Summary
هنا ، نقدم طريقه باستخدام يدعم غشاء نفاذيه لتسهيل دراسة عدم الاتصال الإشارات paracrine المستخدمة من قبل الخلايا السرطانية لقمع الاستجابة المناعية. النظام قابل لدراسة دور العوامل التي تفرز الورم في تنشيط الضامة الملطف.
Abstract
الإشارات paracrine المستمدة من الورم هو عنصر التغاضي عن كبت المناعة المحلية ويمكن ان يؤدي إلى بيئة متساهلة لاستمرار نمو السرطان والانبثاث. يمكن ان تتضمن إشارات paracrine اتصال خليه خليه بين أنواع الخلايا المختلفة ، مثل PD-L1 المعرب عنها علي سطح الأورام تتفاعل مباشره مع PD-1 علي سطح الخلايا T ، أو إفراز الليغاندس بواسطة خليه الورم للتاثير علي خليه مناعية. هنا نقوم بوصف طريقه الثقافة المشتركة للتحقيق في اثار الأورام التي يفرزها الورم علي تنشيط الخلية المناعية (الضامة). هذا الاجراء المباشر يستخدم المتاحة تجاريا 0.4 μm غشاء البولي يدعم نفاذيه ولوحات ثقافة الانسجه القياسية. في العملية الموصوفة ، يتم استزراع الضامة في الغرفة العليا والخلايا السرطانية في الغرفة السفلي. وجود حاجز 0.4 μm يسمح لدراسة الإشارات بين الخلايا دون متغير الخلط من الاتصال المادي ، وذلك لان نوعي الخلية تشترك في نفس المتوسط والتعرض للحجاب paracrine. ويمكن الجمع بين هذا النهج والآخرين ، مثل التغييرات الجينية في الضامة (علي سبيل المثال ، العزلة عن الفئران الوراثية) أو الورم (علي سبيل المثال ، التعديلات التي تتم بوساطة CRISPR) لدراسة دور العوامل والمستقبلات المحددة التي تفرزها. ويفسح النهج نفسه أيضا للتحليلات البيولوجية الجزيئية القياسية مثل النسخ العكسي الكمي لتفاعل البلمره المتسلسل (qRT-PCR) أو تحليل اللطخه الغربية ، دون الحاجة إلى الفرز الانسيابي للفصل بين الخليتين السكانيتين. المثل يمكن استخدام المقايسات المناعية المرتبطة بالانزيمات (ELISAs) لقياس الخلايا المفرزة لفهم التفاعل الديناميكي لإشارات الخلية في سياق نوع الخلية المتعددة بشكل أفضل. ويمكن أيضا ان تختلف مده الثقافة المشتركة لدراسة الاحداث المنظمة زمنيا. هذه الطريقة المشتركة للثقافة هي أداه قويه تسهل دراسة الإشارات التي تفرز الورم في السياق المناعي.
Introduction
وقد ركزت الدراسات الحديثة علي قدره الخلايا السرطانية لتجنب الكشف عن طريق الخلايا المناعية ، وقمع التنشيط المناعي المحلي ، أو لإنتاج البيئة السرطانية المتسامحة التسامح في الورم المجهري. وقد وصفت فئتين واسعه من التفاعلات الورم والخلايا المناعية التي تسهل هذه الآثار: التفاعلات بوساطة الاتصال أو الأورام التي تفرز الورم. واحده من أكثر أليات المدروسة والعريكة سريريا لتثبيط المناعة بوساطة الاتصال المستخدمة من قبل الأورام هو التعبير عن pd-L1 ، الذي يتفاعل مع pd-1 علي الخلايا T لكبح تنشيطها ووظيفة1،2. ردا علي مضاد للفيروسات-غاما (IFNγ) ، الذي يعبر عنه عدد من الخلايا المناعية المنشطة ، يمكن ان تزيد الخلايا السرطانية من التعبير عن PD-L1 للحث علي استنفاد الخلايا التائية النشطة ، التالي منعها من الاستئصال الفعال للخلايا السرطانية3. استخدام الأجسام المضادة لمنع التفاعل بين PD-L1 و PD-1 يستخدم حاليا لعلاج أنواع السرطان متعددة في البشر4. وفي ضوء هذا النجاح السريري وغيرها ، حظي تحديد واستهداف أليات المناعة المستمدة من الورم باهتمام متزايد.
