研究肿瘤分泌性副体结扎对宏噬细胞活化的影响，使用可渗透膜支架共培养
Summary
在这里，我们提出了一种使用渗透膜支架的方法，以促进肿瘤细胞用于抑制免疫反应的非接触性对羟基苯甲酰二甲苯信号的研究。该系统有助于研究肿瘤分泌因子在抑制巨噬菌体活化中的作用。
Abstract
肿瘤衍生的副苯并发信号是局部免疫抑制的一个被忽视的成分，可以导致一个允许的环境，持续癌症生长和转移。Paracrine 信号可能涉及不同细胞类型之间的细胞-细胞接触，例如 PD-L1 在肿瘤表面与 T 细胞表面的 PD-1 直接相互作用，或肿瘤细胞分泌配体以影响免疫细胞。在这里，我们描述了一种共培养方法，用于询问肿瘤分泌配体对免疫细胞（巨噬细胞）激活的影响。这种简单的程序利用市售的0.4μm聚碳酸酯膜渗透支架和标准组织培养板。在所述过程中，巨噬细胞在上腔培养，肿瘤细胞在下腔培养。0.4 μm 屏障的存在允许研究细胞间信号，而不会造成物理接触的混淆变量，因为两种细胞类型共享相同的介质，并暴露于副体配体。这种方法可以与其他方法相结合，例如巨噬细胞的基因改变（例如，从基因敲除小鼠分离）或肿瘤（例如，CRISPR介导的改变），以研究特定分泌因子和受体的作用。该方法还适用于标准分子生物学分析，如定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）或西方斑点分析，无需进行流动分拣来分离两个细胞群。酶相关免疫吸附测定（ELISAs）同样可用于测量分泌配体，以更好地了解多细胞类型上下文中细胞信号的动态相互作用。共同文化的时间也可以因研究时间调节事件而不同。这种共培养方法是一个强大的工具，有助于研究免疫环境中的肿瘤分泌信号。
Introduction
最近的研究集中在癌细胞避免被免疫细胞检测、抑制局部免疫活化或在肿瘤微环境中产生耐受性肿瘤适应环境的能力。两大类肿瘤和免疫细胞相互作用已被描述，促进这些影响：接触介导相互作用或肿瘤分泌配体。肿瘤利用的接触介导免疫抑制的一个研究最充分和临床可治愈的机制是PD-L1的表达，它与T细胞上的PD-1相互作用，以抑制其激活和功能1，2。对由多种活化免疫细胞表达的干扰素伽马（IFN®）作出反应，肿瘤细胞可以增加PD-L1的表达，导致PD-1表达活性T细胞的耗尽，从而阻止它们有效消灭肿瘤细胞3。使用抗体来阻止PD-L1和PD-1之间的相互作用，目前用于治疗人类多种癌症类型4。鉴于这一临床成功和其他，肿瘤衍生免疫抑制机制的鉴定和靶向越来越受到重视。
除了抑制适应性免疫外，肿瘤还已知会分泌抑制先天免疫细胞的亲炎反应的因素。肿瘤衍生或肿瘤诱导的分泌物，包括IL-6、IL-10、VEGF、IL-23和菌群刺激因子（CSF-1），已被证明能抑制肿瘤微环境中自然杀伤细胞（NK）、粒细胞和树突状细胞的抗肿瘤反应5、6、7。肿瘤细胞也可以分泌因子，扭曲肿瘤微环境中骨髓衍生细胞的招募和分化，促进抑制T细胞活化8，9。
对肿瘤进展有深远影响的一种先天免疫细胞是巨噬细胞。多年来，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的存在一直被用作患者生存的负预后10。免疫抑制性TAM抑制肿瘤免疫细胞介导清除的概念是在40多年前提出的。最近，已经表明，巨噬菌体促进炎症反应可以降低调节，而亲肿瘤表型可以在肿瘤微环境中诱导。这些免疫抑制巨噬细胞有助于耐原反应，推动肿瘤进展和耐化学和免疫治疗12。鉴于巨噬细胞往往是肿瘤最丰富的白细胞之一，恢复其肿瘤特异性免疫活性是抗癌治疗物13的潜在靶点。
虽然肿瘤细胞和巨噬细胞之间的接触介导相互作用可以通过直接共培养进行建模，但使用渗透膜支持可以阐明哪些肿瘤分泌因子是免疫调节，而不会产生肿瘤-免疫细胞-细胞接触的潜在混淆影响。使用某种类似的方法，其他人已经证明了识别微胶质/神经元相互作用14以及肿瘤细胞与中皮细胞15分泌因子的潜力。我们还成功地利用这种共培养技术来描述肿瘤分泌蛋白Pros1的作用，这种蛋白质在用LPS和干扰素伽马16刺激围层巨噬细胞后，作为促进炎症基因表达的抑制者的作用。在这里，我们描述了一个简单明了的方法，可以用来询问肿瘤分泌因子如何影响巨噬菌体活化。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的共同培养测定是先前建立的测定的一种修改，允许研究免疫细胞激活的肿瘤分泌因子。虽然细胞-细胞接触已知能诱导免疫活动的变化，但肿瘤分泌配体调节免疫活化的能力却不太了解。我们描述了一种方法，与直接共培养不同，它可以用来询问肿瘤衍生的分泌因子如何影响免疫细胞激活，而不会混淆接触介导信号的性质。鉴于肿瘤分泌配体在免疫抑制中的潜在临床重要性，这种方法提…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
埃里克·乌比尔部分由美国癌症协会博士后奖学金（128770-PF-15-216-01-LIB）资助。这项工作得到了NIH（R01-CA205398）的资助和乳腺癌研究基金会（BCRF-18-041）对HSE的资助。
Materials
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
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