Summary
Burada, bağışıklık yanıtını bastırmak için tümör hücreleri tarafından kullanılan temassız parakrin sinyalçalışmasını kolaylaştırmak için geçirgen membran destekleri kullanan bir yöntem salıyoruz. Sistem makrofaj aktivasyonu sönümleme tümör salgılanan faktörlerin rolünü incelemek için münasip olduğunu.
Abstract
Tümör kaynaklı parakrin sinyalizasyon lokal immünsupresyonun gözden kaçan bir bileşenidir ve sürekli kanser büyümesi ve metastaz için izin verilen bir ortama yol açabilir. Parakrin sinyalleri farklı hücre tipleri arasında hücre-hücre teması içerebilir, PD-L1 gibi tümörlerin yüzeyinde doğrudan T hücrelerinin yüzeyinde PD-1 ile etkileşim, ya da bir tümör hücresi tarafından ligands salgılanması bir bağışıklık hücresi etkilemek için ifade. Burada tümör salgılanan ligandların bağışıklık hücresi (makrofaj) aktivasyonu üzerindeki etkilerini sorgulamak için bir ortak kültür yöntemi ni tanımlıyoruz. Bu basit prosedür, ticari olarak mevcut 0,4 μm polikarbonat membran geçirgen destekler ve standart doku kültür plakaları kullanır. Açıklanan süreçte makrofajlar üst haznede, tümör hücrelerinde ise alt odada kültürlenir. 0.4 μm bariyerinin varlığı, iki hücre tipi aynı ortamı ve parakrin ligandlara maruz kalma açısından şaşırtıcı değişkeni olmadan hücreler arası sinyalleme nin incelenmesine olanak sağlar. Bu yaklaşım, makrofajın genetik değişiklikleri (örn. genetik nakavt farelerden izolasyon) veya tümör (örneğin, CRISPR aracılı değişiklikler) gibi diğer kişilerle birleştirilip belirli salgılanan faktörlerin ve reseptörlerin rolünü inceleyebilir. Bu yaklaşım aynı zamanda iki hücre popülasyonlarını ayırmak için akış ayarı gerek kalmadan, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) veya Batı leke analizi gibi standart moleküler biyolojik analizlere de katkıda bulunur. Enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA) benzer şekilde çoklu hücre tipi bağlamda hücre sinyalinin dinamik etkileşimini daha iyi anlamak için salgılanan ligandları ölçmek için kullanılabilir. Eş-kültür süresi de zamansal düzenlenmiş olayların çalışma için çeşitli olabilir. Bu co-kültür yöntemi bağışıklık bağlamında tümör salgılanan sinyallerin çalışmasını kolaylaştıran sağlam bir araçtır.
Introduction
Son çalışmalar, kanser hücrelerinin bağışıklık hücreleri tarafından tespit önlemek için yeteneği üzerinde duruldu, lokal immün aktivasyonu bastırmak, ya da tümör mikroortamda bir tolerojenik tümör-buna kalım ortamı üretmek için. Bu etkileri kolaylaştıran iki geniş tümör ve bağışıklık hücresi etkileşimi sınıfı tanımlanmıştır: temas aracılı etkileşimler veya tümör salgılanan ligandlar. Tümörler tarafından kullanılan temas aracılı immün inhibisyonun en iyi çalışılmış ve klinik olarak çekilebilir mekanizmalarından biri PD-L1 ifadesidir, hangi PD-1 ile T hücreleri onların aktivasyon vefonksiyoninhibe etkileşime 1,2. Aktif bağışıklık hücrelerinin bir dizi tarafından ifade edilen interferon-gama (IFNγ), yanıt olarak, tümör hücreleri PD-1-ifade aktive T hücrelerinin yorgunluğunu neden pd-L1 ekspresyonu artırabilir, bu nedenle etkili tümör hücrelerinin ortadan kaldırılmasını engelleyerek3. PD-L1 ve PD-1 arasındaki etkileşimi engellemek için antikorların kullanımı şu anda insanlarda birden fazla kanser türlerini tedavi etmek için kullanılır4. Bu klinik başarı ve diğerleri ışığında, tümör kaynaklı immünsupresif mekanizmaların tanımlanması ve hedefalınması giderek artan bir ilgi almıştır.
