Summary
Ici, nous présentons une méthode utilisant des supports perméables de membrane pour faciliter l'étude de la signalisation de paracrine de non-contact employée par des cellules de tumeur pour supprimer la réponse immunitaire. Le système est disposé à étudier le rôle des facteurs tumeur-sécrétés en amortissant l'activation de macrophage.
Abstract
La signalisation paracrine dérivée de tumeur est un composant négligé de l'immunosuppression locale et peut mener à un environnement permissif pour la croissance continue de cancer et la métatasie. Les signaux paracrines peuvent impliquer le contact cellule-cellule entre différents types de cellules, tels que PD-L1 exprimé sur la surface des tumeurs interagissant directement avec PD-1 sur la surface des cellules T, ou la sécrétion de ligands par une cellule tumorale pour affecter une cellule immunitaire. Ici nous décrivons une méthode de co-culture pour interroger les effets des ligands tumeur-sécrétés sur l'activation de cellules immunitaires (macrophage). Cette procédure simple utilise des supports perméables de la membrane de polycarbonate de 0,4 m disponible dans le commerce et des plaques de culture tissulaires standard. Dans le processus décrit, les macrophages sont cultivés dans la chambre supérieure et les cellules tumorales dans la chambre inférieure. La présence de la barrière de 0,4 m permet d'étudier la signalisation intercellulaire sans la variable confondante de contact physique, car les deux types de cellules partagent le même milieu et l'exposition aux ligands paracènes. Cette approche peut être combinée à d'autres, comme les altérations génétiques du macrophage (p. ex., l'isolement des souris génétiques knock-out) ou la tumeur (p. ex., les altérations négociées par CRISPR) pour étudier le rôle de facteurs et de récepteurs sécrétés spécifiques. L'approche se prête également à des analyses biologiques moléculaires standard telles que la réaction quantitative en chaîne de polymérase de transcription inversée (qRT-PCR) ou l'analyse occidentale de tache, sans la nécessité de trier le flux pour séparer les deux populations cellulaires. Les essais immunosorbent enzymatiques (ELISA) peuvent également être utilisés pour mesurer les ligands sécrétés afin de mieux comprendre l'interaction dynamique de la signalisation cellulaire dans le contexte du type de cellules multiples. La durée de la co-culture peut également être modifiée pour l'étude des événements temporels. Cette méthode de co-culture est un outil robuste qui facilite l'étude des signaux sécrétés par la tumeur dans le contexte immunitaire.
Introduction
Des études récentes ont porté sur la capacité des cellules cancéreuses à éviter la détection par les cellules immunitaires, à supprimer l'activation immunitaire locale ou à produire un milieu tolérogène de tumeur-permissive dans le microenvironnement de tumeur. Deux grandes classes d'interactions de tumeur et de cellules immunitaires ont été décrites qui facilitent ces effets : interactions contact-négociées ou ligands tumeur-scrétés. L'un des mécanismes les plus bien étudiés et cliniquement traitables de l'inhibition immunitaire par contact-négociée utilisée par les tumeurs est l'expression de PD-L1, qui interagit avec PD-1 sur les lymphocytes T pour inhiber leur activation et leur fonction1,2. En réponse à l'interféron-gamma (IFN), qui est exprimé par un certain nombre de cellules immunitaires activées, les cellules tumorales peuvent augmenter l'expression de PD-L1 pour induire l'épuisement des lymphocytes T activés PD-1-exprimant, les empêchant ainsi d'éradiquer efficacement les cellules tumorales3. L'utilisation d'anticorps pour bloquer l'interaction entre PD-L1 et PD-1 est actuellement utilisée pour traiter plusieurs types de cancer chez l'homme4. À la lumière de ce succès clinique et d'autres, l'identification et le ciblage des mécanismes immunosuppresseurs tumeur-dérivés a reçu l'attention croissante.
Au-delà de la suppression de l'immunité adaptative, les tumeurs sont également connues pour sécrétiser des facteurs qui suppriment les réponses pro-inflammatoires des cellules immunitaires innées. Les sécrétions tumorales ou induites par la tumeur, y compris IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, et le facteur stimulant de colonie (CSF-1), ont été montrées pour inhiber des réponses antitumorales des cellules de tueur naturel (NK), des granulocytes, et des cellules dendritiques dans le microenvironnement de tumeur5,6,7. Les cellules tumorales peuvent également sécréte des facteurs qui faussent le recrutement et la différenciation des cellules dérivées du myéloïde dans le microenvironnement tumoral pour favoriser la suppression de l'activation des lymphocytes T8,9.