إلى جانب قمع المناعة التكيفيه ، ومن المعروف أيضا ان الأورام تفرز العوامل التي تقمع الاستجابات الموالية للالتهابات من الخلايا المناعية الفطرية. الخلايا السرطانية يمكن أيضا ان تفرز العوامل التي تحرف التوظيف والتمايز من الخلايا المشتقة من النخاع النخاعي في البيئة المجهرية الورم لتعزيز قمع T تنشيط الخلية8,9.
نوع واحد من الخلايا المناعية الفطرية التي لها تاثير عميق علي تقدم الورم هو الضامة. لسنوات عديده ، وقد استخدم وجود الضامة المرتبطة بالورم (TAMs) كنذير سلبيه لبقاء المريض10. وقد تم إدخال المفهوم الذي يثبط مناعة الخلايا المناعية التي تخفف من الأورام بوساطة الخلية أكثر من 40 سنه مضت11. في الاونه الاخيره, وقد ثبت ان الاستجابة الموالية للالتهابات الضامة يمكن ان تكون اقل تنظيما في حين ان النمط الظاهري الموالية للورم يمكن ان يكون مستحثا في البيئة المجهرية الورم. هذه الضامة المثبطة للمناعة يمكن ان تسهم في استجابه التحمل, القيادة الورم التقدم والمقاومة للعلاج الكيماوي-والعلاج المناعي12. النظر إلى ان الضامة هي في كثير من الأحيان واحده من الكريات البيضاء الأكثر وفره مع الورم ، واستعاده نشاطهم المناعي الخاصة الورم يمثل هدفا محتملا لعلاجات السرطان13.
في حين يمكن ان تكون علي غرار التفاعلات الاتصال بوساطة بين الخلايا السرطانية والضامة من خلال الزراعة المباشرة ، واستخدام يدعم غشاء نفاذيه يمكن توضيح العوامل التي تفرز الورم هي المناعية دون التاثير الذي يحتمل ان يكون الخلط من الخلايا المناعية الورم الخلية الاتصال. باستخدام أساليب مماثله إلى حد ما ، والبعض الآخر قد أظهرت امكانيه تحديد العوامل التي تفرز في التفاعلات العصبية/الخلايا الدقيقة14 وكذلك الأورام مع خلايا ميسوثيليال15. وقد استخدمنا أيضا بنجاح هذه التقنية المشتركة في الثقافة لتوصيف دور البروتين الذي يفرز الورم ، Pros1 ، كمثبط للتعبير الجيني الموالي للالتهابات بعد تحفيز الضامة الصفاقيه مع LPS ومضاد للفيروسات-جاما16. هنا نحن وصف منهجيه مباشره التي يمكن استخدامها لاستجواب كيفيه العوامل التي تفرز الورم يمكن ان تؤثر علي تنشيط الضامة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأجريت جميع الإجراءات المتعلقة بحصاد واستخدام الضامة murine البريتوني في جامعه نورث كارولينا في تشابل هيل (UNC) ووافقت عليها اللجنة المؤسسية للرعاية الحيوانية والاستخدام (IACUC) UNC.
1. الضامة الثقافة
ملاحظه: هذا الاجراء يمكن استخدام الضامة البريتوني الاساسيه (الموصوفة بالتفصيل أدناه) ، الضامة نخاع العظم المشتقة ، أو خطوط الخلايا الضامة مثل J774 (ATCC) أو RAW264 (ATCC).
- حصاد الضامة البريتوني كما سبق وصفها16،17 ولوحه مباشره في الغرفة العلوية (ق) من 0.4 μm غشاء البوليستر ادراج الثقافة المشتركة 6 لوحه جيدا (الشكل 1a).
ملاحظه: الغلة التقريبية من الضامة من كل عزله هو 1 × 106 خلايا المجموع ، التالي فان متوسط عدد الخلايا في بئر هو ~ 1.5-1.6 x 105 خلايا في 6 لوحه جيدا. - الثقافة الضامة التي تم حصادها في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (DMEM)/f12 ، 10 ٪ الجنين البقري المصل (سيتم) ، 1x البنسلين/ستربتوميسين ، 20 نانوغرام/مل الضامة مستعمره عامل تحفيز (M-السائل الدماغي الشوكي) لمده 3 أيام في 37 درجه مئوية ، 5 ٪ CO2.