Adaptif bağışıklık baskılanması ötesinde, tümörler de doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin pro-inflamatuar yanıtları bastırmak faktörlerse salgılamak bilinmektedir. Tümör kaynaklı veya tümör kaynaklı salgılar, IL-6 dahil, IL-10, VEGF, IL-23, ve koloni uyarıcı faktör (BOS-1), doğal katil antitümör yanıtlarını inhibe gösterilmiştir (NK) hücreleri, granülositler, ve tümör mikroortamında dendritik hücreler5,6,7. Tümör hücreleri de t hücre aktivasyonu bastırılması teşvik etmek için tümör mikroortamında işe alım ve miyeloid türetilmiş hücrelerin farklılaşması çarpık faktörler salgılayabilir8,9.
Tümör progresyonu üzerinde derin bir etkiye sahip doğuştan gelen bağışıklık hücresi bir türü makrofaj olduğunu. Uzun yıllar boyunca, tümör ilişkili makrofajlar varlığı (TAMs) hasta sağkalım negatif prognostik olarak kullanılmıştır10. İmmünsupresif TAM'ların immün hücre aracılı tümörlerin temizlenmesini azalttağı kavramı 40 yıldan daha uzun bir süre önce11. Daha yakın zamanda, makrofaj pro-inflamatuar yanıtın alt regüle edilebildiği, tümör mikroortamında pro-tümör fenotipinin indüklenebileceği gösterilmiştir. Bu immünsupresif makrofajlar tolerojenik bir yanıta katkıda bulunabilir, tümör ilerlemesi ve kemoterapi direnci sürüş- ve immünoterapi12. Makrofajlar genellikle tümör ile en bol lökositler biri olduğu göz önüne alındığında, onların tümöre özgü bağışıklık aktivitesinin restorasyonu antikanser terapötikler için potansiyel bir hedef temsil13.
Tümör hücreleri ve makrofajlar arasındaki temas aracılı etkileşimler doğrudan kokültür yoluyla modellenebilir iken, geçirgen membran desteklerkullanımı tümör-immün hücre hücre teması potansiyel şaşırtıcı etkisi olmadan hangi tümör salgılanan faktörlerin immünomodülatör olduğunu açıklayabilir. Biraz benzer yöntemler kullanarak, diğerleri mikroglia / nöronal etkileşimleri salgılanan faktörlerin belirlenmesi potansiyelini göstermiştir14 yanı sıra mezotelyal hücreleri ile tümör hücreleri15. Ayrıca bu ortak kültür tekniğini, LPS ve interferon-gamma16ile periton makrofajlarının uyarılmasından sonra pro-inflamatuar gen ekspresyonunun bastırıcısı olarak tümör salgılanan bir protein olan Pros1'in rolünü karakterize etmek için başarıyla kullandık. Burada tümör salgılanan faktörlerin makrofaj aktivasyonunu nasıl etkileyebileceğini sorgulamak için kullanılabilecek basit bir metodolojiyi açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Murin periton makrofajlarının hasat ve kullanımı ile ilgili tüm prosedürler Chapel Hill'deki North Carolina Üniversitesi'nde (UNC) yürütülmüş ve UNC Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Makrofaj kültürü
NOT: Bu yordam, birincil periton makrofajları (aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır), kemik iliği kaynaklı makrofajlar veya J774 (ATCC) veya RAW264 (ATCC) gibi makrofaj hücre hatlarını kullanabilir.
- Hasat periton makrofajlar daha önce açıklandığı gibi16,17 ve plaka doğrudan üst hazneiçine 0.4 μm polyester membran eklemek co-kültür 6 kuyu plakası(Şekil 1A).
