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Developmental Biology

In Vitro Reconstituição de Padrões de Contato celular espacial com caenorhabditis isolado elegans embrião blastômeros e contas adesivas de poliestireno

doi: 10.3791/60422 Published: November 26, 2019

Summary

As complexidades dos tecidos dos sistemas multicelulares confundem a identificação da relação causal entre pistas extracelulares e comportamentos celulares individuais. Aqui, apresentamos um método para estudar a ligação direta entre pistas dependentes de contato e eixos de divisão usando blastômeros de embriões c. elegans e contas de poliestireno adesivo.

Abstract

Em sistemas multicelulares, as células individuais são cercadas pelas várias pistas físicas e químicas provenientes de células vizinhas e do meio ambiente. Esta complexidade do tecido confunde a identificação da ligação causal entre sugestões extrínsecas e dinâmica celular. Um sistema multicelular reconstituído sinteticamente supera esse problema, permitindo que os pesquisadores testem uma sugestão específica, eliminando outros. Aqui, apresentamos um método para reconstituir padrões de contato celular com caltídeos elegans elegans isolados de Caenorhabditis e contas de poliestireno adesivas. Os procedimentos envolvem remoção de casca de ovo, isolamento blastômero interrompendo a adesão célula-célula, preparação de contas adesivas de poliestireno e reconstituição do contato célula-célula ou contas celulares. Finalmente, apresentamos a aplicação deste método para investigar a orientação de eixos de divisão celular que contribui para a regulação do padrão celular espacial e especificação do destino celular no desenvolvimento de embriões. Este método in vitro robusto, reproduzível e versátil permite o estudo de relações diretas entre padrões de contato de células espaciais e respostas celulares.

Introduction

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Durante o desenvolvimento multicelular, os comportamentos celulares (por exemplo, eixo de divisão) de células individuais são especificados por várias pistas químicas e físicas. Para entender como a célula individual interpreta essa informação, e como eles regulam a montagem multicelular como uma propriedade emergente é um dos objetivos finais dos estudos de morgênese. O organismo modelo C. elegans contribuiu significativamente para a compreensão da regulação celular da morgênese, como a polaridade celular1,a divisão celular padrão1,a decisão do destino celular2,e regulamentos em escala de tecido, como fiação neuronal3 e organogênese4,5. Embora existam várias ferramentas genéticas disponíveis, os métodos de engenharia de tecidos são limitados.

O método de engenharia de tecidos mais bem sucedido no estudo de C. elegans é o isolamento clássico blastômero6; como o embrião c. elegans é cercado por uma casca de ovo e uma barreira de permeabilidade7,sua remoção é um dos principais procedimentos deste método. Embora este método de isolamento blastômero permita a reconstituição do contato célula-célula de forma simplificada, ele não permite a eliminação de pistas indesejadas; o contato celular ainda coloca pistas mecânicas (por exemplo, adesão) e químicas, limitando assim nossa capacidade de analisar completamente a relação causal entre a sugestão e o comportamento celular.

O método apresentado neste artigo usa contas de poliestireno modificadas carboxilaquela que podem se ligar covalentemente a quaisquer moléculas reativas de amina, incluindo proteínas como ligantes. Particularmente, usamos uma forma reativa amina de Rhodamine Red-X como um ligante para fazer contas visualmente rastreáveis e adesivos para a célula. Os grupos de carboxyl de superfície de contas e grupos primários de amina de molécula de ligand são acoplados por carbodiimide solúvel em água 1-etil-3-(dimetilaminopropyl) carbodiimide (EDAC)8,9. As contas adesivas obtidas permitem os efeitos da sugestão mecânica na dinâmica celular10. Usamos esta técnica para identificar pistas mecânicas necessárias para a orientação da divisão celular10.

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Protocol

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1. Preparação de contas de poliestireno adesiva

NOTA: Este protocolo não requer técnica asséptica.