Un type de cellule immunitaire innée qui a un effet profond sur la progression tumorale est le macrophage. Pendant de nombreuses années, la présence de macrophages tumeur-associés (TAMs) a été employé comme pronostic négatif de la surviepatiente 10. Le concept que les TAM immunosuppresseurs amortissent le dégagement immuno-négocié des tumeurs de cellules a été présenté il y a plus de 40 ans11. Plus récemment, il a été démontré que la réponse macrophage pro-inflammatoire peut être régulée tandis qu'un phénotype pro-tumoral peut être induit dans le microenvironnement tumoral. Ces macrophages immunosuppresseurs peuvent contribuer à une réponse tolérogène, conduisant la progression de tumeur et la résistance à la chimio- et à l'immunothérapie12. Étant donné que les macrophages sont souvent l'un des leucocytes les plus abondants avec la tumeur, la restauration de leur activité immunitaire tumeur-spécifique représente une cible potentielle pour les thérapies anticancéreuses13.
Tandis que les interactions contact-négociées entre les cellules de tumeur et les macrophages peuvent être modélisées par la coculture directe, l'utilisation des supports perméables de membrane peut élucider quels facteurs tumeur-sécrétés sont immunomodulatifs sans l'influence potentiellement confondante du contact tumeur-cellule-cellule immun. En utilisant des méthodes quelque peu similaires, d'autres ont démontré le potentiel d'identifier les facteurs sécrétés dans les microglies / interactions neuronales14 ainsi que les cellules tumorales avec des cellules méthéliales15. Nous avons également utilisé avec succès cette technique de co-culture pour caractériser le rôle d'une protéine tumeur-sécrétée, Pros1, comme un suppresseur de l'expression pro-inflammatoire de gène après la stimulation des macrophages péritonéaux avec LPS et interféron-gamma16. Ici nous décrivons une méthodologie simple qui peut être employée pour interroger comment les facteurs tumeur-sécrétés peuvent affecter l'activation de macrophage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Toutes les procédures liées à la récolte et à l'utilisation de macrophages péritonés murine ont été menées à l'Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (UNC) et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'UNC.
1. Culture Macrophage
REMARQUE : Cette procédure peut utiliser des macrophages péritonéaux primaires (décrits en détail ci-dessous), des macrophages dérivés de la moelle osseuse ou des lignées cellulaires macrophages comme J774 (ATCC) ou RAW264 (ATCC).
- Les macrophages péritonéaux de récolte tels que décrits précédemment16,17 et la plaque directement dans la chambre supérieure (s) d'un 0.4 'm polyester membrane insert co-culture 6 plaque de puits (Figure 1A).
REMARQUE : Le rendement approximatif des macrophages de chaque isolement est de 1 x 106 cellules au total, de sorte que le nombre moyen de cellules par puits est de 1,5 à 1,6 x 105 cellules dans une plaque de 6 puits. - Culture des macrophages récoltés dans le facteur stimulant de la colonie d'aigles modifiés (DMEM) de Dulbecco (DMEM)/F12, 10 % sérum bovin fœtal (FBS), 1x pénicilline/streptomycine, facteur de stimulation de la colonie de macrophage de 20 ng/mL (M-CSF) pendant 3 jours à 37 oC, 5 % CO2.
REMARQUE: La chambre haute contient 1 ml de milieu de culture tandis que la chambre inférieure est remplie de 1,5 ml. Le support doit être ajouté à chaque chambre.
2. Coculture de cellules tumorales avec macrophages
- Avant l'utilisation, la culture a disponible commercialement des cellules de tumeur dans leur milieu respectif suivant des méthodes de culture de tissu ATCC-recommandées.
- Laver les cellules tumorales adhérentes une fois avec du phosphate tamponné saline (PBS), ajouter 0,05% trypsine et acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA), et incuber à 37 oC jusqu'à ce que les cellules se détachent. Resuspendre les cellules dans FBS contenant milieu, quantifier le nombre total de cellules à l'aide d'un hémocytomètre ou compteur cellulaire, puis centrifugeuse pendant 5 min à 220 x g à granulés.
- Pendant la centrifugation, aspirez le milieu des chambres supérieures et inférieures des plaques de support perméables à membrane contenant des macrophages et remplacez-les par un milieu frais.
