Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

एंडोक्राइन बाधित यौगिकों के एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का परीक्षण करने के लिए टीजी (Vtg1:mcherry) ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग करना

Published: August 8, 2020 doi: 10.3791/60462
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Aquaculture, Institute of Aquaculture and Environmental Safety, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences, Szent István University, 2Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham

Summary

यहां मौजूद एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का पता लगाने के लिए जेब्राफिश भ्रूण टीजी (vtg1: mCherry) के उपयोग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है। प्रोटोकॉल मछली के प्रचार और भ्रूण के उपचार को शामिल किया गया है, और पता लगाने, प्रलेखन पर जोर देती है, और अंतःस्रावी बाधित यौगिकों (EDC) द्वारा प्रेरित फ्लोरोसेंट संकेतों के मूल्यांकन ।

Abstract

पर्यावरण में कई एंडोक्राइन बाधित यौगिक (ईडीसी), विशेष रूप से एस्ट्रोजेनिक पदार्थ हैं। इन पदार्थों का पता लगाना उनकी रासायनिक विविधता के कारण मुश्किल है; इसलिए, तेजी से अधिक प्रभाव का पता लगाने के तरीकों का उपयोग किया जाता है, जैसे एस्ट्रोजेनिक प्रभाव-संवेदनशील बायोमॉनिटर/बायोइंडिकेटर जीव। इन बायोमॉनिटरिंग जीवों में कई फिश मॉडल शामिल हैं। इस प्रोटोकॉल में एक बायोमॉनिटरिंग जीव के रूप में जेब्राफिश टीजी (vtg1: mCherry) ट्रांसजेनिक लाइन के उपयोग को शामिल किया गया है, जिसमें मछली के प्रचार और भ्रूण के उपचार शामिल हैं, जिसमें ईडीसी द्वारा प्रेरित फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने, प्रलेखन और मूल्यांकन पर जोर दिया गया है। काम का लक्ष्य एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का पता लगाने के लिए टीजी (वीटीजी1: एमचेरी) ट्रांसजेनिक लाइन भ्रूण के उपयोग का प्रदर्शन है। यह काम दो एस्ट्रोजेनिक पदार्थों, α-और α-zearalenol का परीक्षण करके एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का पता लगाने के लिए ट्रांसजेनिक जेब्राफिश भ्रूण टीजी (vtg1: mCherry) के उपयोग को दस्तावेज करता है। वर्णित प्रोटोकॉल केवल परख डिजाइन करने का आधार है; परीक्षण विधि परीक्षण अंत बिंदुओं और नमूनों के अनुसार भिन्न हो सकती है। इसके अलावा, इसे अन्य परख विधियों के साथ जोड़ा जा सकता है, जिससे ट्रांसजेनिक लाइन के भविष्य के उपयोग को सुविधाजनक बनाया जा सकता है।

Introduction

एंडोक्राइन बाधित यौगिकों (ईडीसी) की एक महत्वपूर्ण संख्या है जो हमारे पर्यावरण में सबसे खतरनाक पदार्थों में से हैं। ये मुख्य रूप से एस्ट्रोजेनिक यौगिक हैं जो प्राकृतिक संसाधनों से पानी को दूषित करते हैं। समूह से संबंधित पदार्थों की रासायनिक विविधता उनकी उपस्थिति के लिए परीक्षण को मुश्किल बनाती है, क्योंकि उनका पता लगाने के लिए विभिन्न विश्लेषणात्मक तरीकों की आवश्यकता होती है। उनकी रासायनिक संरचना के आधार पर यह निर्धारित करना बहुत मुश्किल है कि क्या कोई पदार्थ वास्तव में एस्ट्रोजन के रूप में कार्य करने में सक्षम है। इसके अलावा, ये पदार्थ पर्यावरण में शुद्ध रूप में कभी भी मौजूद नहीं होते हैं, इसलिए इनके प्रभाव अन्य यौगिकों से प्रभावित हो सकते हैं, बहुत1। इस समस्या का समाधान प्रभाव-पता लगाने के तरीकों से किया जा सकता है, जैसे कि एस्ट्रोनॉमी प्रभाव दिखाने वाले बायोमॉनिटर/बायोइंडिकेटर जीवों का उपयोग2,,3,,4,,5।

हाल ही में एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का पता लगाने के लिए विभिन्न प्रकार के सेल लाइन6 और यीस्ट बेस्ड टेस्ट सिस्टम2,,3 विकसित किए गए हैं। हालांकि, ये आम तौर पर केवल एस्ट्रोजन रिसेप्टर2,3के लिए पदार्थ के बाध्यकारी का पता लगाने में सक्षम हैं । इसके अलावा, वे जीव में जटिल शारीरिक प्रक्रियाओं को मॉडल करने में असमर्थ हैं, या जीवन चरणों के हार्मोन-संवेदनशील चरणों का पता लगाने में असमर्थ हैं; इस प्रकार, वे अक्सर झूठे परिणाम देते हैं।

