לומד את ההשפעות של הקרנף המופרש ליגרין המקרופאג הפעלה באמצעות תרבות שיתוף עם ממברנה חדיר תומך
Summary
כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות ממברנה חדיר תומך כדי להקל על המחקר של אי-מגע הפרדרין איתות בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. המערכת היא קלה ללמוד את התפקיד של גורמים מופרש הגידול בהפעלת לחות מקרופאג.
Abstract
הגידול הנגזר הקרנף איתות הוא רכיב מתעלמים של דיכוי חיסוני מקומי והוא יכול להוביל לסביבה מתירני עבור גידול בסרטן המתמשך גרורות. אותות הפרדרין יכול לכלול מגע תא תא בין סוגי תאים שונים, כגון PD-L1 ביטא על פני השטח של גידולים הקשורים ישירות עם PD-1 על פני השטח של תאי T, או הפרשת ליגולים על ידי תא הגידול כדי להשפיע על תא החיסון. כאן אנו מתארים שיטה שיתוף תרבות כדי לחקור את ההשפעות של הגידול מופרש ליגנדס תא החיסונית (מקרופאג) הפעלה. הליך זה פשוט מנצל מסחרית זמין 0.4 יקרומטר ממברנה פוליקרבונט חדירות תומך ולוחות התרבות רקמה סטנדרטית. בתהליך המתואר, מקרופאגים הם מתורבתים בחדר העליון תאים סרטניים בחדר התחתון. הנוכחות של מכשול 0.4 יקרומטר מאפשר לימוד של איתות התרבות ללא משתנה מייסד של מגע פיזי, כי שני סוגי התא לחלוק את אותו בינונית וחשיפה לליפות הקרנף. גישה זו יכולה להיות משולבת עם אחרים, כגון שינויים גנטיים של המקרופאג (למשל, בידוד מן העכברים לנקוש החוצה גנטית) או גידול (למשל, CRISPR-בתיווך שינויים) כדי ללמוד את התפקיד של גורמים מופרשים ספציפיים וקולטנים. הגישה גם משאיל את עצמה לניתוחים ביולוגיים מולקולריים סטנדרטיים כגון שעתוק הפוכה כמותית תגובת שרשרת (רביעיית-PCR) או ניתוח כתמי אבן מערבי, ללא צורך במיון זרימה כדי להפריד בין שתי אוכלוסיות תאים. חיסוני מקושרים אנזים בחני (אליאס) יכול להיות באופן דומה להיות מנוצל כדי למדוד מופרש ליגנדס כדי להבין טוב יותר את האינטראקציה הדינמית של איתות התא בהקשר סוג תא מרובים. משך התרבות המשותף יכול להיות מגוון גם לחקר האירועים המווסתים באופן זמני. שיטה זו שיתוף תרבות היא כלי חזק המקל על חקר אותות הגידול מופרש בהקשר החיסונית.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו ביכולת של תאים סרטניים כדי למנוע זיהוי על ידי תאים חיסוניים, לדכא את ההפעלה החיסונית המקומית, או לייצר הגידול tolerogenic מתירני הגידול מיקרוסביבה. שתי שיעורים רחבים של גידול ואינטראקציות תאים החיסונית תוארו כי להקל על ההשפעות הללו: קשר-מתווך אינטראקציות או ליגניות המופרשים. אחד הטוב ביותר לחקור מנגנוני צייתן קלינית של קשר-תיווך החיסונית עיכוב מנוצל על ידי גידולים היא הביטוי של pd-L1, אשר אינטראקציה עם PD-1 על התאים T לעכב את ההפעלה שלהם פונקציה1,2. בתגובה אינטרפרון-גמא (IFNγ), אשר מתבטא על ידי מספר תאים חיסוניים מופעלים, תאים סרטניים יכולים להגביר את הביטוי של PD-L1 כדי לגרום לתשישות של PD-1 – הבעת הפעלת תאי T, ובכך למנוע מהם ביעילות להשמיד תאים סרטניים3. השימוש נוגדנים לחסום את האינטראקציה בין PD-L1 ו-PD-1 משמש כיום לטיפול בסוגי סרטן מרובים בבני אדם4. לאור ההצלחה הקלינית הזאת ואחרים, הזיהוי והמיקוד של מנגנוני הדיכוי האנטי-סרטניים, קיבל את תשומת הלב הגוברת.