  1. Pese 10 mg de contas de poliestireno modificadas carboxila em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Para lavar as contas, adicione 1 mL de 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic (MES) buffer no tubo. Uma vez que o tampão mes não contém fosfato e acetato, o que pode reduzir a reatividade da carbodiimida, é adequado para uso na reação de acoplamento de proteínas. Vortex o tubo para misturar as contas.
  3. Gire o tubo para 60 s em 2.000 x g através de uma centrífuga bancada.
  4. Descarte o supernatant com cuidado pipetting para fora o amortecedor.
  5. Lave as contas novamente com 1 mL de buffer MES seguindo etapas 1.2-1.4.
  6. Adicione 1 mL de buffer MES contendo 10 mg de EDAC no tubo para ativar os grupos de carboxyl superfície. Vortex o tubo para misturar as contas.
  7. Gire e incubar o tubo por 15 min à temperatura ambiente.
  8. Desça as contas para 60 s em 2.000 x g.
  9. Descarte o supernatant com cuidado pipetting para fora o amortecedor.
  10. Para lavar as contas, adicione 1 mL de soline tampão de fosfato (PBS) no tubo. Vortex o tubo para misturar as contas.
  11. Desça o tubo para 60 s em 2.000 x g.
  12. Descarte o supernatant com cuidado pipetting para fora o amortecedor.
  13. Lave as contas novamente com 1 mL de PBS, seguindo etapas 1.10-1.12.
  14. A concentração final de Rhodamine usado dependerá da tensão que está sendo imaged. Prepare 1 mL de 1-, 10-, 100-, e 1000 vezes série de diluição de Rhodamine Red-X a partir da solução de estoque 0,65 mM Rhodamine Red-X.
  15. Pipeta 20 μL de contas em cada tubo de diluição serial.
  16. Gire e incubar o tubo por 5 min à temperatura ambiente.
  17. Lave as contas duas vezes com 1 mL de PBS, repetindo passos 1.10-1.12.
  18. Adicione 1 mL de PBS no tubo e armazená-lo em 4 °C por até 6 semanas. Verifique a intensidade da fluorescência das contas um microscópio usado para imagens vivas. A concentração adequada do esulênio succinimidyl Rhodamine é dependente das condições de imagem (Figura 1).
    NOTA: Contas sem tratamento Rhodamine Red-X não aderem à célula. Rhodamine Red-X serve como marcador de fluorescência, bem como molécula adesiva. A interação eletroestática entre rhodamine Red-X carregada positivamente e membrana plasmática carregada negativamente é uma causa putativa de adesão.

2. Montagem da pipeta da boca

  1. Corte de largura (6,35 mm de diâmetro interno) e estreito (3.175 mm de diâmetro interno) tubos Tygon para cerca de 25 cm e 40 cm de comprimento, respectivamente (Figura 2).
  2. Conecte os tubos Tygon com um filtro de politetrafluoroetileno (PTFE) (0,2 μm tamanho poros) (Figura 2).
  3. Desmonte um tubo aspirador comercialmente disponível e anexe seu suporte capilar e porta-voz ao final dos tubos Tygon estreitos e largos, respectivamente (Figura 2).
    NOTA: Ptfe filtro foi usado para evitar a inalação de fumos de solução de hipoclorite via pipeta boca.

3. Isolamento de blastômeros embriões

NOTA: Use luvas e jaleco para evitar o corte e contato com a solução de branqueamento.