यह ज्ञात है कि कुछ जीन जीवित जीवों में एस्ट्रोजन के प्रति संवेदनशीलता से प्रतिक्रिया करते हैं7. आणविक जीव विज्ञान विधियों द्वारा जीन उत्पादों का पता लगाना प्रोटीन या एमआरएनए स्तर8,,9पर भी संभव है, लेकिन आमतौर पर पशु बलि शामिल है। पशु संरक्षण कानून सख्त हो गए हैं, और वैकल्पिक परीक्षण प्रणालियों की मांग बढ़ रही है जो प्रयोगों में उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या और पीड़ा को कम करती है या किसी अन्य मॉडल प्रणाली10के साथ पशु मॉडल के प्रतिस्थापन को कम करती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन की खोज और बायोमार्कर लाइनों के निर्माण के साथ, ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकियां एक अच्छा विकल्प प्रदान करती हैं11। इन रेखाओं के साथ, एक एस्ट्रोजन के प्रति संवेदनशील जीन की सक्रियता का परीक्षण वीवो में किया जा सकता है।

कशेरुकी के बीच, पर्यावरण जोखिम आकलन में मछली की क्षमता बकाया है । वे स्तनधारी मॉडलों पर कई फायदे प्रदान करते हैं: जलीय जीव होने के नाते, वे अपने पूरे शरीर के माध्यम से प्रदूषकों को अवशोषित करने में सक्षम होते हैं, बड़ी संख्या में संतान पैदा करते हैं, और उनकी कुछ प्रजातियों को कम पीढ़ी के समय की विशेषता होती है। उनकी अंतःस्रावी प्रणाली और शारीरिक प्रक्रियाएं अन्य कशेरुकी और यहां तक कि स्तनधारियों के साथ भी बहुत समानताएं दिखाती हैं, जिनमें मनुष्य12शामिल हैं।

मछली में एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का पता लगाने के लिए कई जीन भी जाने जाते हैं। सबसे महत्वपूर्ण एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स अरोमाटेस-बी, कोरियोजेनिन-एच, और विटेलेजेनिन (वीटीजी)7,,13हैं। हाल ही में प्रयोगशाला में इस्तेमाल होने वाले मछली के मॉडलों से कई एस्ट्रोजन उत्पादक बायोसेंसर लाइनें भी बनाई गई हैं, जैसे,जेब्राफिश(दानियो रेरियो)4, 5,,,14, 15,,516,,17से ।17 बायोसेंसर लाइनें बनाने में जेब्राफिश का मुख्य लाभ भ्रूण और लार्वा का पारदर्शी शरीर है, क्योंकि फ्लोरोसेंट रिपोर्टर सिग्नल को जानवर10का त्याग किए बिना वीवो में आसानी से अध्ययन किया जा सकता है। पशु संरक्षण के अलावा, यह भी एक मूल्यवान विशेषता है क्योंकि यह उपचार18के विभिन्न समयों पर एक ही व्यक्ति की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

इन प्रयोगों में एक विटेलेजेनिन रिपोर्टर ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइन15का उपयोग किया जाता है । टीजी (वीटीजी1:एमएचरी) के विकास के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्रांसजीन निर्माण में एक लंबा (3.4 केबीपी) प्राकृतिक विटेलोजेनिन-1 प्रमोटर है। एस्ट्रोजन रिसेप्टर (ईआर) लिगांड द्वारा सक्रिय एक एन्हांसर प्रोटीन है जो स्टेरॉयड/न्यूक्लियर रिसेप्टर सुपरफैमिली का प्रतिनिधि है । ईआर विशिष्ट डीएनए दृश्यों को बांधता है जिसे एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया तत्व (ईआरई) कहा जाता है, जिसमें उच्च आत्मीयता होती है और एस्ट्रोडिओल और अन्य एस्ट्रोजेनिक पदार्थों के जवाब में जीन अभिव्यक्ति को स्थानांतरित करता है, इसलिए प्रमोटर में अधिक ईई एक मजबूत प्रतिक्रिया19का कारण बनता है। टीजी (vtg1:mCherry) ट्रांसजीन निर्माण के प्रमोटर क्षेत्र में 17 ERE साइटें हैं और उन्हें देशी वीटीजी जीन15की अभिव्यक्ति की नकल करने की उम्मीद है। यौन परिपक्व महिलाओं में फ्लोरोसेंट संकेत की निरंतर अभिव्यक्ति है। हालांकि, पुरुषों और भ्रूण में जिगर में अभिव्यक्ति केवल एस्ट्रोजेनिक पदार्थों(चित्रा 1)के साथ उपचार पर दिखाई देती है।