מעבר דיכוי של חסינות אדפטיבית, גידולים ידועים גם להפריש גורמים לדכא את התגובות הפרו דלקתיות של תאים חיסוניים מולדים. גידול נגזר או הפרשות הגידול המושרה, כולל il-6, il-10, וגרה, il-23, ואת המושבה גורם ממריץ (שדרתי-1), הוכחו לעכב את תגובות הגידול של הרוצח הטבעי (NK) תאים, גרנולוציטים, ותאים דנדריטים ב מיקרוסביבה הגידול5,6,7. תאים סרטניים יכולים גם להפריש גורמים הטיית הגיוס והבידול של תאים מיאלואידית-נגזר במיקרו הסביבה הגידול כדי לקדם את הדיכוי של ההפעלה תא T8,9.
סוג אחד של תא מולדים החיסון כי יש השפעה עמוקה על התקדמות הגידול הוא מקרופאג. במשך שנים רבות, הנוכחות של מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) השתמשו כתחזיות שליליות של הישרדות החולה10. המושג כי מדכאים TAMs לצנן את התא החיסונית מתווכת הסיווג של גידולים הוצג לפני יותר מ 40 שנים11. לאחרונה, זה הוכח כי התגובה מקרופאג pro-דלקתיות יכול להיות מוסדר בעוד פנוטיפ הגידול pro יכול להיגרם מיקרוסביבה הגידול. אלה מקרופאגים מדכאים יכול לתרום לתגובה tolerogenic, נהיגה התקדמות הגידול ועמידות לכימותרפיה-טיפול חיסוני12. בהינתן כי מקרופאגים הם לעתים קרובות אחד לוקיציטים הנפוץ ביותר עם הגידול, שחזור של פעילות החיסון הספציפי שלהם לגידול מייצג יעד פוטנציאלי עבור תרופות נגד סרטן therapeutics13.
בעוד קשר-מתווך אינטראקציה בין תאים סרטניים מקרופאגים ניתן להקים באמצעות התרבות coculture ישירה, השימוש של ממברנה חדיר תומך יכול להבהיר איזה גורם הגידול מופרש הם החיסונית ללא השפעה הפוטנציאל של הגידול-תא החיסונית החיסון המגע. באמצעות שיטות דומות במקצת, אחרים הוכיחו את הפוטנציאל של זיהוי גורמים מופרש ב microglia/האינטראקציות נוירואליות14 , כמו גם תאים סרטניים עם תאים mesothelial15. יש לנו גם בהצלחה את הטכניקה שיתוף התרבות הזאת כדי לאפיין את התפקיד של חלבון מופרש הגידול, Pros1, כמו מדכא של ביטוי גנים פרו דלקתית לאחר גירוי של מקרופאגים הצפק עם LPS ו אינטרפרון-גמא16. כאן אנו מתארים מתודולוגיה ישירה כי ניתן להשתמש כדי לחקור כיצד גורמים מופרש הגידול יכול להשפיע על מקרופאג הפעלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השינוי בתרבות שיתוף הציג כאן הוא שינוי של בחני שנקבעו בעבר, המאפשר לימוד של גורמים מופרש הגידול על הפעלת התא החיסונית. בעוד המגע תא התא ידוע כדי לגרום לשינויים בפעילות החיסונית, היכולת של הגידול המופרש גידולים לווסת את ההפעלה החיסונית הוא מובן פחות טוב. אנו מתארים שיטה אשר, שלא כמו שיתוף הת…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אריק Ubil היה ממומן, בין השאר, על ידי האגודה האמריקנית לסרטן החברה פוסט דוקטורט (128770-PF-15-216-01-LIB). העבודה נתמכה על ידי מענק NIH (R01-CA205398) ו סרטן השד מחקר הקרן פרס (BCRF 18-041) ל HSE.
Materials
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer–response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