NOT: Her izolasyondan makrofajların yaklaşık verimi toplam 1 x 106 hücredir, bu nedenle kuyu başına ortalama hücre sayısı ~1.5-1.6 x 105 hücredir. - Kültür Dulbecco's Modifiye Kartal Orta (DMEM)/F12, 10% Fetal Sığır Serum (FBS), 1x penisilin / streptomisin, 20 ng / mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CF) 3 gün için hasat makrofajlar 37 °C, 5% CO2.
NOT: Alt hazne 1,5 mL ile doldurulurken üst haznede 1 mL kültür ortamı içerir. Ortam her odaya eklenmelidir.
2. Makrofajlı tümör hücrelerinin eşkültürü
- Kullanmadan önce, atcc tarafından önerilen doku kültürü yöntemlerini takiben kendi ortamlarında ticari olarak mevcut olan tümör hücreleri.
- Yapışık tümör hücrelerini bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın, %0,05 tripsin + etilenediamintetraasetik asit (EDTA) ekleyin ve hücreler ayrışana kadar 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Orta içeren FBS hücreleri resuspend, bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak hücrelerin toplam sayısını quantitate, ve sonra pelet için 220 x g 5 dakika santrifüj.
- Santrifüj sırasında, makrofaj içeren geçirbilebilir membran destek plakalarının üst ve alt odalarından orta aspirat ve taze ortam ile değiştirin.
- Tümör hücrelerinin kaplandığı alt bölmeler için, hücre ilavesi için yeterli hacim sağlamak için 1,5 mL yerine 1 mL orta ile doldurun.
- DMEM/F12'de %10 FBS, 1x penisilin/streptomisin ve 3 x 105 hücre/mL konsantrasyonda 20 ng/mL M-CSF ile pürelenmiş tümör hücrelerinden aspire ortamı.
- İstenilen kuyuların alt haznesine 0,5 mL 3 x 105 hücre/mL tümör hücresi ekleyin (Şekil 1B).
NOT: Hücreler hemen tedavi edilebilir.
3. Ortak kültürlü hücrelerin tedavisi
- Makrofaj pro-inflamatuar gen ekspresyonunu indüklemek için, 100 ng/mL IFNγ ve 50 ng/mL LPS ekleyerek tek başına veya eş kültürlü makrofajları tedavi edin.
- Kültürde tedavi sürelerini gerektiği gibi değiştirin. Makrofaj aktivasyonu içinde oluşur 2 saat ve bazı tümör aracılı bastırma oluşur 8 h. Co-kültür için 24 h sağlam ve tutarlı tümör kaynaklı baskılama verimleri.
NOT: Alternatif olarak, makrofajlar interlökin-10 (IL10) gibi faktörlerin eklenmesi ve tümör salgılanan ligand etkisi değerlendirilerek yara yanlısı bir iyileşme fenotip indüklenebilir.
- Kültürde tedavi sürelerini gerektiği gibi değiştirin. Makrofaj aktivasyonu içinde oluşur 2 saat ve bazı tümör aracılı bastırma oluşur 8 h. Co-kültür için 24 h sağlam ve tutarlı tümör kaynaklı baskılama verimleri.
- Olumsuz bir kontrol olarak, kültür makrofajlar tek son ve tedavi edilmezse bırakın. Pozitif kontrol olarak, 100 ng/mL IFNγ ve 50 ng/mL LPS ile tek kültürlü makrofajları tedavi edin.
4. Ortak kültürlü hücrelerin downstream analizi
- İstenilen kuluçka süresi geçtikten sonra, test ihtiyaçlarına bağlı olarak, hücre lisate veya koşullandırılmış kültür ortamını istenilen şekilde izole edin.
- Kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi için hücre lisatını izole etmek için, kuyunun her iki odasından da ortam alıvurun ve 2 mL PBS ile bir kez yıkayın. RNA lysis tamponu makrofajları içeren üst hazneye uygulayın. Hücre lisatını serbest bırakmak için membranı yavaşça kazıyın ve RNA izolasyon kiti üreticisinin protokolüne göre daha fazla işlem için bir toplama tüpüne aktarın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tümör salgılanan ligandların makrofaj polarizasyonu üzerindeki etkisini belirlemek için açıklanan prosedür kullanılmıştır. Tümör hücrelerinin yokluğunda kültürlenmiş peritoneal makrofajlar negatif (tedavi edilmemiş = çok sol) ve pozitif (IFNγ ve LPS uyarılmış = 2soldan) kontrolleri olarak kullanılmıştır (Şekil 2A). Alternatif olarak, periton makrofajları B16F10 melanom tümör hücreleri (ATCC) ile birlikte kültürlendi (Şekil 1A). Kaplamadan hemen sonra hücreler YA IFNγ ve LPS ile tedavi edildi ya da tedavi edilmedi. 24 saat kültürden sonra makrofajlar hasat edildi, RNA hazırlandı ve pro-inflamatuar genlerin ekspresyonunu ölçmek için qRT-PCR uygulandı. Burada açıklanan ortak kültür sistemini kullanarak, periton makrofajlarının B16F10 tümör hücrelerinin varlığında birlikte kültürlenmiş olduğunu, ancak uyarıcıları (LPS + IFNγ) etkinleştirmeden, pro-inflamatuar ilişkili genlerin ekspresyonunu artırmadığını(Şekil 2A, B16F10 membran/tedavi edilmemiş) göstermektedir. Bu tümör salgılanan ligands anlamına gelir 1) pro-inflamatuar gen ekspresyonu indüklemek için kendileri tarafından yeterli değildir veya 2) tümör salgıları ile bağışıklık aktivasyonu varsa, parakrin ligandlar naif seviyelere bastırmak için yeterli. Bu ortak kültür yöntemi, IFNγ ve LPS ile polarize makrofajlar tümör hücrelerinin varlığında kültürlendiğinde, inflamasyona bağlı gen ekspresyonunun baskılanmasının %60'a kadar azaldığını göstermektedir(Şekil 2A, B16F10 Membran/IFNγ+LPS). Murine makrofaj hücre hattı J774 periton makrofajlarının yerine geçildiğinde karşılaştırılabilir düzeyde makrofaj pro-inflamatuar gen baskılanması gözlenmiştir(Şekil 2B).
Önceki çalışmamızda Pros1 makrofaj aktivasyonunu inhibe eden tümör salgılanmış bir faktör olaraktanımlanmıştı 16. ELISA ile birlikte geçirilebilir membran destek ortak kültür modelini kullanarak, 24 saat sonra pros1 konsantrasyonunu şartlı ortamda teşpildik. IFNγ ve LPS ile tedavi edilen B16F10 melanom hücrelerinden şartlı ortamda Pros1 475 ng/mL ± 120 ng/mL(Şekil 3)olarak ifade edildiğini gözlemledik. 61 ng/mL ± 5 ng/mL 'de Pros1 ifade edilen aynı koşullarda tedavi edilen periton makrofajları (Şekil 3). İlginçtir ki, ortak kültürlendiğinde, IFNγ ve LPS'deki Pros1 86 ng/mL ± 15 ng/mL idi. Bu 1) makrofajlar tümör salgılanan Pros1 veya 2) B16F10 hücreleri tarafından salgılanan Pros1 miktarı önemli ölçüde makrofajlar varlığında azalır tüketmek düşündürmektedir. Hem Şekil 2 hem de Şekil 3'ün sonuçları, makrofajlar tümör hücreleriyle birlikte işlendiğinde makrofaj aktivasyonu ve parakrin sinyalizasyonda yapılan derin değişiklikleri vurgular.