  1. Segure cada extremidade de um microcapilar (capacidade; 10 μL) com a mão direita e esquerda.
  2. Puxe o microcapilar para ambas as extremidades para aplicar tensão e trazer o centro do capilar sobre um queimador para fazer dois capilares puxados à mão (Figura 3A).
  3. Apare as pontas dos capilares puxados à mão com fórceps o microscópio dissecando e coloque o capilar puxado em um aparelho de pipetting boca (Figura 2). Prepare dois tipos de pipetas. Os tamanhos de abertura da ponta para as pipetas devem ser de aproximadamente 2x e 1x o comprimento curto do eixo dos embriões c. elegans (30 μm) para a transferência de embriões e remoção de casca de ovo, respectivamente Figura 3B-D).
  4. Pipeta 45 μL de solução de sal de ovo em um poço de um slide multiwell(Figura 4A; inferior).
  5. Coloque 5-10 c. elegans adulto em uma solução de sal de ovo bem contendo.
  6. Para obter embriões adiantados de C. elegans, corte adultos em partes posicionando duas agulhas à direita e à esquerda do corpo de C. elegans e deslizando as agulhas após se (Figura 4A;esquema superior).
  7. Pipeta 45 μL de solução de hipoclorocto em um poço ao lado do bem contendo solução de sal ovo(Figura 4B).
  8. Pipette 45 μL do meio de crescimento de Shelton para os três poços subsequentes ao lado do poço contendo solução hipoclorite (Figura 4B).
  9. Transfira embriões em estágio de 1 célula e estágio inicial de 2 células para a solução de hipocloro, atubulaçando a boca com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões (Figura 4B).
  10. Aguarde 40-55 s.
  11. Lave os embriões transferindo os embriões da solução de hipoclorocto para o meio de crescimento de Shelton por tubulação bucal com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões (Figura 4B).
  12. Lave os embriões novamente, transferindo os embriões para um novo poço do meio de crescimento de Shelton por tubulação bucal com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões (Figura 4B).
  13. Transfira os embriões lavados para um novo poço do meio de crescimento de Shelton pela boca tubulação com o capilar desenhado à mão para transferência de embriões. Usando o capilar desenhado à mão para remoção de casca de ovo, repita cuidadosamente o pipetting (Figura 4C; esquema médio). Se a casca de ovo for removida com sucesso, as células embrionárias se tornarão mais esféricas(Figura 4C;à direita).
  14. Separe os blastômeros embrionários em estágio de 2 células, tubulação suave e continuamente com o capilar desenhado à mão para remoção de casca de ovo (Figura 4D).

4. Reconstituição de padrões de contato com blastômero e contas

NOTA: Trabalhe o microscópio de imagem para evitar a dissociação de uma célula de uma conta e para facilitar a aquisição oportuna de imagem.

  1. Para observar usando um microscópio invertido, prepare uma câmara de imagem como na Figura 5.
    1. Coloque um coverslip em um titular coverslip(Figura 5A).
    2. Fita as bordas do coverslip para estabilizá-lo. O lado com fita é o lado 'de trás' (Figura 5A,B).
    3. Vire o suporte coverslip para o lado 'frente' e desenhar um círculo no coverslip com uma caneta hidrofóbica (Figura 5C).
      NOTA: Qualquer prato com fundo de vidro também funciona, desde que os embriões são manipuláveis pela pipeta da boca.
  2. Adicione o meio de crescimento de Shelton dentro do círculo desenhado pelo marcador hidrofóbico(Figura 5D).
  3. Transfira o blastômero isolado para a câmara de imagens.
  4. Dispense um pequeno volume de contas quimicamente funcionalizadas usando o capilar desenhado à mão para transferência de embriões.
  5. Controle a posição das contas de poliestireno soprando no capilar desenhado à mão até que a conta se apega ao blastômero isolado.
  6. Monte um coverslip para evitar a evaporação do meio (Figura 5E). Realizar imagens ao vivo.

