Summary
כאן, אנו מציגים שיטה באמצעות ממברנה חדיר תומך כדי להקל על המחקר של אי-מגע הפרדרין איתות בשימוש על ידי תאים סרטניים כדי לדכא את התגובה החיסונית. המערכת היא קלה ללמוד את התפקיד של גורמים מופרש הגידול בהפעלת לחות מקרופאג.
Abstract
הגידול הנגזר הקרנף איתות הוא רכיב מתעלמים של דיכוי חיסוני מקומי והוא יכול להוביל לסביבה מתירני עבור גידול בסרטן המתמשך גרורות. אותות הפרדרין יכול לכלול מגע תא תא בין סוגי תאים שונים, כגון PD-L1 ביטא על פני השטח של גידולים הקשורים ישירות עם PD-1 על פני השטח של תאי T, או הפרשת ליגולים על ידי תא הגידול כדי להשפיע על תא החיסון. כאן אנו מתארים שיטה שיתוף תרבות כדי לחקור את ההשפעות של הגידול מופרש ליגנדס תא החיסונית (מקרופאג) הפעלה. הליך זה פשוט מנצל מסחרית זמין 0.4 יקרומטר ממברנה פוליקרבונט חדירות תומך ולוחות התרבות רקמה סטנדרטית. בתהליך המתואר, מקרופאגים הם מתורבתים בחדר העליון תאים סרטניים בחדר התחתון. הנוכחות של מכשול 0.4 יקרומטר מאפשר לימוד של איתות התרבות ללא משתנה מייסד של מגע פיזי, כי שני סוגי התא לחלוק את אותו בינונית וחשיפה לליפות הקרנף. גישה זו יכולה להיות משולבת עם אחרים, כגון שינויים גנטיים של המקרופאג (למשל, בידוד מן העכברים לנקוש החוצה גנטית) או גידול (למשל, CRISPR-בתיווך שינויים) כדי ללמוד את התפקיד של גורמים מופרשים ספציפיים וקולטנים. הגישה גם משאיל את עצמה לניתוחים ביולוגיים מולקולריים סטנדרטיים כגון שעתוק הפוכה כמותית תגובת שרשרת (רביעיית-PCR) או ניתוח כתמי אבן מערבי, ללא צורך במיון זרימה כדי להפריד בין שתי אוכלוסיות תאים. חיסוני מקושרים אנזים בחני (אליאס) יכול להיות באופן דומה להיות מנוצל כדי למדוד מופרש ליגנדס כדי להבין טוב יותר את האינטראקציה הדינמית של איתות התא בהקשר סוג תא מרובים. משך התרבות המשותף יכול להיות מגוון גם לחקר האירועים המווסתים באופן זמני. שיטה זו שיתוף תרבות היא כלי חזק המקל על חקר אותות הגידול מופרש בהקשר החיסונית.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדו ביכולת של תאים סרטניים כדי למנוע זיהוי על ידי תאים חיסוניים, לדכא את ההפעלה החיסונית המקומית, או לייצר הגידול tolerogenic מתירני הגידול מיקרוסביבה. שתי שיעורים רחבים של גידול ואינטראקציות תאים החיסונית תוארו כי להקל על ההשפעות הללו: קשר-מתווך אינטראקציות או ליגניות המופרשים. אחד הטוב ביותר לחקור מנגנוני צייתן קלינית של קשר-תיווך החיסונית עיכוב מנוצל על ידי גידולים היא הביטוי של pd-L1, אשר אינטראקציה עם PD-1 על התאים T לעכב את ההפעלה שלהם פונקציה1,2. בתגובה אינטרפרון-גמא (IFNγ), אשר מתבטא על ידי מספר תאים חיסוניים מופעלים, תאים סרטניים יכולים להגביר את הביטוי של PD-L1 כדי לגרום לתשישות של PD-1 – הבעת הפעלת תאי T, ובכך למנוע מהם ביעילות להשמיד תאים סרטניים3. השימוש נוגדנים לחסום את האינטראקציה בין PD-L1 ו-PD-1 משמש כיום לטיפול בסוגי סרטן מרובים בבני אדם4. לאור ההצלחה הקלינית הזאת ואחרים, הזיהוי והמיקוד של מנגנוני הדיכוי האנטי-סרטניים, קיבל את תשומת הלב הגוברת.
