1ヶ月間保管してください。
    3. ブラストミア単離の日に、175 μLの胎児ウシ血清(FBS)をSGMに加えます(総体積は500°L)。
      メモ:FBSは-20°Cに保管し、使用前に解凍してください。FBS は熱殺される必要はありません。

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Representative Results

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ビーズ調製のために、GFP-ミオシンIIおよびmCherry-ヒストンを発現するトランスジェニック株に対するローダミンRed-Xコハクシニルエステルの最適量を決定した(図1A-D)。細胞周期進行のマーカーとしてmCherryタグ付きヒストンを使用しました。ローダミン赤-XとmCherryの両方が561nmレーザーで照らされるため、ローダミンRed-X信号の最適強度は、細胞とビーズの同時イメージングを可能にするヒストンの強度に匹敵します。例えば、0.005μg/mLローダミンRed-Xコハジミジルエステルで処理したビーズからの蛍光シグナルは弱すぎてビーズを可視化できませんでした(図1A)。一方、5μg/mLローダミンRed-Xコハシニジルエステルで処理したビーズからの蛍光シグナルは、mCherry-histoneを画像化するには強すぎました(図1D)。0.5μg/mLローダミン赤-Xコハク酸ジミジルエステルは、この特定のトランスジェニック株に最適であると判断した(図1C)。

ブラストミア分離は、図4に示す手順に従って行った。実験を成功させるには、次の点に対処する必要があります。1)井戸の媒体は時間の経過とともに蒸発し、粘性になる。これは胚がガラス毛細血管や他の胚に付着するので、新鮮な媒体を含む新しい井戸を使用する必要があります。2)次亜塩素酸塩溶液では、胚が表面に浮遊する。従って、顕微鏡の倍率を下げ、胚の転写を容易にするために液滴の表面に焦点を合わせる。3)次亜塩素酸塩溶液の有効性は異なる場合があります。したがって、次亜塩素酸塩溶液に費やす胚の持続時間は、次亜塩素酸塩溶液の新しいバッチごとに試験されるべきである。4)ピペットに吹き込むために使用される強度を最小限に抑えるために、できるだけ胚に近い場所に口ピペットを置きますが、胚が吸い上げられるように近すぎないようにします(ビーズを取り付ける場合にも当てはまります)。5)卵殻除去後、胚は非常に繊細になります。したがって、口のピペットに加えられる力は、胚が破裂するのを防ぐためにわずかに下げる必要があります。6)口ピペットの長時間の使用はPTFEフィルタを湿らせ、7)2細胞期胚は、核が明確に形成された場合にのみ分離されるべきである(図4C、左回路図)。無傷の胚の細胞と比較して(図4A;右)、卵殻のない胚の細胞は丸く見える(図4C;右)。さらに、ブラストミア単離後、ブラストメアの形状は球状になる(図4D;右)。

細胞分裂方向に対する物理的接触依存性キューの影響を調べるように、2細胞段階から単離されたABブラストミアにローダミンRed-X被覆ビーズを取り付け、生イメージングを行った(図6、図7)。ローダミンRed-X処理を行わないビーズはブラストメアに付着せず、ローダミンRed-Xが蛍光マーカーと接着分子の両方として機能することを示唆した。細胞分裂方向の解析では、ImageJ12の「3Dプロジェクト」機能を用いてタイムラプス画像を3D再構成しました(図6AはY軸を中心に傾いています)。有糸分裂スピンドル(スピンドル平面)を含む平面を決定するために、まず2つのセントロソームが垂直に位置合わせされた平面を特定しました(図6B;110°):この平面の±90°角度の平面はスピンドル平面です(図6B;-20°)。次に、サイトカインシス後の細胞ビーズ接触界面(接触方向)に対する紡錘(スピンドル方位)の角度を測定した(図6C)。両方の娘細胞をビーズに取り付けると、両方の接触部位を通過する線が接触方向として使用された。

これまでの研究では、ビーズ誘発AB細胞分裂方向10の間の異方性細胞表面ミオシンフローを同定した。しかしながら、配向分裂時に細胞が移動するにつれて細胞内ミオシンの流れを測定することは困難である。これを行うには、まず、イメージング平面(xy平面)に位置合わせされたスピンドルを持つサンプルを選択しました(図7)。第2に、Zスタックは最大投影法を用いて投影された(図7)。第3に、セルの動きは、リジッドボディオプションを持つImageJのサブピクセル登録アルゴリズムスタックregプラグイン13を使用して修正されました(図7B)。画像の登録により、細胞の位置が安定した(図7B)。最後に、ImageJの手動追跡プラグインを使用して、ミオシン病巣を追跡しました(図7C)。座標情報によれば、分割軸に沿ったミオシンの速度、及びそれに垂直な軸は、サイトカイン症発症後50秒以内に算出した。