5. Preparação de importantes reagentes

  1. Solução de sal ovo (10 mL): Combine 235 μL de 5 M NaCl e 240 μL de 2 M KCl com 9525 μL de dH2O.
  2. Solução de Hipocloroto (10 mL): Combine 7,5 mL de Clorox (contendo aproximadamente 7,5% hipoclorite de sódio) com 2,5 mL de 10 N NaOH (concentração final de hipoclorite de sódio é de aproximadamente 5,625%).
    NOTA: Embora muitos métodos publicados tenham usado chitinase para digerir cascas de ovos chitinosos, adotamos um método usando a solução de hipoclororia11. Ao evitar as variações lote-a-lote das atividades de chitinase, acreditamos que este método é uma abordagem mais reproduzível e econômica.
  3. 0,81 m Inulin Solution (40 mL)
    1. Adicione 0,2 g de Inulin a 40 mL de dH2O.
    2. Autoclave para dissolver.
      NOTA: Mantém por 1 mês a 4 °C.
  4. 0,5 M MES Buffer (500 mL)
    1. Dissolva 48,81 g de MES em 400 mL de água destilada (dH2O).
    2. Ajuste o pH para 6,0.
    3. Elevá-lo ao volume total para 500 mL com dH2O.
  5. Solução PBS (1 L)
    1. Para fazer a solução 10 vezes PBS, dissolva 1 pacote de pó pré-mix PBS em 1 L de dH2O.
    2. Combine 100 mL de 10 vezes solução PBS com 900 mL de dH2O.
  6. 5% Polyvinylpyrrolidone (PVP) Solução (4 mL)
    1. Em condições estéreis, dissolva 0,2 g de PVP em 4 mL do Medium de Drosophila Schneider.
      NOTA: Abra sempre o estoque médio de Schneider na capa da cultura do tecido (TC). Mantenha por 1 mês a 4 °C.
  7. 0,65 mM Rhodamine Solução de ações Red-X (2 mL)
    1. Pese 1 mg de Rhodamine Red-X.
    2. Adicione 2 mL de dimetil sulfoxida (DMSO) para dissolver.
    3. Aliquot e armazenar a -20 °C.
  8. Shelton's Growth Medium (SGM) (10,25 mL)
    1. Em condições estéreis, combinar 8 mL de Drosophila Schneider's Medium, 1 mL de solução PVP, 1 mL de solução inulina, 1 mL de Basal Medium Eagle (BME) Vitaminas, 50 μL de Penicilina-Estreptomicina, e 100 μL de concentrado lipídico juntos.
    2. Aliquot 325 μL de SGM em microtubos de 1,5 mL.
      NOTA: Mantenha por cerca de 1 mês a 4 °C.
    3. No dia do isolamento blastômero, adicione 175 μL de Fetal Bovine Serum (FBS) ao SGM (para volume total de 500 μL).
      NOTA: Armazenar FBS em -20 °C e descongelá-lo antes do uso. Fbs não precisa ser morto pelo calor.

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Representative Results

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Para a preparação de contas, determinamos a quantidade ideal de rhodamine Red-X succinimidyl éter para a cepa transgênica expressando GFP-miosina II e mCherry-histone (Figura 1A-D). Usamos o mCherry marcado histona como um marcador de progressão do ciclo celular. Como tanto rhodamine Red-X quanto mCherry serão iluminados por um laser de 561 nm, a intensidade ideal do sinal Rhodamine Red-X é comparável à de histona para permitir imagens simultâneas de células e contas. Por exemplo, o sinal de fluorescência da conta tratada com 0,005 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl ester era muito fraco para visualizar a conta (Figura 1A). Por outro lado, o sinal de fluorescência das contas tratadas com 5 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl ester era muito forte para imagem mCherry-histone (Figura 1D). Determinamos que 0,5 μg/mL Rhodamine Red-X succinimidyl é ideal para esta estirpe transgênica particular (Figura 1C).