מעבר דיכוי של חסינות אדפטיבית, גידולים ידועים גם להפריש גורמים לדכא את התגובות הפרו דלקתיות של תאים חיסוניים מולדים. גידול נגזר או הפרשות הגידול המושרה, כולל il-6, il-10, וגרה, il-23, ואת המושבה גורם ממריץ (שדרתי-1), הוכחו לעכב את תגובות הגידול של הרוצח הטבעי (NK) תאים, גרנולוציטים, ותאים דנדריטים ב מיקרוסביבה הגידול5,6,7. תאים סרטניים יכולים גם להפריש גורמים הטיית הגיוס והבידול של תאים מיאלואידית-נגזר במיקרו הסביבה הגידול כדי לקדם את הדיכוי של ההפעלה תא T8,9.
סוג אחד של תא מולדים החיסון כי יש השפעה עמוקה על התקדמות הגידול הוא מקרופאג. במשך שנים רבות, הנוכחות של מקרופאגים הקשורים לגידול (TAMs) השתמשו כתחזיות שליליות של הישרדות החולה10. המושג כי מדכאים TAMs לצנן את התא החיסונית מתווכת הסיווג של גידולים הוצג לפני יותר מ 40 שנים11. לאחרונה, זה הוכח כי התגובה מקרופאג pro-דלקתיות יכול להיות מוסדר בעוד פנוטיפ הגידול pro יכול להיגרם מיקרוסביבה הגידול. אלה מקרופאגים מדכאים יכול לתרום לתגובה tolerogenic, נהיגה התקדמות הגידול ועמידות לכימותרפיה-טיפול חיסוני12. בהינתן כי מקרופאגים הם לעתים קרובות אחד לוקיציטים הנפוץ ביותר עם הגידול, שחזור של פעילות החיסון הספציפי שלהם לגידול מייצג יעד פוטנציאלי עבור תרופות נגד סרטן therapeutics13.
בעוד קשר-מתווך אינטראקציה בין תאים סרטניים מקרופאגים ניתן להקים באמצעות התרבות coculture ישירה, השימוש של ממברנה חדיר תומך יכול להבהיר איזה גורם הגידול מופרש הם החיסונית ללא השפעה הפוטנציאל של הגידול-תא החיסונית החיסון המגע. באמצעות שיטות דומות במקצת, אחרים הוכיחו את הפוטנציאל של זיהוי גורמים מופרש ב microglia/האינטראקציות נוירואליות14 , כמו גם תאים סרטניים עם תאים mesothelial15. יש לנו גם בהצלחה את הטכניקה שיתוף התרבות הזאת כדי לאפיין את התפקיד של חלבון מופרש הגידול, Pros1, כמו מדכא של ביטוי גנים פרו דלקתית לאחר גירוי של מקרופאגים הצפק עם LPS ו אינטרפרון-גמא16. כאן אנו מתארים מתודולוגיה ישירה כי ניתן להשתמש כדי לחקור כיצד גורמים מופרש הגידול יכול להשפיע על מקרופאג הפעלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הקשורים הקציר והשימוש של מקרופאגים הצפק מוריין נערכו באוניברסיטת צפון קרוליינה בצ היל (UNC) ואושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים UNC והשתמש הוועדה (IACUC).
1. תרבות מקרופאג
הערה: הליך זה יכול לנצל את מקרופאגים הצפק הראשי (המתואר בפירוט להלן), מח עצם הנגזר מקרופאגים, או מקרופאג שורות תא כגון J774 (ATCC) או RAW264 (ATCC).
- קציר מקרופאגים הצפק כפי שתוארו בעבר16,17 ו צלחת ישירות לתוך החדר העליון (s) של ממברנה פוליאסטר מ0.4 יקרומטר להוסיף שיתוף תרבות 6 צלחת הבאר (איור 1a).