ملاحظه: الغرفة العلوية تحتوي علي 1 مل من الثقافة المتوسطة في حين يتم تعبئة الغرفة السفلي مع 1.5 ml. يجب أضافه الوسيط إلى كل غرفه.
2. زراعه الخلايا السرطانية مع الضامة
- قبل الاستخدام ، الثقافة المتاحة تجاريا الخلايا السرطانية في المتوسطة الخاصة بها التالية ATCC-الانسجه الموصي بها أساليب الثقافة.
- غسل الخلايا السرطانية الملتصقة مره واحده مع الفوسفات مخزنه المالحة (التلفزيونية) ، أضافه 0.05 ٪ التريبسين + حمض ايثيلليندياميتاتاتاستيك (أدتا) ، واحتضان في 37 درجه مئوية حتى فصل الخلايا. أعاده تعليق الخلايا التي تحتوي علي المتوسطة ، كميه الخلايا باستخدام مقياس الكريات أو عداد الخلية ، ومن ثم أجهزه الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 220 x g إلى بيليه.
- اثناء الطرد ، يستنشق الوسط من الحجرات العلوية والسفلية من لوحات الدعم غشاء نفاذيه المحتوية علي الضامة واستبدال مع المتوسطة الطازجة.
- للغرف السفلي حيث سيتم مطلي الخلايا السرطانية ، وملء مع 1 مل من المتوسطة بدلا من 1.5 mL للسماح لحجم كاف لأضافه الخلية.
- يستنشق المتوسطة من الخلايا السرطانية التي تغلف وأعاده التعليق الخلايا في DMEM/F12 مع 10 ٪ منها ، 1x البنسلين/ستربتوميسين ، و 20 نانوغرام/مل M-السائل الدماغي الشوكي في تركيز 3 × 105 خلايا/مل.
- أضافه 0.5 mL من الخلايا السرطانية 3 × 105 خلايا/مل إلى غرفه السفلي من الآبار المطلوبة (الشكل 1b).
ملاحظه: يمكن معالجه الخلايا فورا.
3-علاج الخلايا المستزرعة المشتركة
- للحث علي التعبير الجيني الموالية للالتهابات الضامة ، وعلاج منفردة أو الضامة شارك في المثقف عن طريق أضافه 100 ng/mL IFNγ و 50 ng/mL LPS.
- تغيير مده أوقات العلاج في الثقافة حسب الحاجة. يحدث تنشيط الضامة في غضون 2 ح وبعض قمع بوساطة الورم يحدث من قبل 8 ح. الثقافة المشتركة لل 24 ح غله قويه ومتسقة الأورام المشتقة قمع.
ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن ان يحفز الضامة لاعتماد النمط الظاهري الشفاء الموالية للجروح من خلال أضافه عوامل مثل interleukin-10 (IL10) ، وتاثير الورم-يفرز يجند تقييمها.
- تغيير مده أوقات العلاج في الثقافة حسب الحاجة. يحدث تنشيط الضامة في غضون 2 ح وبعض قمع بوساطة الورم يحدث من قبل 8 ح. الثقافة المشتركة لل 24 ح غله قويه ومتسقة الأورام المشتقة قمع.
- كعنصر تحكم سلبي ، الضامة الثقافة منفردة وترك دون علاج. كعنصر تحكم إيجابي ، علاج الضامة مثقف منفردة مع 100 ng/mL IFNγ و 50 ng/mL LPS.
4-التحليل النهائي للخلايا المستزرعة المشتركة
- بعد وقت الحضانة المطلوب قد انقضت ، عزل الخلية محلله أو المتوسطة الثقافة المكيفة حسب الرغبة ، اعتمادا علي اختبار الاحتياجات.