O isolamento de Blastômeros foi realizado de acordo com os procedimentos mostrados na Figura 4. Os seguintes pontos devem ser abordados para experimentos bem-sucedidos. 1) A mídia no poço evapora ao longo do tempo e torna-se viscosa; isto faz com que os embriões furem ao capilar de vidro e aos outros embriões, assim que um poço novo com meios frescos precisa de ser usado. 2) Na solução de hipocloro, os embriões flutuam para a superfície. Portanto, diminuir a ampliação do microscópio e se concentrar na superfície da gotícula para facilitar com a transferência de embriões. 3) A eficácia da solução de hipoclorite pode diferir. Assim, a duração dos embriões gastos na solução hipoclita deve ser testada para cada novo lote de solução de hipocloroto feita. 4) Coloque a pipeta da boca o mais próximo possível do embrião para minimizar a força usada para soprar na pipeta, mas também não muito perto para que o embrião seja sugado também (isso também é verdade ao anexar contas). 5) Após a remoção da casca de ovo, os embriões tornam-se muito delicados. Assim, as forças exercidas sobre a pipeta da boca precisam ser ligeiramente reduzidas para evitar que os embriões estão estourando. 6) O uso prolongado da pipeta da boca pode amortecer o filtro PTFE, e 7) embriões de estágio de 2 células só devem ser separados quando o núcleo foi claramente formado (Figura 4C, esquemas esquerdos). Em comparação com as células em embriões intactos (Figura 4A; à direita), as células em embriões sem casca de ovo parecem mais redondas (Figura 4C;direita). Além disso, após o isolamento blastômero, a forma dos blastômeros se tornam esféricas(Figura 4D;à direita).

Para testar os efeitos da sugestão contato-dependente física na orientação da divisão da pilha, nós anexamos contas revestidas Rhodamine Vermelho-X aos blastômeros AB isolados do estágio de 2 pilhas e executamos live-imaging (Figura 6, Figura 7). A conta sem tratamento Rhodamine Red-X não aderiu aos blastômeros, sugerindo que o Rhodamine Red-X serve como um marcador de fluorescência e molécula adesiva. Para a análise da orientação da divisão celular, temos 3D reconstruído a imagem de lapso de tempo usando o "projeto 3D" função de ImageJ12 (Figura 6A; inclinando-se em torno de Y-eixo). Para determinar o plano contendo fuso mitocôtico (plano de fuso), identificamos pela primeira vez um avião onde dois centross estavam alinhados verticalmente(Figura 6B; 110°): o avião com ± 90° ângulo deste plano é plano de fuso (Figura 6B; -20°). Em seguida, medimos o ângulo de fuso (orientação de fuso) em relação à interface de contato de contas celulares (orientação de contato) após citocise(Figura 6C). Quando ambas as células filhas foram anexadas à conta, uma linha que passa ambos os locais de contato foi usada como orientação de contato.

Em nosso estudo anterior, identificamos um fluxo de miosina de superfície anisotrópica durante a orientação de divisão de células AB induzida por contas10. No entanto, é difícil medir o fluxo de miosina intracelular à medida que a célula se move durante a divisão orientada. Para realizar isso, primeiro selecionamos as amostras com fuso alinhado ao plano de imagem (xy plano) (Figura 7). Em segundo lugar, as pilhas Z foram projetadas usando o método máximo de projeção(Figura 7). Em terceiro lugar, os movimentos celulares foram corrigidos usando o algoritmo de registro subpixel Stack reg plug-in13 do ImageJ com opção de corpo rígido ( Figura7B). Pelo registro de imagens, a posição de celular foi estável(Figura 7B). Finalmente, usando o plug-in de rastreamento manual do ImageJ, os focos de miosina foram rastreados(Figura 7C). De acordo com as informações de coordenação, as velocidades da miosina ao longo do eixo de divisão e o eixo perpendicular a ela foram calculados dentro de 50 s após o início da citocina.