הערה: התשואה המשוערת של מקרופאגים מכל בידוד הוא 1 x 106 הכולל תאים, כך המספר הממוצע של תאים לכל טוב הוא ~ 1.5 – 1.6 x 105 תאים בצלחת 6 היטב. - תרבות מקרופאגים שנקטפו ב-בינוני הנשר המתוקן של דולבco (DMEM)/F12, 10% סרום של שור עוברי (FBS), 1 x פניצילין/סטרפטומיצין, 20 ng/mL מקרופאג המושבה גורם מגרה (M-שדרתי) במשך 3 ימים ב 37 ° c, 5% CO2.
הערה: החדר העליון מכיל 1 מ ל של מדיום תרבות בעוד החדר התחתון מתמלא 1.5 mL. יש להוסיף את המדיום לכל חדר.
2. התרבות של תאים סרטניים עם מקרופאגים
- לפני השימוש, תרבות תאים סרטניים זמינים מסחרית במדיום המתאים שלהם בעקבות השיטות המומלצות לתרבות רקמות רקמה.
- לשטוף תאים סרטניים חסיד פעם עם מלוחים באגירה פוספט (PBS), להוסיף 0.05% טריפסין + ethylenedi37 amiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiiii השהה מחדש את התאים ב-FBS המכיל בינוני, כימות המספר הכולל של תאים באמצעות הומוציטוטומטר או מונה תאים, ולאחר מכן צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 220 x g כדי גלולה.
- במהלך הצנטריפוגה, מלבין את המדיום מן התאים העליונים והתחתונים של לוחיות התמיכה של קרום הממברנה המקרופאג המכילות ולהחליף במדיום טרי.
- לחדרי התחתון שבו תאים סרטניים יהיה מצופה, למלא עם 1 מ ל של בינונית במקום 1.5 mL כדי לאפשר נפח מספיק עבור התוספת התא.
- המדיום מוחלק מתאי הגידול מחדש ומשהה את התאים החוזרים ב-DMEM/F12 עם 10% FBS, 1x פניצילין/סטרפטומיצין, ו 20 ng/mL M-שדרתי בריכוז של 3 x 105 תאים/ml.
- הוסף 0.5 mL של 3 x 105 תאים/ml תאים סרטניים לחדר התחתון של בארות הרצוי (איור 1b).
הערה: ניתן לטפל בתאים באופן מיידי.
3. טיפול בתאים משותפים
- כדי לגרום מקרופאג pro-דלקתיות ביטוי גנטי, לטפל ביחידים או שיתוף מקרופאגים על ידי הוספת 100 ng/mL IFNγ ו 50 ng/mL LPS.
- לשנות את משך זמני הטיפול בתרבות לפי הצורך. הפעלה מקרופאג מתרחשת בתוך 2 h וכמה מתווכת הגידול מתווך מתרחשת על ידי 8 h. שיתוף התרבות עבור 24 התשואות הגידול יציב ועקבי הדיכוי הנגזר.
הערה: לחילופין, מקרופאגים יכולים להיות המושרה כדי לאמץ את הטיפול הפרו הפצע הריפוי דרך התוספת של גורמים כגון interleukin 10 (IL10), ואת ההשפעה של הגידול מופרש ליגנד המשוער.
- לשנות את משך זמני הטיפול בתרבות לפי הצורך. הפעלה מקרופאג מתרחשת בתוך 2 h וכמה מתווכת הגידול מתווך מתרחשת על ידי 8 h. שיתוף התרבות עבור 24 התשואות הגידול יציב ועקבי הדיכוי הנגזר.
- כשליטה שלילית, מקרופאגים של התרבות ביחידים ולא מטופל. בתור שליטה חיובית, לטפל ביחידים מקרופאגים תרבותי עם 100 ng/mL IFNγ ו 50 ng/mL LPS.
4. ניתוח במטה של תאים משותפים
- לאחר זמן הדגירה הרצוי חלף, לבודד את התא ליפוסט או בינוני תרבות ממוזג כרצונך, בהתאם לצורכי הבדיקה.