- Pour les chambres inférieures où les cellules tumorales seront plaquées, remplissez avec 1 ml de milieu au lieu de 1,5 ml pour permettre un volume suffisant pour l'ajout cellulaire.
- Aspirer le milieu des cellules tumorales granulées et des cellules de resuspend dans DMEM/F12 avec 10% FBS, 1x pénicilline/streptomycine, et 20 ng/mL M-CSF à une concentration de 3 x 105 cellules/mL.
- Ajouter 0,5 ml de 3 x 10 cellules/mL cellules tumorales à la chambre inférieure des puits désirés (Figure 1B).
REMARQUE : Les cellules peuvent être traitées immédiatement.
3. Traitement des cellules co-cultivées
- Pour induire l'expression des gènes pro-inflammatoires macrophages, traitez les macrophages individuellement ou co-cultivés en ajoutant 100 ng/mL IFNet et 50 ng/mL LPS.
- Variez la durée des temps de traitement en culture au besoin. L'activation de macrophage se produit dans un délai de 2 h et une certaine suppression tumeur-négociée se produit par 8 h. Co-culture pour 24 h donne la suppression tumeur-dérivée robuste et cohérente.
REMARQUE : Alternativement, les macrophages peuvent être induits pour adopter un phénotype curatif pro-blessure par l'addition des facteurs tels que l'interleukin-10 (IL10), et l'effet du ligand tumeur-secret évalué.
- Variez la durée des temps de traitement en culture au besoin. L'activation de macrophage se produit dans un délai de 2 h et une certaine suppression tumeur-négociée se produit par 8 h. Co-culture pour 24 h donne la suppression tumeur-dérivée robuste et cohérente.
- En tant que contrôle négatif, les macrophages de culture individuellement et laisser non traités. Comme un contrôle positif, traiter les macrophages cultivés individuellement avec 100 ng/mL IFN et 50 ng/mL LPS.
4. Analyse en aval des cellules co-cultivées
- Après le temps d'incubation souhaité s'est écoulé, isolez le lysate cellulaire ou le milieu de culture conditionné comme désiré, selon les besoins d'essai.
- Pour isoler le lysate cellulaire pour l'analyse quantitative de la réaction en chaîne de polymérase (qPCR), aspirer le support des deux chambres du puits et laver une fois avec 2 ml de PBS. Appliquer le tampon de lyse d'ARN à la chambre supérieure contenant les macrophages. Gratter doucement la membrane pour libérer le lysate de la cellule, et le transférer dans un tube de collecte pour un traitement ultérieur selon le protocole du fabricant du kit d'isolement de l'ARN.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pour déterminer l'effet des ligands tumeur-sécrétés sur la polarisation de macrophage, la procédure décrite a été employée. Les macrophages péritonéaux cultivés en l'absence de cellules tumorales ont été utilisés comme témoins négatifs (non traités à l'extrême gauche) et positifs (IFNet et LPS stimulés àpartir de la gauche) (Figure 2A). Alternativement, les macrophages péritonéaux ont été co-cultivés avec les cellules de tumeur de mélanome b16F10 (ATCC) (figure 1A). Immédiatement après le placage, les cellules ont été traitées avec IFN et LPS ou laissées non traitées. Après 24 h de culture, des macrophages ont été moissonnés, l'ARN a préparé, et qRT-PCR exécuté pour mesurer l'expression des gènes pro-inflammatoires. En utilisant le système de co-culture décrit ici, nous montrons que les macrophages péritonés co-cultivés en présence de cellules tumorales B16F10, mais sans stimulation s'activant (LPS - IFNMD), n'ont pas augmenté l'expression des gènes pro-inflammatoires associés(figure 2A, B16F10 membrane/non traitée). Ceci implique que les ligands tumeur-sécrétés sont 1) ne sont pas suffisants par eux-mêmes pour induire l'expression pro-inflammatoire de gène ou 2) s'il y a activation immunisée par des sécrétions de tumeur, les ligands de paracrine sont suffisants pour le supprimer aux niveaux naïfs. Cette méthode de co-culture illustre que lorsque les macrophages polarisés par IFN et LPS sont cultivés en présence de cellules tumorales, la suppression de l'expression génique associée à l'inflammation a été réduite de 60 %(Figure 2A, B16F10 Membrane/IFNMDLPS). Un niveau comparable de suppression pro-inflammatoire de gène de macrophage a été observé quand la ligne de cellules de macrophage murine J774 a été substituée aux macrophages péritonéaux (figure 2B).