Figure 1
Figura 1: Determinação da concentração de Rhodamine Vermelho-X. (A-D) Embriões expressando GFP-miosina (verde) e mCherry-histone (magenta) foram colocados nas proximidades de contas ligadas com diferentes concentrações de Rhodamine Red-X (magenta). As intensidades de sinal de mCherry e Rhodamine Red-X são traçadas ao longo das linhas pontilhadas brancas (gráficos inferiores). As contas e os sinais de histona foram claramente detectados para contas tratadas com 0,5 μg/mL Rhodamine Red-X. Barras de escala mostram 10 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Montagem da pipeta da boca. A pipeta da boca é montada conectando tubos estreitos (1) e largos (2) Tygon com um filtro PTFE (3). No final do tubo Tygon estreito e largo, titular capilar (4) e peça boca (5) foram anexados, respectivamente. Um capilar de vidro desenhado à mão (6) pode ser inserido no suporte capilar. Barra de escala é de 50 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Isolamento blastômero. (A)Mão puxando de vidro capilar. (B)Capilar de vidro desenhado à mão para transferência de embriões. (C)Capilar de vidro desenhado à mão para remoção de casca de ovo. (D)Esquemáticamostra mostrando o tamanho adequado de abertura capilar para a remoção de casca de ovo. Flechas indicam embriões. Barras de escala mostram 100 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Fluxo de trabalho de isolamento blastômero. (A)Dissecação de C. elegans adulto no tampão de sal do ovo para obter embriões. Fotografias mostram embriões de estágio de 2 células e 4 células antes da remoção da casca de ovo. (B) Tratamento de hipocloroe. C) Os esquemas retratam o momento apropriado para a remoção da casca de ovo. A fotografia mostra um embrião de estágio de 4 células após a remoção da casca de ovo. (D)Separação blastomere. A fotografia mostra um embrião separado do estágio de 2 células. Tamanhos das flechas em C e D indicam as forças relativas necessárias durante o cachimbo. Barras de escala mostram 50 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: Montagem da câmara de imagem. (A)Anexando coverslip para o titular coverslip. Imagensde um suporte de deslizamento de capa. Titular coverslip antes e depois da montagem é indicado à esquerda e à direita, respectivamente. (C)Um círculo desenhado através de uma caneta hidrofóbica. (D)Adição do meio de crescimento de Shelton e amostra dentro do círculo. (E)Montagem de um coverslip para evitar a evaporação. Barras de escala mostram 50 mm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Análise da orientação da divisão celular. (A)Um diagrama de análise de orientação de divisão celular. (B)Determinação do avião fuso. As imagens esquerdas mostram um exemplo de uma amostra. Filmes 4D reconstruídos em 3D foram girados ao redor do eixo Y para determinar o plano em que dois centross se alinham verticalmente (imagem direita; esquema superior direito). Neste exemplo, o plano de fuso é ± 90° de 110° (imagem média; esquemas inferiores direitos). (C)Medição da orientação do eixo relativo ao contato do pilha-grânulo. Usando imagens do plano de fuso, orientação de fuso após citocina foi determinada com base no ângulo entre as linhas que ligam dois centros (linhas pontilhadas laranja nos esquemas certos) e contato celular (linhas pontilhadas azuis). Quando ambas as pilhas da filha foram unidas aos grânulos, a orientação do contato do pilha-grânulo era a linha que passa ambos os locais de contato. Verde é miosina e centrosome, magenta é histona e contas. As barras de escala são de 10 μm. Os tempos são minutos e segundos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 7
Figura 7: Análise do fluxo de miosina. (A)Um diagrama de análise de fluxo de miosina. (B) Correção da orientação da divisão celular. Para quantificar a dinâmica intracelular do fluxo de miosina, a rotação da célula divisória foi corrigida usando o reg de pilha de plugin saqueado ImageJ ( opçãode corpo rígido). As imagens superiores e inferiores são antes e depois do processamento do reg da pilha. A maioria das imagens mostra código de cores temporais da série time. (C)Rastreamento de foci miosina. Usando as imagens processadas pela Stack reg, os movimentos individuais de miosinas foci foram rastreados pelo plugin de rastreamento do Manual ImageJ. O eixo de divisão e o eixo perpendicular a ele foram definidos como x e y, respectivamente (esquema direito). As velocidades de fluxo de miosina no eixo x e y (Vx e Vy) foram medidas de acordo com as informações de coordenação. As barras de escala são de 10 μm. Os tempos são minutos e segundos. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

