Summary
Her præsenterer vi en metode ved hjælp af gennemtrængelig membran understøtninger til at lette studiet af ikke-kontakt paracrine signalering anvendes af tumorceller til at undertrykke immunresponset. Systemet er modtagelig for at studere rollen som tumor-udskillede faktorer i dæmpning makrofag aktivering.
Abstract
Tumor-afledte paracrine signalering er en overset komponent af lokale immunsuppression og kan føre til en eftergivende miljø for fortsat kræft vækst og metastase. Paracrine signaler kan involvere celle-celle kontakt mellem forskellige celletyper, såsom PD-L1 udtrykt på overfladen af tumorer interagere direkte med PD-1 på overfladen af T-celler, eller sekretionen af ligander af en tumor celle til at påvirke en immuncelle. Her beskriver vi en co-kultur metode til at afhøre virkningerne af tumor-udskilt ligander på immuncelle (macrophage) aktivering. Denne enkle procedure udnytter kommercielt tilgængelige 0,4 μm polycarbonat membran gennemtrængelig understøtninger og standard vævskultur plader. I den beskrevne proces dyrkes makrofager i det øvre kammer og tumorcellerne i det nedre kammer. Tilstedeværelsen af 0,4 μm barrieren giver mulighed for studiet af intercellulære signalering uden den forstyrrende variabel af fysisk kontakt, fordi de to celletyper deler det samme medium og eksponering for paracrine ligands. Denne tilgang kan kombineres med andre, såsom genetiske ændringer af makrofag (f. eks isolation fra genetiske knock-out mus) eller tumor (f. eks, CRISPR-medierede ændringer) for at studere rollen af specifikke udskillede faktorer og receptorer. Tilgangen egner sig også til standard molekylære biologiske analyser, såsom kvantitativ reverse transkriptionspolymerasekæde reaktion (qRT-PCR) eller Western blot-analyse, uden behov for flow sortering for at adskille de to cellepopulationer. Enzym-sammenkædede immunosorbent assays (Elisas) kan ligeledes udnyttes til at måle udskillede ligander for bedre at forstå den dynamiske interaktion af celle signalering i flere celletype kontekst. Samkulturens varighed kan også varieres for studiet af tids regulerede begivenheder. Denne Co-kultur metode er et robust værktøj, der letter studiet af tumor-udskilt signaler i immun sammenhæng.
Introduction
Nylige undersøgelser har fokuseret på kræftcellernes evne til at undgå påvisning af immunceller, undertrykke lokal immun aktivering eller til at producere en tolerogenic tumor-eftergivende Milieu i Tumorens mikromiljø. To brede klasser af tumor og immuncelle interaktioner er blevet beskrevet, at lette disse virkninger: kontakt-medierede interaktioner eller tumor-udskilt ligands. En af de mest velunder søgt og klinisk Tractable mekanismer af kontakt-medieret immunhæmning udnyttet af tumorer er udtryk for PD-L1, som interagerer med PD-1 på T-celler til at hæmme deres aktivering og funktion1,2. Som respons på interferon-gamma (IFNγ), som udtrykkes af en række aktiverede immunceller, kan tumorceller øge ekspression af PD-L1 for at fremkalde udmattelse af PD-1-udtrykte aktiverede T-celler og derved forhindre dem i effektivt at udrydde tumorceller3. Brugen af antistoffer til at blokere interaktionen mellem PD-L1 og PD-1 anvendes i øjeblikket til at behandle flere kræfttyper hos mennesker4. I lyset af denne kliniske succes og andre, identifikation og målretning af tumor-afledte Immunsuppressive mekanismer har fået stigende opmærksomhed.
Ud over undertrykkelse af adaptive immunitet, tumorer er også kendt for at udskilte faktorer, der undertrykker den pro-inflammatoriske respons af medfødte immunceller. Tumor-afledte eller tumor-induceret sekreter, herunder Il-6, IL-10, VEGF, Il-23, og kolonistimulerende faktor (CSF-1), har vist sig at hæmme antitumor respons af naturlige Killer (NK) celler, granulocytter, og dendritiske celler i tumor mikromiljø5,6,7. Tumorceller kan også udskiller faktorer, der skæv rekruttering og differentiering af myeloid-afledte celler i tumor mikromiljø til at fremme undertrykkelse af T-celle aktivering8,9.