Şekil 1. Geçirgen membran şeması makrofajlı tümör hücrelerinin ortak kültürünü destekler. Tek kültürlü makrofaj kuyularına (A)pozitif ve negatif tedavi kontrolleri uygulanabilir. Makrofaj aktivasyonu üzerinde tümör salgılanan sinyallerin etkilerini belirlemek için, makrofajlar geçirgen membran destek co-kültür plakaları ve alt hazne (B)kültürlü tümör hücrelerinin üst odasında kültürlü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Tümör parakrin sinyalleri makrofaj pro-inflamatuar polarizasyonu baskılar. İnflamasyonla ilişkili genlerin makrofaj ekspresyonu tedavi edilmeyen qRT-PCR veya IFNγ ve LPS tümör hücrelerinin varlığında veya yokluğunda makrofajları uyararak değerlendirildi. Pro-inflamatuar genlerin ekspresyonu periton makrofajlarında (A) veya J774 makrofaj hücre hattında (B) geçirgen bir membran desteği ile ayrılan tümör hücrelerinin varlığında kültürlendiğinde azalmış ve böylece etki parakrin çözünür bir ligand ile bulaşamailmiştir. *p < tedavi edilmeyengöre 0.05, †p < 0.05 IFNγ ve LPS göreuyarılmış. Veriler ortalama ± SEM; p değerleri iki kuyruklu Öğrencinin t testi ile hesaplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Tümör hücreleri ve makrofajların kokültür lüzmitli ortamda bulunan tümör salgılanan parakrin ligandların miktarında değişikliklere yol açar. ELISA, sadece tümörde Pros1 konsantrasyonunu belirlemek için kullanıldı, tek başına makrofaj, ya da 24 saat sonra eş kültürlü klimalı ortam, tümör hücre kontrollerine göre Pros1 miktarında azalmaya yol açar. *p < 0.05 tedavi edilmezse göre. p değerleri iki kuyruklu Öğrencinin t testi ile hesaplanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan co-kültür tahlil bağışıklık hücresi aktivasyonu üzerinde tümör salgılanan faktörlerin incelenmesi için izin veren daha önce kurulmuş tahliller bir değişikliktir. Hücre-hücre temasının immün aktivitede değişikliklere yol açtığı bilinmekle birlikte, tümörse salgılanan ligandların bağışıklık aktivasyonunu modüle etme yeteneği daha az anlaşılmaktadır. Doğrudan ortak kültürün aksine, tümörkaynaklı salgılanan sekans faktörlerinin temas aracılı sinyalin kafa karıştırıcı doğası olmadan bağışıklık hücre aktivasyonunu nasıl etkilediğini sorgulamak için kullanılabilecek bir yöntemi tanımlıyoruz. İmmünsupresyonda tümör salgılanan ligandların potansiyel klinik önemi göz önüne alındığında, bu yöntem bu mekanizmaları doğrudan ortak kültür tarafından ele alınmayan şekillerde incelemek için kullanımı kolay bir araç tır.
Esasen, burada açıklanan ortak kültür yöntemi makrofajkültürünü içerir (birincil hücreler: yerleşik, kemik iliği türemiş veya makrofaj hücre hattı) tümör hücreleri ile (hücre hattı veya birincil hücreler) fiziksel temas olmadan. Makrofajların 0,4 m gözenek boyutunda polyester membran insertinde kültürlenerek tümörsalgılanan ligandların serbest geçirgenliğini sağlarken filtreden olası makrofaj hücre göçünün önlenmesi çok önemlidir. Ayrıca, uygun hücre kapsama sağlamak için üst ve alt odaları kültür ortamı açıklanan miktarda eklemek önemlidir. Bir hücre türünün yalnızca kontrollerinin dahil edilmesi gibi deneysel tasarım, ortak kültür deneylerini planlarken başka bir önemli faktördür. Daha sonra daha ayrıntılı olarak açıklanan diğer birçok faktör, tahkikat sonuçları üzerinde de etkileri olabilir ve çalışma tasarımı sırasında akılda tutmak önemlidir.
Özetlenen protokolde göz önünde bulundurulması gereken iki yararlı değişiklik, eş-kültürün süresi veya tümör hücrelerinin makrofajlara göreli oranıdır. Açıklanan yöntemde makrofajlar ve tümör hücreleri kabaca eşit konsantrasyonlarda kaplanır. Dikkate alınması gereken önemli bir nokta doğal tümör mikroortamında meydana gelen tümör hücreleri makrofajların göreceli oranıdır. Daha iyi tümör mikroçevre taklit etmek için, makrofajların göreceli oranı in vivo tümör içinde bulunan ayna değiştirilebilir, ancak ön çalışma doğru oranı kurmak için gerekli olabilir.