Nos travaux précédents ont identifié Pros1 comme facteur tumeur-sécrété qui peut inhiber l'activation de macrophage16. En utilisant le modèle de co-culture de soutien de membrane perméable en collaboration avec ELISA, nous avons asmélis la concentration de Pros1 dans le milieu conditionné après 24 h. Nous avons observé que dans le milieu conditionné des cellules de mélanome B16F10 traitées par IFN et LPS, Pros1 a été exprimée à 475 ng/mL et 120 ng/mL(figure 3). Les macrophages péritonéaux traités dans les mêmes conditions exprimés Pros1 à 61 ng/mL 5 ng/mL (Figure 3). Fait intéressant, lorsqu'ils étaient co-cultivés, les Pros1 de l'IFNmD et du LPS bien traités étaient de 86 ng/mL et 15 ng/mL. Ceci suggère que 1) macrophages consomment des Pros1 tumeur-sécrétés ou 2) la quantité de Pros1 sécrétée par des cellules de B16F10 est sensiblement diminuée quand en présence des macrophages. Les résultats de la figure 2 et de la figure 3 mettent en évidence des changements profonds de l'activation du macrophage et de la signalisation paracrine lorsque les macrophages sont co-cultivés avec des cellules tumorales.
Figure 1. Schématique pour la co-culture perméable de soutien de membrane des cellules de tumeur avec des macrophages. Des contrôles de traitement positifs et négatifs peuvent être appliqués aux puits de macrophage cultivés individuellement (A). Pour déterminer les effets des signaux tumeur-sécrétés sur l'activation de macrophage, les macrophages sont cultivés dans la chambre supérieure des plaques perméables de co-culture de soutien de membrane et des cellules de tumeur cultivées dans la chambre inférieure (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Les signaux paracrines de tumeur suppriment la polarisation pro-inflammatoire de macrophage. L'expression macrophage des gènes inflammation-associés a été astorquée par qRT-PCR dans les macrophages non traités ou IFN et LPS stimulés en présence ou en absence de cellules tumorales. L'expression des gènes pro-inflammatoires a été diminuée dans les macrophages péritonéaux (A) ou la lignée de cellules de macrophage de J774 (B) une fois cultivés en présence des cellules de tumeur séparées par un support perméable de membrane de sorte que l'effet ait été transmis par un ligand soluble paracrine. p 'lt; 0.05 par rapport aux non traités, 'p 'lt; 0.05 par rapport à IFN et LPS stimulé. Les données sont moyennes et SEM; p valeurs calculées par le test t de l'étudiant à deux queues. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. La coculture des cellules tumorales et des macrophages entraîne des changements dans la quantité de ligands paracrines sécrétés par tumorales trouvés dans le milieu conditionné. ELISA a été employé pour déterminer la concentration de Pros1 dans la tumeur seule, le macrophage seul, ou le milieu conditionné co-cultivé après 24 h. Co-culture conduit à une diminution de la quantité de Pros1 par rapport aux contrôles de cellules de tumeur seulement. p 'lt; 0.05 par rapport à non traité. p valeurs calculées par le test t de l'étudiant à deux queues. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'analyse de co-culture présentée ici est une modification des essais précédemment établis qui permet l'étude des facteurs tumoraux-sécrétés sur l'activation de cellules immunitaires. Tandis que le contact de cellule-cellule est connu pour induire des changements dans l'activité immunisée, la capacité des ligands tumeur-sécrétés pour moduler l'activation immunisée est moins bien comprise. Nous décrivons une méthode qui, contrairement à la co-culture directe, peut être employée pour interroger comment les facteurs sécrétés tumeur-dérivés influencent l'activation immunisée de cellules sans la nature confondante de la signalisation contact-négociée. Compte tenu de l'importance clinique potentielle des ligands sécrétés par tumeur dans l'immunosuppression, cette méthode offre un outil facile à utiliser pour étudier ces mécanismes d'une manière qui n'est pas abordée par la co-culture directe.