Figure 1
図1:ローダミン赤-X濃度の決定(A-D)GFP-ミオシン(緑色)およびmCherry-ヒストン(マゼンタ)を発現する胚を、異なる濃度のロダミンRed-X(マゼンタ)と結合したビーズの近くに配置した。mCherryおよびローダミン赤-Xの信号強度は、白い点線(下図)に沿ってプロットされます。ビーズとヒストンシグナルは、0.5μg/mLローダミンRed-Xで処理されたビーズについて明確に検出されました。縮尺記号には 10 μm が表示されます。

Figure 2
図2:口のピペットの組み立て口ピペットは、狭い(1)と広い(2)タイゴンチューブをPTFEフィルター(3)と接続して組み立てられる。狭くて広いタイゴン管の端には、キャピラリーホルダー(4)とマウスピース(5)がそれぞれ取り付けられました。手描きのガラス毛細血管(6)は、キャピラリーホルダーに挿入することができる。スケールバーは50mmです。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:ブラストミア分離(A) ガラス毛細血管の手引き。(B) 胚移植用の手描きガラス毛細血管。(C) 卵殻除去用の手描きガラス毛細血管。(D)卵殻除去のための毛細管開口部の適切なサイズを示す模式図。矢印は胚を示す。スケールバーには100μmが表示されます。

Figure 4
図 4: ブラストミア分離ワークフロー(A)胚を得るために卵塩緩衝液中の成人C.エレガンスの解剖。写真は卵殻除去前の2細胞および4細胞期胚を示す。(B)次亜塩素酸塩処理および洗浄。(C) 回路図は、卵殻除去の適切なタイミングを表しています。写真は卵殻除去後の4細胞期胚を示す。(D) ブラストミア分離。写真は分離された2細胞期胚を示す。C と D の矢印のサイズは、ピペット処理中に必要な相対的な力を示します。縮尺記号には 50 μm が表示されます。

Figure 5
図5:撮像室の組み立て(A) カバースリップホルダーにカバースリップを取り付ける。(B) カバースリップホルダーの画像。組み立て前後のカバースリップホルダーは、それぞれ左右に表示されます。(C) 疎水性ペンを介して描かれた円。(D) シェルトンの成長培地とサンプルを円内に添加する。(E) 蒸発を避けるためにカバースリップを取り付ける。縮尺記号には 50 mm が表示されます。

Figure 6
図6:細胞分裂方向の解析(A) 細胞分裂配向解析の図。(B) スピンドル平面の決定。左の画像は、サンプルの例を示しています。3D再構成された4次元ムービーをY軸を中心に回転させ、2つのセントロソームが垂直に整列する平面を決定した(右画像;右上の回路図)。この例では、スピンドル平面は±90°の110°(中央の画像、右下の回路図)です。(C) 細胞ビーズ接触に対する紡錘の向きの測定。スピンドル平面の画像を用いて、サイトカイン症後のスピンドル方位は、2つのセントロソーム(右の回路図のオレンジ色の点線)とセル接触(青い点線)を結ぶ線間の角度に基づいて決定した。両方の娘細胞がビーズに取り付けられたとき、セルビーズ接触方向は、両方の接触部位を通過する線であった。緑はミオシンとセントロソーム、マゼンタはヒストンとビーズです。スケール バーは 10 μm です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:ミオシン流れの解析(A)ミオシン流れ解析の図。(B) 細胞分裂方向の補正。細胞内ミオシンフローダイナミクスを定量するために、ImageJプラグインスタックreg(リジッドボディオプション)を用いて分割セルの回転を補正した。上下のイメージは、スタック reg 処理の前後です。右のほとんどの画像は、時系列の時系列カラー コードを示しています。(C) ミオシン病巣の追跡スタックregによって処理された画像を使用して、個々のミオシン病巣の動きはImageJ手動追跡プラグインによって追跡されました。分割軸とそれに垂直な軸は、それぞれxとy(右の回路図)として定義された。x軸及びy軸(Vx及びVy)におけるミオシン流速度は、座標情報に従って測定した。スケール バーは 10 μm です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