- כדי לבודד את התא ליפוסט עבור תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) ניתוח, לחלק את התקשורת משני התאים של הבאר ולשטוף פעם אחת עם 2 מ ל של PBS. החל מאגר לפירוק RNA לחדר העליון המכיל את מקרופאגים. בעדינות לגרד את הקרום כדי לשחרר את התא ליפוסט, ולהעביר לצינור הקולקציה לעיבוד נוסף בהתאם לפרוטוקול של היצרן בידוד RNA ערכת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי לקבוע את ההשפעה של ליגניות מופרש בגידולים על מקרופאג polarization, ההליך המתואר היה מנוצל. מקרופאגים הצפק תרבותי בהעדר תאים סרטניים שימשו שלילית (מטופל = רחוק משמאל) וחיובי (IFNγ ו-LPS מגורה = 2nd משמאל) פקדים (איור 2a). לחילופין, מקרופאגים הצפק היו שיתוף תרבותי עם תאים סרטניים B16F10 מלנומה (ATCC) (איור 1A). מיד לאחר ציפוי, תאים היו מטופלים עם IFNγ ו LPS או לא מטופל. לאחר 24 שעות של תרבות, מקרופאגים נקצרו, RNA שהוכנו, ו רביעיית-PCR הופיעו כדי למדוד את הביטוי של גנים פרו דלקתיים. באמצעות מערכת שיתוף התרבות המתוארים כאן, אנו מראים כי מקרופאגים הצפק שיתוף תרבותי בנוכחות של תאים סרטניים B16F10, אבל בלי הפעלת גירויים (LPS + IFNγ), לא להגדיל את הביטוי של הגנים pro-דלקתיות הקשורים (איור 2A, B16F10 קרום/לא מטופל). זה מרמז כי ליגניות מופרש הגידול הם 1) לא מספיק על ידי עצמם כדי לגרום pro-דלקתיות ביטוי גנים או 2) אם יש הפעלה חיסונית על ידי הפרשות הגידול, ליגרין הקרנף מספיק כדי לדכא אותו רמות נאיבי. זו שיטת שיתוף התרבות ממחישה כי כאשר מקרופאגים מקוטב על ידי IFNγ ו LPS הם מתורבתים בנוכחות של תאים סרטניים, דיכוי של ביטוי גנטי הקשורים לדלקת הופחת על ידי כמו 60% (איור 2A, B16F10 קרום/IFNΓ + lps). רמה דומה של דיכוי מקרופאג pro-דלקתיים הגנטי נצפתה כאשר קו מקרופאג תא murine J774 היה מוחלף עבור מקרופאגים הצפק (איור 2B).
העבודה הקודמת שלנו זיהה Pros1 כגורם המופרש הגידול שיכול לעכב את ההפעלה מקרופאג16. באמצעות הממברנה החדיר לתמוך מודל שיתוף תרבות בשילוב עם אליסה, אנו מPros1 את הריכוז של המדיום הממוזג לאחר 24 שעות. הבחנו כי בינוני ממוזג מ IFNγ ו LPS מטופלים B16F10 תאים מלנומה Pros1 ביטא 475 ng/mL ± 120 ng/mL (איור 3). מקרופאגים הצפק שטופלו באותם תנאים הביע Pros1 ב 61 ng/mL ± 5 ng/mL (איור 3). מעניין, כאשר שיתוף תרבותי, Pros1 בתוך IFNγ ו-LPS מטופלים היטב היה 86 ng/mL ± 15 ng/mL. זה מרמז כי 1) מקרופאגים צורכים גידול מופרש Pros1 או 2) כמות Pros1 מופרש על ידי B16F10 תאים ירד באופן משמעותי כאשר בנוכחות של מקרופאגים. תוצאות משני הדמות 2 ו איור 3 להדגיש שינויים עמוקים של הפעלה מקרופאג ואיתות הפרדרין כאשר מקרופאגים הם שיתוף תרבותי עם תאים סרטניים.