Essentiellement, la méthode de co-culture décrite ici implique la culture des macrophages (cellules primaires : résident, marrow-dérivé, ou une lignée de cellules de macrophage) avec des cellules de tumeur (ligne cellulaire ou cellules primaires) sans contact physique. Il est essentiel que les macrophages soient cultivés sur un insert de membrane en polyester de taille pore de 0,4 m pour permettre la perméabilité libre des ligands sécrétés par tumeur tout en empêchant la migration possible des cellules macrophages à travers le filtre. Il est également important d'ajouter la quantité décrite de milieu de culture aux chambres supérieures et inférieures pour assurer une couverture cellulaire appropriée. La conception expérimentale, comme l'inclusion d'un type de cellule qui ne contrôle que les contrôles, est un autre facteur clé lors de la planification d'expériences de co-culture. Plusieurs autres facteurs, décrits plus en détail plus tard, peuvent également avoir des effets sur les résultats de l'analyse et il est important de garder chacun à l'esprit lors de la conception de l'étude.
Deux modifications utiles au protocole décrit à considérer sont la durée de la co-culture ou le rapport relatif des cellules de tumeur aux macrophages. Dans la méthode décrite, les macrophages et les cellules tumorales sont plaqués à des concentrations à peu près égales. Un point important à considérer est la proportion relative des macrophages aux cellules tumorales qui se produit naturellement dans le microenvironnement de tumeur. Pour mieux imiter le microenvironnement de tumeur, la proportion relative des macrophages pourrait être changée pour refléter ce qui se trouve dans la tumeur in vivo, bien que le travail préliminaire puisse être nécessaire pour établir le rapport correct.
Un autre point critique, et la limitation possible du système, est que les traitements appliqués pour stimuler un type de cellule dans l'analyse peuvent avoir des effets inattendus ou involontaires sur l'autre type de cellule. Comme décrit ici, l'ajout de LPS et IFN est destiné à stimuler l'expression des gènes pro-inflammatoires dans les macrophages. Cependant, dans Ubil et autres nous avons montré que IFN induit également l'expression et la sécrétion des Pros1 immunosuppresseurs16,et d'autres ont montré les effets du LPS sur des cellules de tumeur18. Il est donc essentiel d'inclure les contrôles appropriés pour surveiller les effets potentiels hors cible ou involontaires sur l'autre type de cellule afin de vérifier les résultats expérimentaux. Une méthode par laquelle cela peut être réalisé est en traitant les types de cellules individuelles avec les agents d'intérêt et les effets de surveillance en utilisant des tests de biologie moléculaire standard.
Lors de la conception d'expériences perméables de soutien de membrane, il est également important d'examiner les gradients de diffusion possibles des ligands sécrétés. Le taux relatif de sécrétion de ligand, la durée de la co-culture et si la plaque de culture est maintenue dans une position stationnaire peuvent tous avoir des effets sur les résultats. En outre, il est possible pour certains ligands sécrétés d'adhérer à la surface des plaques de culture.
Tandis que les résultats représentatifs montrés sont caractéristiques de ce système, le degré de suppression pro-inflammatoire de gène observé en co-cculturant d'autres lignes de tumeur peut varier considérablement. Dans Ubil et autres, nous montrons que quelques lignes humaines de tumeur peuvent presque complètement supprimer l'expression pro-inflammatoire de gène d'une ligne humaine de cellules de macrophage16. Inversement, d'autres types de cellules tumorales ou lignées cellulaires peuvent varier considérablement dans leurs capacités immunosuppressives. La cause de ces écarts n'est pas claire, mais il s'agit d'un domaine d'étude plus approfondi.
La co-culture perméable de soutien de membrane est une méthodologie robuste qui peut être facilement modifiée pour adresser une série de questions et peut être adaptée à une gamme de readouts moléculaires de biologie comprenant qRT-PCR, tache occidentale, et ELISA. Le système peut être utilisé pour interroger les fonctions génétiques individuelles, telles que les ligands ou les récepteurs, lorsque des altérations génétiques comme celles de souris supprimées par des gènes ou de modifications CRISPR sont apportées aux macrophages ou aux cellules tumorales. Le système est également favorable à l'étude des activateurs pharmacologiques ou des inhibiteurs et de leurs effets sur la signalisation paracrine. En outre, bien que non discuté ici, le système peut être utilisé pour étudier les effets de l'activation immunitaire sur l'expression du gène des cellules tumorales.