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簡略化された細胞接触パターンの再構成により、研究者は形態形成のさまざまな側面における特定の細胞接触パターンの役割をテストすることができます。この技術を用いて、細胞分裂軸が接着ビーズ10との物理的接触によって制御されることを示した。分裂軸仕様は、形態形成14、幹細胞分裂15、16、および組織恒常性15、16に寄与することにより多細胞発達にとって重要であるため、この方法は、動物組織形成の新しいメカニズムを照らすことができるべきである。

細胞分裂の向きに加えて、この方法は機械的手掛かりと細胞運命との関係をテストするプラットフォームとなる可能性がある。以前の研究では、機械的なキューがセルの運命仕様を制御することを報告しました。ヒト間葉系幹細胞は、異なる剛性17を有する基質で培養した場合に、ニューロン、脂肪細胞、骨格筋細胞、および骨芽細胞に分化する。基質剛性に応答して、転写調節因子Yes関連タンパク質(YAP)およびTAZ(PDZ結合モチーフを有する転写共活性化剤)は核に転移し、細胞運命仕様18を調節する。本論文で提示する方法は、接着ビーズと接触する細胞を長期的に培養することにより、細胞運命仕様における機械的手掛かりの役割を試験するのにも有用であるべきである。

この方法は、生体内で観察される特定の機械的手掛かりを要約する際に制限がある。C.エレガンスでは、チチン性卵殻および透過性バリアは物理的制約として機能する。卵殻の除去は正常な発達に影響を与えないが、卵殻および透過性バリアの両方を除去すると、異常パターン形成19をもたらす。卵殻と透過性バリアがない場合、細胞の形状はより球状になり、細胞と細胞卵殻の間の圧力が細胞の変形やパターニングにおいて重要な役割を果たすることを示唆している。実際、細胞間圧迫力は、細胞分裂方向20を調節することが提案されている。組織間に物理的な制約と高圧を持たずに、この方法は生体内細胞接触領域においても再現できないと期待する。細胞接触領域がノッチシグナリング21に影響を与することが知られているので、この制限は、特定の機械的または化学的手掛かりがこのin vitro法を使用して動作しない場合にさらに考慮する必要がある。

これまでに、単離されたAB、P1、EMS、P2、ABa、ABp細胞(細胞は6細胞までの細胞)の細胞分裂方向を手の中で10個まで試験してきましたが、個々の細胞を単離できる限り、その方法を後の開発に応用することができます。最近の単一細胞シーケンシング研究では、ワーム体のプロナーゼ消化を用いた幼虫細胞22を単離している。したがって、潜在的に1つは、後の段階胚細胞および幼虫細胞を単離するためにプロナーゼ治療を使用することができる。

本研究では、機械的手掛かりと細胞分裂配向との相互作用の例を示したが、細胞間通信はWnt23、ノッチ24、接着共役受容体25などの化学的手掛かりによっても媒介される。重要なことに、ここで提示されるビーズ調製方法は、ビーズを任意のタンパク質と結合させ、それによって化学的手掛かりの再構成を可能にする。これまでの研究では、Wntタンパク質でコーティングされたセファローズビーズ26とプロテインA磁気ビーズ27を使用して、Wnt依存性の発達過程を実証しています。しかしながら、これらのビーズは、カルボン酸変性ポリスチレンビーズに比べて種々のサイズで市販されていない。したがって、将来の研究は、より調整可能な方法で化学的および物理的な手掛かりの両方の役割をテストするためのプラットフォームとして提示された方法を使用することができます。この方法を組み合わせることで、空間的な細胞接触パターンに起因する細胞の挙動や応答を研究し、他の細胞の手がかりを排除したい研究者に適しています。

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Disclosures

著者らは利益相反を宣言しない。

Acknowledgments

ジェームズ・プライスとブルース・バウアーマンのアドバイスとC.エレガンス株、ドン・モアマン、水本康太、ライフサイエンス研究所イメージングコア施設の機器と試薬を共有し、アオイ・ヒロヤス、リサ・フェルナンド、ミン・ジー・キムがC.エレガンスのメンテナンスと原稿の批判的な読み物を提供してくれたことに感謝します。当社の研究は、カナダ自然科学工学研究会議(NSERC)(RGPIN-2019-04442)によってサポートされています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Alfa Aesar AAA1080703 For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) KISKER Biotech PPS-30.0COOHP For the bead preparation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals) Fisher BioReagents BP300-100 For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder Fisher BioReagents BP665-1 For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer Molecular Probes R6160 For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. Intelligent Imaging Innovation N.A. For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

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References

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単離された<em>カエノラブディティス・エレガンス</em>胚ブラストミアと接着剤ポリスチレンビーズを用いた空間細胞接触パターンのインビトロ再構成
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Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).More

Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).

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