En type af medfødte immunceller, der har en dybtgående effekt på tumorprogression er makrofag. I mange år, tilstedeværelsen af tumor-associerede makrofager (TAMs) er blevet brugt som en negativ prognose af patientens overlevelse10. Konceptet om, at Immunsuppressive TAMs dæmper immuncelle-medieret clearance af tumorer blev introduceret mere end 40 år siden11. For nylig har det vist sig, at makrofag Pro-inflammatorisk respons kan nedreguleres, mens en Pro-tumor fænotype kan induceres i tumor mikromiljø. Disse Immunsuppressive makrofager kan bidrage til en tolerogenic respons, kørsel tumorprogression og resistens over for kemo-og immunterapi12. I betragtning af at makrofager er ofte en af de mest rigelige leukocytter med tumoren, restaurering af deres tumor-specifikke immunaktivitet repræsenterer et potentielt mål for anticancer Therapeutics13.
Mens kontakt medierede interaktioner mellem tumorceller og makrofager kan modelleret gennem direkte coculture, kan brugen af gennemtrængelig membran understøtninger belyse, hvilke tumor-udskilt faktorer er immunmodulerende uden potentielt forstyrrende indflydelse af tumor-immuncelle-celle kontakt. Ved hjælp af noget lignende metoder, andre har demonstreret potentialet for at identificere udskillede faktorer i microglia/neuronal interaktioner14 samt tumorceller med mesotheliale celler15. Vi har også med held brugt denne Co-kultur teknik til at karakterisere rollen som en tumor-udskillet protein, Pros1, som en suppressor af Pro-inflammatorisk genekspression efter stimulering af peritonealdialyse makrofager med LPS og interferon-gamma16. Her beskriver vi en enkel metode, der kan bruges til at afhøre hvordan tumor-udskillede faktorer kan påvirke makrofag aktivering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer i forbindelse med høst og brug af murine peritonealdialyse makrofager blev udført på University of North Carolina på Chapel Hill (UNC) og blev godkendt af UNC institutionel Animal Care og use Committee (IACUC).
1. makrofag kultur
Bemærk: denne procedure kan udnytte primære peritoneale makrofager (beskrevet i detaljer nedenfor), knoglemarv-afledte makrofager, eller makrofag cellelinjer såsom J774 (ATCC) eller RAW264 (ATCC).
- Høst peritonealdialyse makrofager som tidligere beskrevet16,17 og plade direkte ind i det øverste kammer (r) af en 0,4 μm polyester membran Indsæt Co-kultur 6 brønd plade (figur 1a).
Bemærk: den omtrentlige udbytte af makrofager fra hver isolation er 1 x 106 celler i alt, så det gennemsnitlige antal celler pr brønd er ~ 1.5-1.6 x 105 celler i en 6 brønd plade. - Kultur de høstede makrofager i Dulbecco's modificerede Eagle medium (DMEM)/F12, 10% føtal bovint serum (FBS), 1x penicillin/streptomycin, 20 ng/mL makrofag kolonistimulerende faktor (M-CSF) i 3 dage ved 37 °C, 5% CO2.
Bemærk: det øvre kammer indeholder 1 ml kulturmedium, mens det nedre kammer er fyldt med 1,5 ml. Mediet skal tilføjes til hvert kammer.
2. coculture af tumorceller med makrofager
- Før brug, kultur kommercielt tilgængelige tumorceller i deres respektive medium efter ATCC-anbefalede vævskultur metoder.
- Vask over siddende tumorceller én gang med fosfat bufferet saltvand (PBS), tilsæt 0,05% trypsin + ethylenediaminetetraeddikesyre (EDTA), og Inkuber ved 37 °C, indtil cellerne løsnes. Resuspender cellerne i FBS, der indeholder medium, kvantiterer det samlede antal celler ved hjælp af et hemocytometer eller en celle tæller, og centrifuger derefter i 5 minutter ved 220 x g til pellet.
- Under centrifugering aspirerer mediet fra de øvre og nedre kamre i de makrofag-holdige gennemtrængelig membran støtteplader og udskiftes med frisk medium.