Cette méthode a été employée avec succès dans la découverte et la caractérisation d'une fonction nouvelle pour un ligand immunosuppresseur et tumeur-sécrété. Cet outil robuste peut être utilisé pour interroger le sous-ensemble beaucoup plus large des interactions tumorales/immunes sans contact dans l'espoir de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Eric Ubil a été financé, en partie, par l'American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Les travaux ont été appuyés par une subvention des NIH (R01-CA205398) et un prix de la Fondation de recherche sur le cancer du sein (BCRF-18-041) à HSE.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B16-F10 | ATCC | ATCC CRL-6475 | |
| cDNA synthesis kit | Promega | A3500 | |
| DMEM/F12 media | ThermoFisher Scientific- Gibco | 11320033 | |
| Fetal Bovine Serum | Millipore | TMS-013-B | |
| J774A.1 | ATCC | ATCC TIB-67 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 | Sigma-Aldrich | L5293-2ML | |
| Murine M-CSF | Prospec | CYT-439 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific- Gibco | 15140122 | |
| Pros1 ELISA | MyBioSource | MBS2886720 | |
| RAW264.7 | ATCC | ATCC TIB-71 | |
| Recombinant Mouse IFNγ | BioLegend | 575302 | |
| Sensimix SYBR Low-ROX kit | Bioline | QT625-05 | |
| Transwell permeable supports | Fisher Scientific | 07-200-170 | |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific- Gibco | 25200056 |
References
- Freeman, G. J., et al. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. Journal of Experimental Medicine. 192 (7), 1027-1034 (2000).
- Agata, Y., et al. Expression of the PD-1 antigen on the surface of stimulated mouse T and B lymphocytes. International Immunology. 8 (5), 765-772 (1996).
- Dong, H., et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature Medicine. 8 (8), 793-800 (2002).
- Sznol, M., Chen, L. Antagonist antibodies to PD-1 and B7-H1 (PD-L1) in the treatment of advanced human cancer--response. Clinical Cancer Research. 19 (19), 5542 (2013).
- Kortylewski, M., et al. Regulation of the IL-23 and IL-12 balance by Stat3 signaling in the tumor microenvironment. Cancer Cell. 15 (2), 114-123 (2009).
- Halak, B. K., Maguire, H. C., Lattime, E. C. Tumor-induced interleukin-10 inhibits type 1 immune responses directed at a tumor antigen as well as a non-tumor antigen present at the tumor site. Cancer Research. 59 (4), 911-917 (1999).
- Wang, T., et al. Regulation of the innate and adaptive immune responses by Stat-3 signaling in tumor cells. Nature Medicine. 10 (1), 48-54 (2004).
- Mazzoni, A., et al. Myeloid suppressor lines inhibit T cell responses by an NO-dependent mechanism. The Journal of Immunology. 168 (2), 689-695 (2002).
- Zea, A. H., et al. Arginase-producing myeloid suppressor cells in renal cell carcinoma patients: a mechanism of tumor evasion. Cancer Research. 65 (8), 3044-3048 (2005).
- Steele, R. J., Eremin, O., Brown, M., Hawkins, R. A. A high macrophage content in human breast cancer is not associated with favourable prognostic factors. British Journal of Surgery. 71 (6), 456-458 (1984).
- Evans, R. Regulation of T- and B lymphocyte responses to mitogens by tumor-associated macrophages: the dependency on the stage of tumor growth. Journal of Leukocyte Biology. 35 (6), 549-559 (1984).
- Noy, R., Pollard, J. W. Tumor-associated macrophages: from mechanisms to therapy. Immunity. 41 (1), 49-61 (2014).
- Pollard, J. W. Tumour-educated macrophages promote tumour progression and metastasis. Nature Reviews Cancer. 4 (1), 71-78 (2004).
- Renaud, J., Martinoli, M. G. Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact. Journal of Visualized Experiments. (113), e54356 (2016).
- Dasari, S., Pandhiri, T., Haley, J., Lenz, D., Mitra, A. K. A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells. Journal of Visualized Experiments. (138), e58144 (2018).
- Ubil, E., et al. Tumor-secreted Pros1 inhibits macrophage M1 polarization to reduce antitumor immune response. Journal of Clinical Investigation. 128 (6), 2356-2369 (2018).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
- Zaks-Zilberman, M., Zaks, T. Z., Vogel, S. N. Induction of proinflammatory and chemokine genes by lipopolysaccharide and paclitaxel (Taxol) in murine and human breast cancer cell lines. Cytokine. 15 (3), 156-165 (2001).