- لعزل الخلية محلله لتحليل تفاعل البلمره الكمي (qpcr) ، يستنشق وسائل الاعلام من كلا الغرفتين من البئر ويغسل مره واحده مع 2 مل من تلفزيوني. تطبيق الجيش النيبالي التحلل العازلة إلى الغرفة العلوية التي تحتوي علي الضامة. كشط بلطف الغشاء للإفراج عن الخلية lysate ، ونقل إلى أنبوب جمع لمزيد من المعالجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة لمجموعه العزل RNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتحديد تاثير الأورام التي يفرزها الورم علي الاستقطاب الضام ، تم استخدام الاجراء الموصوف. واستخدمت الضامة البريتوني مثقف في غياب الخلايا السرطانية السلبية (غير المعالجة = اليسار البعيد) وايجابيه (IFNγ و LPS حفزت = 2nd من اليسار) الضوابط (الشكل 2a). بدلا من ذلك ، كانت الضامة البريتوني مشتركه في الاستزراع مع خلايا الورم الميلانوما B16F10 (ATCC) (الشكل 1A). فورا بعد الطلاء ، كانت الخلايا اما التعامل مع IFNγ و LPS أو ترك دون علاج. بعد 24 ساعة من الثقافة ، تم حصاد الضامة ، أعدت RNA ، و qRT-PCR أداء لقياس التعبير عن الجينات الموالية للالتهابات. باستخدام نظام الثقافة المشتركة الموصوف هنا ، نظهر ان الضامة البريتونية شاركت في الاستزراع في وجود خلايا الورم B16F10 ، ولكن دون تنشيط المحفزات (LPS + IFNγ) ، لم تزيد من التعبير عن الجينات الموالية للالتهابات-المرتبطة (الشكل 2A، B16F10 الغشاء/غير المعالجة). وهذا يعني ان الأورام التي يفرزها الورم هي 1) ليست كافيه من تلقاء نفسها للحث علي التعبير الجيني الموالي للالتهابات أو 2) إذا كان هناك تنشيط المناعي من إفرازات الورم ، والجينات paracrine كافيه لقمعها إلى مستويات ساذجه. هذه الطريقة المشاركة في الثقافة يوضح انه عندما يتم استزراع الضامة المستقطبة من قبل IFNγ و LPS في وجود الخلايا السرطانية ، تم تخفيض قمع التعبير الجيني المرتبط بالتهاب بقدر 60 ٪ (الشكل 2A، B16F10 غشاء/IFNΓ + lps). ولوحظ مستوي مماثل من الضامة قمع الجينات الموالية للالتهابات عندما تم استبدال خط الخلية الضامة murine J774 الضامة البريتوني (الشكل 2B).
عملنا السابقة حددت Pros1 كعامل الورم يفرز التي يمكن ان تمنع تفعيل الضام16. باستخدام الغشاء نفاذيه دعم نموذج الثقافة المشتركة بالتزامن مع اليسا ، ونحن المصابين تركيز Pros1 في وسط مكيفه بعد 24 ساعة. لاحظنا انه في وسط مكيفه من IFNγ و LPS معالجه B16F10 خلايا الميلانوما Pros1 وأعرب في 475 ng/mL ± 120 ng/mL (الشكل 3). الضامة البريتوني التعامل في نفس الظروف وأعرب Pros1 في 61 ng/mL ± 5 نانوغرام/مل (الشكل 3). ومن المثير للاهتمام ، عندما شارك في الاستزراع ، Pros1 داخل IFNγ و LPS تعاملت بشكل جيد 86 ng/mL ± 15 نانوغرام/مل. وهذا يوحي بان 1) الضامة تستهلك الورم-يفرز Pros1 أو 2) كميه Pros1 يفرز بواسطة خلايا B16F10 ينخفض إلى حد كبير عندما تكون في وجود الضامة. النتائج من كل من الشكل 2 والشكل 3 تسليط الضوء علي التغيرات العميقة للتنشيط الضام والإشارات paracrine عندما تكون الضامة مشتركه مع الخلايا السرطانية.