- For lavere kamre, hvor tumorceller vil blive belagt, fyldes med 1 mL medium i stedet for 1,5 mL for at tillade tilstrækkelig volumen for celle tilsætning.
- Aspirér medium fra pelleterede tumorceller og resuspension celler i DMEM/F12 med 10% FBS, 1x penicillin/streptomycin, og 20 ng/mL M-CSF i en koncentration på 3 x 105 celler/ml.
- Tilsæt 0,5 mL af 3 x 105 celler/ml tumorceller til det nedre kammer af ønskede brønde (figur 1b).
Bemærk: cellerne kan behandles med det samme.
3. behandling af co-dyrkede celler
- At inducere makrofag Pro-inflammatorisk genekspression, behandle enkeltvis eller co-dyrkede makrofager ved tilsætning af 100 ng/mL IFNγ og 50 ng/mL LPS.
- Varier varigheden af behandlingstiderne i kulturen efter behov. Makrofag Aktivering sker inden for 2 h og nogle tumor-medieret undertrykkelse sker ved 8 h. co-kultur for 24 h giver robust og konsekvent tumor-afledte undertrykkelse.
Bemærk: Alternativt kan makrofager induceres til at vedtage en Pro-sårheling fænotype gennem tilsætning af faktorer som interleukin-10 (IL10), og effekten af tumor-udskillet ligand vurderet.
- Varier varigheden af behandlingstiderne i kulturen efter behov. Makrofag Aktivering sker inden for 2 h og nogle tumor-medieret undertrykkelse sker ved 8 h. co-kultur for 24 h giver robust og konsekvent tumor-afledte undertrykkelse.
- Som en negativ kontrol, kultur makrofager enkeltvis og forlade ubehandlet. Som en positiv kontrol, behandle enkeltvis dyrkede makrofager med 100 ng/mL IFNγ og 50 ng/mL LPS.
4. downstream-analyse af co-dyrkede celler
- Efter ønsket inkubationstid er forløbet, Isoler celle lysatet eller konditioneret kulturmedium som ønsket, afhængigt af test behov.
- For at isolere celle lysatet til kvantitativ polymerasekæde reaktion (qPCR) analyse, Aspirér mediet fra begge kamre af brønden og vask en gang med 2 mL PBS. Anvend RNA-lysis-buffer på det øverste kammer, der indeholder makrofager. Skrabe membranen forsigtigt for at frigive celle lysatet, og Overfør til en opsamlings slange til videre behandling i henhold til RNA-isolations sættets producent protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at bestemme effekten af tumor-udskillede ligander på makrofag polarisering, den beskrevne procedure blev udnyttet. Peritoneal makrofager, der dyrkes i fravær af tumorceller, blev anvendt som negative (ubehandlet = længst til venstre) og positiv (IFNγ og LPS stimuleret = 2nd fra venstre) Kontroller (figur 2a). Alternativt blev peritonealdialyse makrofager Co-dyrket med B16F10 melanom tumorceller (ATCC) (figur 1a). Umiddelbart efter plating blev cellerne enten behandlet med IFNγ og LPS eller venstre ubehandlet. Efter 24 timers kultur blev makrofager høstet, RNA forberedt og qRT-PCR udført for at måle ekspression af pro-inflammatoriske gener. Ved hjælp af co-kultur-system, der er beskrevet her, viser vi, at peritonealdialyse makrofager Co-dyrkede i nærværelse af B16F10 tumorceller, men uden at aktivere stimuli (LPS + IFNγ), ikke øge ekspression af pro-inflammatoriske-associerede gener (figur 2a, B16F10 membran/ubehandlet). Dette indebærer, at tumor-udskilt ligander er 1) ikke tilstrækkelig i sig selv til at fremkalde Pro-inflammatorisk genekspression eller 2) Hvis der er immun aktivering af tumor sekreter, paracrine ligander er tilstrækkelige til at undertrykke det til naive niveauer. Denne Co-kultur metode illustrerer, at når makrofager polariseret af IFNγ og LPS dyrkes i nærværelse af tumorceller, undertrykkelse af inflammation-associeret genekspression blev reduceret med så meget som 60% (figur 2a, B16F10 membran/ifnγ + LPS). Der blev observeret et sammenligneligt niveau af makrofag Pro-inflammatorisk gen suppression, når murine makrofag Cell line J774 blev erstattet af peritoneale makrofager (figur 2b).