איור 1. תרשים סכימטי תמיכה ממברנה חדיר שיתוף תרבות של תאים סרטניים עם מקרופאגים. שולטת טיפול חיוביים ושליליים ניתן להחיל על ביחידים מקרופאג בארות תרבותי (א). כדי לקבוע את ההשפעות של אותות מופרש הגידול על הפעלת מקרופאג, מקרופאגים הם מתורבתים בחדר העליון של תמיכה ממברנה חדיר לוחות שיתוף תרבות ותאים סרטניים בחדר התחתון (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2. אותות הגידול הקרנף לדכא מקרופאג pro-דלקתיות הקיטוב. מקרופאג ביטוי של הגנים הקשורים לדלקת הואסף על ידי רביעיית-PCR בטיפול או IFNγ ו-LPS ממריצים מגרה בנוכחות או העדר של תאים סרטניים. ביטוי של גנים פרו-דלקתיים הצטמצמה ב מקרופאגים הצפק (A) או J774 מקרופאג תא (ב) כאשר מתורבתים בנוכחות של תאים סרטניים מופרדים על ידי תמיכה ממברנה חדיר כך את האפקט הועבר על ידי ליגרין מסיסים הקרנף. *p < 0.05 ביחס לא מטופל, †p < 0.05 ביחס IFNγ ו lps מגורה. הנתונים מתכוונים ל-± SEM; ערכי p המחושבים על-ידי בדיקת t דו-זנבית של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3. Coculture של תאים סרטניים מקרופאגים מוביל שינויים בכמות הגידול המופרש הגידולים שנמצאו במדיום ממוזג. אליסה היתה שימוש כדי לקבוע את הריכוז של Pros1 בגידול לבד, מקרופאג לבד, או שיתוף תרבותי בינוני ממוזג לאחר 24 h. co-תרבות מוביל ירידה בכמות Pros1 יחסית תא הגידול שולטת בלבד. *p < 0.05 ביחס לא מטופל. ערכי p המחושבים על-ידי בדיקת t דו-זנבית של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השינוי בתרבות שיתוף הציג כאן הוא שינוי של בחני שנקבעו בעבר, המאפשר לימוד של גורמים מופרש הגידול על הפעלת התא החיסונית. בעוד המגע תא התא ידוע כדי לגרום לשינויים בפעילות החיסונית, היכולת של הגידול המופרש גידולים לווסת את ההפעלה החיסונית הוא מובן פחות טוב. אנו מתארים שיטה אשר, שלא כמו שיתוף התרבות הישירה, ניתן להשתמש כדי לחקור כיצד הגידול נגזר הגורמים המופרשים ההשפעה על הפעלת התא החיסונית ללא האופי המייסד של הקשר-תיווך איתות. בהינתן החשיבות הקלינית הפוטנציאלית של ליגלים מופרש בגידולים בדיכוי חיסוני, שיטה זו מציעה כלי קל לשימוש כדי ללמוד מנגנונים אלה בדרכים שלא טופלו על ידי שיתוף התרבות ישיר.
בעיקרו של דבר, שיטת שיתוף תרבות שתוארה כאן כרוכה בתרבות של מקרופאגים (תאים עיקריים: תושב, מח עצם נגזר, או קו תא מקרופאג) עם תאים סרטניים (קו תא או תאים ראשוניים) ללא מגע פיזי. זה קריטי כי מקרופאגים להיות מתורבתים על 0.4 יקרומטר הנקבוביות גודל ממברנה פוליאסטר להוסיף לאפשר חדירות חופשיות של ליגניות הגידול מופרש תוך מניעת הגירה מקרופאג cell אפשרי דרך המסנן. חשוב גם להוסיף את הכמות המתוארת של בינונית תרבותית לתאים העליונים והתחתונים כדי להבטיח כיסוי תאים תקין. תכנון ניסיוני, כגון הכללה של סוג תא אחד בלבד, הוא גורם מפתח נוסף בעת תכנון ניסויים שותפים בתרבות. מספר גורמים נוספים, המתוארים בפירוט רב יותר מאוחר יותר, יכולים להיות בעלי השפעה על תוצאות העבודה, וחשוב לשמור על כל אחד מהם בזמן עיצוב הלמידה.
שני שינויים שימושיים לפרוטוקול מחולקת לשקול הם משך התרבות המשותף או היחס היחסי של תאים סרטניים מקרופאגים. בשיטה המתוארת, מקרופאגים ותאי גידול מצופים בריכוזים שווים בערך. נקודה חשובה לשקול הוא החלק היחסי של מקרופאגים לתאי הגידול, כי באופן טבעי מתרחשת מיקרוסביבה הגידול. כדי לחקות טוב יותר את מיקרוסביבה הגידול, היחס היחסי של מקרופאגים ניתן לשנות כדי לשקף את מה שנמצא בתוך הגידול ב vivo, למרות העבודה הראשונית עשוי להיות הכרחי כדי לקבוע את היחס הנכון.