Başka bir kritik nokta, ve sistemin olası sınırlama, tetkik bir hücre tipi uyarmak için uygulanan tedaviler diğer hücre tipi üzerinde beklenmedik veya istenmeyen etkileri olabilir. Burada açıklandığı gibi, LPS ve IFNγ eklenmesi makrofajlarda pro-inflamatuar gen ekspresyonunu uyarmak için tasarlanmıştır. Ancak, Ubil ve ark biz IFNγ de ifade ve immünsupresif Pros116salgılanması neden olduğunu gösterdi , ve diğerleri tümör hücreleri üzerinde LPS etkilerini göstermiştir18. Bu nedenle, deneysel sonuçları doğrulamak için olası hedef dışı veya diğer hücre türü üzerindeki istenmeyen etkileri izlemek için uygun denetimlerin dahil edilmesi önemlidir. Bunun sağlanabileceği yöntemlerden biri de, standart moleküler biyoloji tahlilleri kullanılarak tek tek hücre tiplerinin ilgi ajanları ile tedavi edilmesi ve etkilerinin izlenmesidir.
Geçirimsiz membran destek deneyleri tasarlanırken, salgılanan ligandların olası difüzyon gradyanlarını da göz önünde bulundurmak önemlidir. Ligve salgının göreceli oranı, ortak kültürün süresi ve kültür plakasının sabit bir pozisyonda muhafaza edilip edilmediği sonuçlar üzerinde etkili olabilir. Buna ek olarak, bazı salgılanan ligands kültür plakaları yüzeyine uymak mümkündür.
Gösterilen temsili sonuçlar bu sistemin karakteristik özellikleri olmakla birlikte, co-culturing diğer tümör hatları gözlenen pro-inflamatuar gen baskılanması derecesi önemli ölçüde değişebilir. Ubil ve ark.'da, bazı insan tümör hatlarının insan makrofaj hücre hattı16'nınpro-inflamatuar gen ekspresyonunu neredeyse tamamen bastırabileceğini gösteriyoruz. Tersine, diğer tümör hücre tipleri veya hücre hatları onların immünsupresif yetenekleri önemli ölçüde değişebilir. Bu varyansların nedeni belirsizdir ancak daha fazla çalışma alanıdır.
Geçirimsiz membran desteği ortak kültürü, çeşitli sorulara cevap vermek üzere kolayca değiştirilebilen ve qRT-PCR, Western blot ve ELISA gibi çeşitli moleküler biyoloji okumalarına adapte edilebilen sağlam bir metodolojidir. Sistem, gen silinmiş fareler veya CRISPR düzenlerinden kaynaklanan genetik değişiklikler makrofajlara veya tümör hücrelerine yapıldığında ligandlar veya reseptörler gibi bireysel gen fonksiyonlarını sorgulamak için kullanılabilir. Sistem aynı zamanda farmakolojik aktivatörler veya inhibitörlerve parakrin sinyalizasyon üzerindeki etkileri çalışma için münasip tir. Ayrıca, burada tartışılan olmasa da, sistem tümör hücre gen ekspresyonu üzerinde bağışıklık aktivasyonu etkilerini incelemek için kullanılabilir.
Bu yöntem, immünsupresif, tümör salgılanan ligand için yeni bir fonksiyonun keşfi ve karakterizasyonunda başarıyla kullanılmıştır. Bu sağlam araç yeni terapötik hedefler keşfetmek umuduyla temassız tümör / bağışıklık etkileşimleri çok daha geniş alt sorgulamak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Eric Ubil, kısmen, Amerikan Kanser Derneği Doktora Sonrası Bursu (128770-PF-15-216-01-LIB) tarafından finanse edildi. Çalışma NIH (R01-CA205398) ve Meme Kanseri Araştırma Vakfı ödülü (BCRF-18-041) hse bir hibe tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