Vores tidligere arbejde identificeret Pros1 som en tumor-udskillet faktor, der kan hæmme makrofag aktivering16. Ved hjælp af den gennemtrængelig membran støtte Co-Culture model i forbindelse med Elisa, vi analyseret koncentrationen af Pros1 i konditioneret medium efter 24 h. Vi bemærkede, at i konditioneret medium fra IFNγ og LPS behandlet B16F10 melanom celler Pros1 blev udtrykt ved 475 ng/mL ± 120 ng/mL (figur 3). Peritoneal makrofager behandlet under samme forhold udtrykte Pros1 ved 61 ng/mL ± 5 ng/mL (figur 3). Interessant, når Co-dyrkede, Pros1 i IFNγ og LPS behandlet godt var 86 ng/mL ± 15 ng/mL. Dette tyder på, at 1) makrofager forbruge tumor-udskillet Pros1 eller 2) mængden af Pros1 udskilles af B16F10 celler er væsentligt faldet, når i nærværelse af makrofager. Resultater fra både figur 2 og figur 3 fremhæver dybtgående ændringer af makrofag aktivering og paracrine signalering, når makrofager er co-kultiveret med tumorceller.
Figur 1. Skematisk for permeabel membran støtte Co-kultur af tumorceller med makrofager. Positive og negative behandlings kontroller kan anvendes på enkeltvis dyrkede makrofag brønde (A). For at bestemme virkningerne af tumor-udskillede signaler på makrofag aktivering, er makrofager dyrkes i det øvre kammer af gennemtrængelig membran støtte Co-kultur plader og tumorceller kultiveret i det nedre kammer (B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Tumor paracrine signaler undertrykke makrofag Pro-inflammatorisk polarisering. Makrofag ekspression af betændelse-associerede gener blev analyseret af qRT-PCR i ubehandlet eller IFNγ og LPS stimuleret makrofager i nærværelse af eller fravær af tumorceller. Ekspression af pro-inflammatoriske gener blev reduceret i peritonealdialyse makrofager (A) eller J774 makrofag cellelinje (B) , når der dyrkes i nærværelse af tumorceller adskilt af en permeabel membran støtte, således at effekten blev overført af en paracrine opløselige ligand. *p < 0,05 i forhold til ubehandlet, †p < 0,05 i forhold til ifnγ og LPS stimuleret. Data er betyde ± SEM; p -værdier beregnet ved tosidet student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Coculture af tumorceller og makrofager fører til ændringer i mængden af tumor-udskillet paracrine ligander fundet i konditioneret medium. Elisa blev brugt til at bestemme koncentrationen af Pros1 i tumor alene, makrofag alene, eller co-dyrkede konditioneret medium efter 24 h. co-kultur fører til et fald i mængden af Pros1 i forhold til tumor celle kun kontrol. *p < 0,05 i forhold til ubehandlet. p -værdier beregnet ved tosidet student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Co-kultur assay præsenteret her er en ændring af tidligere etablerede assays, der giver mulighed for studiet af tumor-udskilt faktorer på immuncelle aktivering. Mens celle-celle kontakt er kendt for at fremkalde ændringer i immunaktivitet, evnen af tumor-udskilt ligander at moduere immun aktivering er mindre godt forstået. Vi beskriver en metode, der i modsætning til direkte Co-kultur, kan bruges til at afhøre hvordan tumor-afledte udskilt faktorer påvirker immuncelle aktivering uden forstyrrende karakter af kontakt-medieret signalering. I betragtning af den potentielle kliniske betydning af tumor-udskillede ligander i immunsuppression, denne metode tilbyder en nem at bruge værktøj til at studere disse mekanismer på måder, der ikke er omfattet af direkte Co-kultur.