الشكل 1 التخطيطي لدعم غشاء نفاذيه المشاركة في الثقافة من الخلايا السرطانية مع الضامة. يمكن تطبيق ضوابط العلاج الايجابيه والسلبية علي الآبار المستزرعة الضامة منفردة (A). لتحديد اثار الورم-يفرز إشارات علي تنشيط الضامة ، يتم استزراع الضامة في الغرفة العلوية من الغشاء نفاذيه دعم لوحات الثقافة المشتركة والخلايا السرطانية المستزرعة في غرفه السفلي (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 إشارات الورم paracrine قمع الضامة الاستقطاب الموالية للالتهابات. الضامة التعبير عن الجينات المرتبطة بالتهاب والتي تم التهاوي بواسطة qRT-PCR في غير المعالجة أو ifnγ و LPS حفز الضامة في وجود أو غياب خلايا الورم. وقد انخفض التعبير عن الجينات الموالية للالتهابات في الضامة البريتوني (A) أو J774 الضامة خط الخلية (B) عندما مثقف في وجود خلايا الورم مفصوله بدعم غشاء نفاذيه بحيث تم نقل التاثير بواسطة ligand قابل للذوبان. *p < 0.05 بالنسبة لغير المعالجة ، †p < 0.05 بالنسبة لifnγ وتحفيز lps. البيانات تعني ± SEM; قيم p محسوبة بواسطة اختبار t للطالب ثنائي الذيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3 الزراعة من الخلايا السرطانية والضامة يؤدي إلى تغييرات في كميه الورم الذي يفرز الأورام الليفية الموجودة في المتوسطة المكيفة. وقد استخدمت اليسا لتحديد تركيز Pros1 في الورم وحده ، الضامة وحدها ، أو مختلطة المتوسطة مكيفه بعد 24 ح. الثقافة المشتركة يؤدي إلى انخفاض في كميه Pros1 نسبه إلى الخلايا السرطانية فقط الضوابط. *p < 0.05 بالنسبة لغير المعالجة. قيم p محسوبة بواسطة اختبار t الطالب ثنائي الذيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تحليل الثقافة المشتركة المقدمة هنا هو تعديل الاختبارات المحددة سابقا التي تسمح لدراسة العوامل التي تفرز الورم علي تنشيط الخلايا المناعية. في حين ان الاتصال بالخلايا الخلوية معروف للحث علي حدوث تغييرات في النشاط المناعي ، فان قدره الخلايا التي تفرز الورم لتعديل التنشيط المناعي اقل فهما. ونحن نقدم وصفا للطريقة التي ، علي عكس الثقافة المشتركة المباشرة ، يمكن استخدامها لاستجواب كيفيه تاثير العوامل المشتقة من الورم علي تنشيط الخلايا المناعية دون الطبيعة المربكة للإشارات التي تتم بوساطة الاتصال. ونظرا للاهميه السريرية المحتملة لأورام الورم المفرزة في كبت المناعة ، فان هذه الطريقة توفر أداه سهله الاستخدام لدراسة هذه أليات بطرق لا تعالجها الثقافة المشتركة المباشرة.
أساسا ، وأسلوب الثقافة المشتركة الموصوفة هنا ينطوي علي ثقافة الضامة (الخلايا الاوليه: المقيمين ، نخاع العظم المشتقة ، أو خط خليه الضام) مع الخلايا السرطانية (خط الخلية أو الخلايا الاوليه) دون ملامسه المادية. من الاهميه بمكان ان يتم استزراع الضامة علي 0.4 μm حجم المسام غشاء البوليستر ادراج للسماح نفاذيه الحرة للورم يفرز الورم في حين منع احتمال هجره الخلايا الضامة من خلال فلتر. ومن المهم أيضا أضافه المبلغ الموصوف من الوسط الثقافي إلى الحجرتين العليا والسفلي لضمان التغطية السليمة للخلايا. التصميم التجريبي ، مثل ادراج عنصر تحكم نوع خليه واحده فقط ، هو عامل رئيسي آخر عند التخطيط لتجارب الثقافة المشتركة. عده عوامل أخرى ، وصفها بمزيد من التفصيل في وقت لاحق ، يمكن أيضا ان يكون لها اثار علي نتائج الفحص وانه من المهم ان تبقي كل في الاعتبار اثناء تصميم الدراسة.
اثنين من التعديلات المفيدة للبروتوكول المحدد للنظر هي مده الثقافة المشتركة أو النسبة النسبية للخلايا السرطانية إلى الضامة. في الطريقة الموصوفة ، يتم طلاء الضامة والخلايا السرطانية بتركيزات متساوية تقريبا. نقطه هامه للنظر هي النسبة النسبية من الضامة إلى الخلايا السرطانية التي تحدث بشكل طبيعي في البيئة المجهرية الورم. لمحاكاة أفضل البيئة المجهرية الورم ، يمكن ان تتغير النسبة النسبية من الضامة لتعكس ما هو موجود داخل الورم في الجسم المجري ، علي الرغم من ان العمل التمهيدي قد يكون ضروريا لتحديد النسبة الصحيحة.