נקודה קריטית נוספת, והגבלה אפשרית של המערכת, היא שטיפולים המוחלים על סוג תא אחד בבחינה עשויים להיות בעלי אפקטים בלתי צפויים או לא מכוונים בסוג התא השני. כפי שמתואר כאן, תוספת של LPS ו IFNγ מיועד לעורר את הביטוי הגן הפרו דלקתית ב מקרופאגים. עם זאת, באוביל et al. הראנו כי IFNγ גם מעורר את הביטוי והפרשה של מדכא חיסוני Pros116, ואחרים הראו את ההשפעות של lps על תאים סרטניים18. לכן חיוני לכלול את הפקדים המתאימים כדי לנטר פוטנציאל מחוץ ליעד או אפקטים לא מכוונים על סוג התא השני כדי לאמת את התוצאות הנסיוניות. שיטה אחת שבאמצעותה ניתן להשיג זאת היא על-ידי טיפול בסוגי תאים בודדים עם הסוכנים של השפעות הריבית והניטור באמצעות assays הביולוגיה המולקולרית הסטנדרטית.
כאשר מעצבים הממברנה החדיר תמיכה ניסויים, חשוב גם כדי לשקול את מעברי הצבע האפשריים דיפוזיה של ליגניות מופרש. השיעור היחסי של הפרשה, משך התרבות המשותף והשאלה אם לוחית התרבות נשמרת בתנוחה נייחת, יכולים להיות לכולם השפעות על התוצאות. בנוסף, ניתן לחלק את הלוחות המופרשים לפני השטח של לוחיות התרבות.
בעוד תוצאות הנציג המוצגות אופייניים למערכת זו, מידת דיכוי הגנים הפרו-דלקתית שנצפתה כאשר שיתוף קווי גידולים אחרים עשוי להשתנות באופן דרמטי. ב Ubil et al., אנו מראים כי כמה קווי הגידול האנושי יכול כמעט לחלוטין לדכא את הביטוי הגנטי הפרו-דלקתי של קו מקרופאג האנושי האדם16. לעומת זאת, סוגים אחרים של תאי הגידול או קווי התאים עשויים להשתנות באופן משמעותי ביכולות הדיכוי שלהם. הסיבה לשונויות אלה אינה ברורה, אך היא אזור ללימוד נוסף.
ממברנה חדיר תמיכה בשיתוף התרבות היא מתודולוגיה חזקה שניתן לשנות בקלות כדי לטפל במגוון שאלות וניתן להתאים למגוון של מספר ביולוגיה מולקולרית כולל רביעיית ה-PCR, אבן החשופה המערבית, ו-אליסה. המערכת יכולה לשמש כדי לחקור פונקציות גן בודדים, כגון ליגטרים או קולטנים, כאשר שינויים גנטיים כמו אלה מן העכברים שנמחקו או למחוק CRISPR נעשים או מקרופאגים או תאים סרטניים. המערכת היא גם קלה למחקר של מפעילי פרמקולוגית או מעכבי ואת ההשפעות שלהם על איתות הפרדרין. גם, בעוד לא דנו כאן, המערכת יכולה לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של הפעלה חיסונית על הביטוי הגנטי תא הגידול.
שיטה זו שימש בהצלחה בגילוי ואפיון של פונקציה חדשנית עבור מדכא חיסוני, מופרש גידולים הגידול. כלי זה חזק יכול להיות מנוצל כדי לחקור את מערכת המשנה הרחבה יותר של חוסר מגע הגידול/החיסון החיסונית בתקווה לגלות מטרות טיפוליות חדשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אריק Ubil היה ממומן, בין השאר, על ידי האגודה האמריקנית לסרטן החברה פוסט דוקטורט (128770-PF-15-216-01-LIB). העבודה נתמכה על ידי מענק NIH (R01-CA205398) ו סרטן השד מחקר הקרן פרס (BCRF 18-041) ל HSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