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A reconstituição de padrões simplificados de contato celular permitirá que os pesquisadores testem os papéis de padrões específicos de contato celular em diferentes aspectos da morfogênese. Usamos essa técnica para mostrar que o eixo da divisão celular é controlado pelo contato físico com contas adesivas10. Como a especificação do eixo de divisão é crucial para o desenvolvimento multicelular, contribuindo para a morfogênese14,divisão de células-tronco15,16,e homeostase de tecido15,16, este método deve ser capaz de iluminar um novo mecanismo de formação de tecido animal.

Além da orientação de divisão celular, este método tem um potencial para ser uma plataforma para testar a relação entre pistas mecânicas e destino celular. Estudos anteriores relataram que a sugestão mecânica controla a especificação do destino celular. As células-tronco mesenchymal humanas diferenciam-se em neurônios, adipócitos, células musculares esqueléticas e osteoblastos quando cultivadas em substrato com rigidez diferente17. Em resposta à rigidez do substrato, os reguladores transcricionais Proteína sim associada (YAP) e TAZ (co-ativador transcricional com motivo de ligação pdz) vai deslocar-se para o núcleo, para regular a especificação do destino celular18. O método apresentado neste artigo também deve ser útil para testar o papel das pistas mecânicas na especificação do destino celular, cultivando células de longo prazo em contato com contas adesivas.

Este método tem limitações na recapitulação de certas pistas mecânicas observadas in vivo. Em C. elegans,casca de ovo chitinoso e barreira permeabilidade servir como um limite físico. Embora a remoção da casca de ovo não afete o desenvolvimento normal, a remoção da barreira da casca de ovo e da permeabilidade conduz à formação anormais do teste padrão19. Na ausência de casca de ovo e barreira de permeabilidade, a forma celular torna-se mais esférica, sugerindo que a pressão entre as células e a casca de ovo celular desempenha um papel crítico na deformação celular e no padrão. Na verdade, as forças de espremendo de células celulares foram propostas para regular a orientação da divisão celular20. Sem ter restrição física e pressão putativa entre os tecidos, esperamos que este método também não possa recapitular na área de contato celular vivo. Como a área de contato celular é conhecida por afetar notch sinalização21,esta limitação precisa ser ainda mais considerada quando certas pistas mecânicas ou químicas não funciona usando este método in vitro.

Até agora, testamos a orientação da divisão celular de AB isolado, P1, EMS, P2, ABa, células ABp (células de até 6 estágios celulares) em nossas mãos10, mas o método pode ser aplicado para o desenvolvimento posterior, tanto quanto células individuais podem ser isoladas. Estudo recente de sequenciamento de células únicas tem usado digestão de pronase do corpo de vermes para isolar a célula larval22. Portanto, potencialmente se pode usar o tratamento de pronase para isolar células embrionárias em estágio posterior e células larvais.

Neste estudo, mostramos o exemplo de interação entre a sugestão mecânica e orientação de divisão celular, mas a comunicação célula-célula também é mediada por pistas químicas como Wnt23, Notch24, adesão receptores acoplados25 e assim por diante. Importante, o método de preparação de contas apresentado aqui pode acoplar as contas com quaisquer proteínas, permitindo assim a reconstituição de pistas químicas. Estudos anteriores também usaram contas Sepharose26 e proteína-A conta magnética27 revestida com proteína Wnt para demonstrar processos de desenvolvimento dependentes de Wnt. Entretanto, estes grânulos não estão comercialmente disponíveis em vários tamanhos comparados aos grânulos modificados carboxylate do poliestireno. Assim, pesquisas futuras podem usar o método apresentado como uma plataforma para testar o papel de pistas químicas e físicas de maneiras mais tunable. Tomados em conjunto, este método é adequado para os pesquisadores, que estão estudando comportamentos celulares e respostas que resultam de padrões de contato celular espacial e desejam eliminar outras pistas celulares.