I det væsentlige, den Co-kultur metode, der er beskrevet her, involverer kulturen af makrofager (primære celler: Resident, knoglemarv-afledte, eller en makrofag cellelinje) med tumorceller (cellelinje eller primærceller) uden fysisk kontakt. Det er afgørende, at makrofager bliver dyrket på en 0,4 μm porestørrelse polyester membran indsats for at tillade fri permeabilitet af tumor-udskilte ligander samtidig forhindre mulig makrofag celle migration gennem filteret. Det er også vigtigt at tilføje den beskrevne mængde af kulturmedium til de øvre og nedre kamre for at sikre korrekt celle dækning. Eksperimentel design, såsom inkludering af én celletype kun kontrol, er en anden nøglefaktor, når planlægning af co-kultur eksperimenter. Flere andre faktorer, beskrevet mere detaljeret senere, kan også have virkninger på resultaterne af analysen, og det er vigtigt at holde sig i tankerne under studiet design.
To nyttige ændringer i den skitserede protokol til at overveje er varigheden af co-kultur eller det relative forhold mellem tumorceller til makrofager. I den beskrevne metode er makrofager og tumorceller belagt med omtrent lige store koncentrationer. Et vigtigt punkt at overveje, er den relative andel af makrofager til tumorceller, der naturligt forekommer i tumor mikromiljø. For bedre at efterligne Tumorens mikromiljø kan den relative andel af makrofager ændres til at afspejle, hvad der findes inden for tumoren in vivo, selv om indledende arbejde kan være nødvendigt at etablere det korrekte forhold.
Et andet kritisk punkt, og mulig begrænsning af systemet, er, at behandlinger, der anvendes til at stimulere en celletype i analysen kan have uventede eller utilsigtede virkninger på den anden celletype. Som beskrevet her, tilsætning af LPS og IFNγ er beregnet til at stimulere pro-inflammatoriske Gen ekspression i makrofager. Men i Ubil et al. vi viste, at IFNγ også inducerer ekspression og sekretion af immunosuppressive Pros116, og andre har vist virkningerne af LPS på tumorceller18. Det er derfor vigtigt at inkludere passende kontrolforanstaltninger for at overvåge potentielle off-Target eller utilsigtede virkninger på den anden celletype for at verificere eksperimentelle resultater. En metode, hvormed dette kan opnås, er ved at behandle individuelle celletyper med agenter af interesse og overvågning effekter ved hjælp af standard molekylær biologi assays.
Når du designer gennemtrængelig membran støtte eksperimenter, er det også vigtigt at overveje mulige diffusions gradienter af udskilt ligands. Den relative frekvens af ligand sekretion, varigheden af co-kulturen, og om kultur pladen vedligeholdes i en stationær position kan alle have virkninger på resultaterne. Desuden er det muligt for nogle udskillede ligander at holde sig til overfladen af kultur plader.
Mens de repræsentative resultater, der vises, er karakteristiske for dette system, graden af Pro-inflammatorisk gen suppression observeret, når Co-culturing andre tumor linjer kan variere dramatisk. I Ubil et al., viser vi, at nogle humane tumor linjer kan næsten helt undertrykke den pro-inflammatoriske Gen ekspression af en menneskelig makrofag cellelinje16. Omvendt kan andre tumor celletyper eller cellelinjer variere betydeligt i deres Immunsuppressive egenskaber. Årsagen til disse afvigelser er uklar, men er et område for yderligere undersøgelse.
Gennemtrængelig membran støtte Co-kultur er en robust metode, der let kan ændres til at løse en række spørgsmål og kan tilpasses til en række molekylærbiologiske udlæsninger, herunder qRT-PCR, Western blot, og ELISA. Systemet kan bruges til at afhøre individuelle gen funktioner, såsom ligander eller receptorer, når genetiske ændringer som dem fra genslettede mus eller crispr redigeringer er lavet til enten makrofager eller tumorceller. Systemet er også modtagelig for studiet af farmakologiske aktivatorer eller hæmmere og deres virkninger på paracrine signalering. Også, mens ikke diskuteret her, systemet kan bruges til at studere virkningerne af immun aktivering på tumor celle genekspression.
Denne metode er blevet brugt med succes i opdagelsen og karakterisering af en roman funktion for en immunsuppressiv, tumor-udskillet ligand. Dette robuste værktøj kan udnyttes til at afhøre den meget bredere delmængde af ikke-kontakt tumor/immun interaktioner i håb om at opdage nye terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Eric Ubil blev delvist finansieret af American Cancer Society postdoc Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Arbejdet blev støttet af et stipendium fra NIH (R01-CA205398) og en fond for forskning i bryst cancer (BCRF-18-041) til HSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