نقطه حرجه أخرى ، والقيود المحتملة للنظام ، هو ان العلاجات المطبقة لتحفيز نوع خليه واحده في الفحص قد يكون لها اثار غير متوقعه أو غير مقصوده علي نوع الخلية الأخرى. كما هو موضح هنا ، وتهدف أضافه LPS و IFNγ لتحفيز التعبير الجيني الموالية للالتهابات في الضامة. ومع ذلك, في Ubil وآخرون. أظهرنا ان IFNγ أيضا الحث علي التعبير وإفراز المناعة Pros116, والبعض الآخر قد أظهرت اثار lps علي الخلايا السرطانية18. ولذلك فمن الضروري ادراج الضوابط المناسبة لرصد الآثار المحتملة غير المستهدفة أو غير المقصودة علي نوع الخلية الأخرى للتحقق من النتائج التجريبية. واحدي الطرق التي يمكن ان يتحقق بها ذلك هي معالجه أنواع الخلايا الفردية مع عوامل الفائدة ورصد الآثار باستخدام اختبارات البيولوجيا الجزيئية القياسية.
عند تصميم التجارب دعم غشاء نفاذيه ، من المهم أيضا النظر في التدرجات نشر ممكن من الligands يفرز. المعدل النسبي للاربطه ، ومده الثقافة المشتركة وما إذا كان يتم الحفاظ علي لوحه الثقافة في موقف ثابت يمكن ان يكون جميع الآثار علي النتائج. الاضافه إلى ذلك ، فمن الممكن لبعض اليغاندس يفرز للانضمام إلى سطح لوحات الثقافة.
في حين ان النتائج التمثيلية المبينة هي سمه من سمات هذا النظام ، ودرجه قمع الجينات الموالية للالتهابات لوحظ عند المشاركة في زراعه خطوط الأورام الأخرى قد تختلف بشكل كبير. في Ubil et al., ونحن نظهر ان بعض خطوط الورم البشري يمكن تماما تقريبا قمع التعبير الجيني الموالية للالتهابات من الإنسان الضامة خط الخلية16. وعلي العكس من ذلك ، قد تختلف أنواع الخلايا السرطانية الأخرى أو خطوط الخلايا بشكل كبير في قدراتها المثبطة للمناعة. وسبب هذه الفروق غير واضح ولكنه مجال لمزيد من الدراسة.
الدعم غشاء نفاذيه الثقافة المشتركة هي منهجيه قويه التي يمكن تعديلها بسهوله لمعالجه مجموعه متنوعة من الاسئله ويمكن تكييفها لمجموعه من القراءات البيولوجيا الجزيئية بما في ذلك qRT-PCR ، لطخه الغربية ، و ELISA. ويمكن استخدام النظام لاستجواب وظائف الجينات الفردية ، مثل الخلايا الليفية أو المستقبلات ، عندما يتم اجراء التعديلات الوراثية مثل تلك التي من الفئران المحذوفة الجينات أو التعديلات CRISPR اما الضامة أو الخلية السرطانية. النظام هو أيضا قابله للدراسة من المنشطات الدوائية أو مثبطات وأثارها علي الإشارات paracrine. أيضا ، في حين لم تناقش هنا ، يمكن استخدام النظام لدراسة اثار التنشيط المناعي علي التعبير الجيني للخلايا السرطانية.
وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح في اكتشاف وتوصيف وظيفة جديده للمناعة ، والورم المفرزة. يمكن استخدام هذه الاداه القوية للتحقيق في مجموعه فرعيه أوسع بكثير من التفاعلات المناعية/الأورام غير الملامسة علي أمل اكتشاف أهداف علاجيه جديده.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
[اريك] [اوبيل] كان مولت, جزئيا, بالامريكيه سرطان جمعيه دكتوراه زمالة (128770-بف-15-216-01-ليب]). وقد تم دعم العمل من خلال منحه من المعاهد القومية للصحة (R01-CA205398) وجائزه مؤسسه أبحاث سرطان الثدي (BCRF) إلى الصحة والسلامة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