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Disclosures

Os autores declaram nenhum conflito de interesses.

Acknowledgments

Agradecemos a James Priess e Bruce Bowerman por conselhos e fornecendo cepas de C. elegans, Don Moerman, Kota Mizumoto e Life Sciences Institute Imaging Core Facility por compartilhar equipamentos e reagentes, Aoi Hiroyasu, Lisa Fernando, Min Jee Kim para a manutenção de C. elegans e leitura crítica de nosso manuscrito. Nosso trabalho é apoiado pelo Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC), (RGPIN-2019-04442).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride Alfa Aesar AAA1080703 For the bead preparation
Aspirator Tube Assembly Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation.
Caenorhabditis elegans strain: N2, wild-type Caenorhabditis Genetics Center N2 Strain used in this study
Caenorhabditis elegans strain: KSG5, genotype: zuIs45; itIs37 in house KSG5 Strain used in this study
Calibrated Mircopipets, 10 µL Drummond 21-180-13 For the blastomere isolation
Carboxylate-modified polystyrene beads (30 µm diameter) KISKER Biotech PPS-30.0COOHP For the bead preparation
CD Lipid Concentrate Life Technologies 11905031 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Clorox Clorox N. A. For the blastomere isolation. Open a new bottle when the hypochlorite treatment does not work well.
Coverslip holder In house N.A. For the blastomere isolation.
Dissecting microscope: Zeiss Stemi 508 with M stand. Source of light is built-in LED. Magnification of eye piece is 10X. Carl Zeiss Stemi 508 For the blastomere isolation.
Fetal Bovine Serum, Qualified One Shot, Canada origin Gibco A3160701 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
General Use and Precision Glide Hypodermic Needles, 25 gauge BD 14-826AA For the blastomere isolation
Inulin Alfa Aesar AAA1842509 For the blastomere isolation
MEM Vitamin Solution (100x) Gibco 11120052 For the blastomere isolation.
MES (Fine White Crystals) Fisher BioReagents BP300-100 For the bead preparation
Multitest Slide 10 Well MP Biomedicals ICN6041805 For the blastomere isolation
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10 x Powder Fisher BioReagents BP665-1 For the bead preparation
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140148 For the blastomere isolation.
Polyvinylpyrrolidone Fisher BioReagents BP431-100 For the blastomere isolation
Potassium Chloride Bioshop POC888 For the blastomere isolation
Rhodamine Red-X, Succinimidyl Ester, 5-isomer Molecular Probes R6160 For the bead preparation
Schneider’s Drosophila Sterile Medium Gibco 21720024 For the blastomere isolation. Work in the tissue culture hood.
Sodium Chloride Bioshop SOD001 For the blastomere isolation
Sodium Hydroxide Solution, 10 N Fisher Chemical SS255-1 For the blastomere isolation
Spinning disk confocal microscope: Yokogawa CSU-X1, Zeiss Axiovert inverted scope, Quant EM 512 camera, 63X NA 1.4 Plan apochromat objective lens. System was controlled by Slidebook 6.0. Intelligent Imaging Innovation N.A. For live-imaging
Syringe Filters, PTFE, Non-Sterile Basix 13100115 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 3.175 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-862 For the blastomere isolation.
Tygon S3 Laboratory Tubing,, Formulation E-3603, Inner diameter 6.35 mm Saint Gobain Performance Plastics 89403-854 For the blastomere isolation.

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References

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In Vitro Reconstituição de Padrões de Contato celular espacial com <em>caenorhabditis isolado elegans</em> embrião blastômeros e contas adesivas de poliestireno
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Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).More

Hsu, C. R., Xiong, R., Sugioka, K. In Vitro Reconstitution of Spatial Cell Contact Patterns with Isolated Caenorhabditis elegans Embryo Blastomeres and Adhesive Polystyrene Beads. J. Vis. Exp. (153), e60422, doi:10.3791/60422 (2019).

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