Figure 1
चित्रा 1: vtg1 के जिगर में लाल फ्लोरोसेंट संकेत: mCherry ट्रांसजेनिक वयस्क ज़ेब्राफिश और 5 डीपीएफ भ्रूण, 17-ß-estradiol (E2) प्रेरण के बाद । महिला में और पुरुष में E2 के साथ इलाज (25 μg/L जोखिम समय: 48hrs) जिगर की मजबूत फ्लोरेसेंस भी वर्णक त्वचा के माध्यम से दिखाई देता है । अनुपचारित पुरुष(ए)में कोई फ्लोरोसेंट सिग्नल दिखाई नहीं देता है। E2 प्रेरण के बाद (50 μg/L जोखिम समय: 0-120 hpf), 5 डीपीएफ भ्रूण के जिगर में एक लाल फ्लोरोसेंट संकेत भी देखा जा सकता है, जो नियंत्रण भ्रूण(बी)में दिखाई नहीं देता है । जबकि फ्लोरोसेंट सिग्नल वयस्क महिलाओं में लगातार मौजूद है, मुख्य रूप से पुरुषों और लाइन के भ्रूण एस्ट्रोजेनिक प्रभाव का पता लगाने के लिए उपयुक्त हैं। (BF: उज्ज्वल क्षेत्र, mCherry: लाल फ्लोरोसेंट फिल्टर व्यू, एकल सादे छवियां, स्केल बार ए: 5 मिमी, स्केल बार बी: 250 माइक्रोन) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अंतर्जात विटेलोजिन के समान, रीचेरी रिपोर्टर केवल जिगर में व्यक्त किया जाता है। क्योंकि विटेलोजिन केवल एस्ट्रोजन की उपस्थिति में उत्पादित होता है, इसलिए नियंत्रणों में कोई फ्लोरोसेंट संकेत नहीं होता है। क्योंकि अभिव्यक्ति केवल जिगर में है, परिणामों का मूल्यांकन बहुत आसान है15।

इस लाइन के भ्रूणों की संवेदनशीलता और उपयोगिता की जांच विभिन्न एस्ट्रोजेनिक यौगिक मिश्रणों और पर्यावरणीय नमूनों15,,20पर भी की गई है और ज्यादातर मामलों में खुराक-प्रतिक्रिया संबंधों को प्रलेखित किया गया था(चित्रा 2)। हालांकि, अत्यधिक विषाक्त के मामले में, मुख्य रूप से हेपेटोटॉक्सिक, पदार्थ (उदाहरण के लिए, ज़ेरालेनोन), केवल एक बहुत कमजोर फ्लोरोसेंट संकेत इलाज भ्रूण के जिगर में दिखाई दे सकता है और अधिकतम तीव्रता फ्लोरोसेंट सिग्नल का कारण एक बहुत छोटी एकाग्रता सीमा के भीतर पहुंचा जा सकता है, जिससे खुराक-प्रभाव संबंधों को स्थापित करना मुश्किल हो जाता है20।

Figure 2
चित्रा 2: 5 डीपीएफ vtg1:mCherry लार्वा में 17-α-ethynilestradiol (EE2) के संपर्क में जिगर (बी) की खुराक-प्रतिक्रिया आरेख (ए) और फ्लोरोसेंट छवियां (mCherry) । परिणाम संकेत शक्ति और प्रभावित क्षेत्र के आकार (± SEM, n = 60) से उत्पन्न एकीकृत घनत्व के रूप में व्यक्त किए जाते हैं। 100% मनाया अधिकतम करने के लिए संदर्भित करता है। फ्लोरोसेंट सिग्नल तीव्रता एकाग्रता के साथ धीरे-धीरे बढ़ गई। स्केल बार = 250 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पर्यावरण में कई एस्ट्रोजेनिक पदार्थ मौजूद हैं, जैसे 17-1-एस्ट्रेडिओल (पर्यावरण एकाग्रता: 0.1-5.1 एनजी/एल)21,17-α-α-ethynylestradiol (पर्यावरण एकाग्रता: 0.16-0.2 μg /L)22,zearalenone (पर्यावरण एकाग्रता: 0.095-0.22 μg/L)23,बिस्फेनोल-ए (पर्यावरण एकाग्रता: 0.45-17.2 मिलीग्राम/एल)24। रीचेरी ट्रांसजेनिक भ्रूण की मदद से शुद्ध सक्रिय रूप में इन पदार्थों का परीक्षण करते समय, फ्लोरोसेंट साइन डिटेक्शन के लिए सबसे कम मनाया गया प्रभाव सांद्रता (एलईसी) 17-ß-estradiol के लिए 100 एनजी/एल थे, 1 एनजी/एल के लिए 17-α-ethynilestradiol, १०० एनजी/Zearalenone के लिए एल, और बिस्फेनोल के लिए 1 मिलीग्राम/एल-ए (96-120 hpf उपचार), जो बहुत करीब है या पदार्थों की पर्यावरणीय सांद्रता की सीमा के भीतर15। टीजी (vtg1:mCherry) ट्रांसजेनिक लाइन सीधे जोखिम के बाद अपशिष्ट जल के नमूनों में एस्ट्रोजेनिकता का पता लगाने में मदद कर सकती है। लाइन आमतौर पर इस्तेमाल खमीर एस्ट्रोजन परीक्षण, बायोलुमिनिसेंट खमीर एस्ट्रोजन (BLYES) परख15के रूप में के रूप में संवेदनशील है । इस लाइन की मदद से, जेरालेनोन-प्रेरित विषाक्तता के खिलाफ बीटा-साइक्लोडेक्स्ट्रिन के सुरक्षात्मक प्रभावों की पुष्टि रासायनिक मिश्रण20का उपयोग करके की गई है।

हाल ही में एक रिपोर्ट में, ट्रांसजेनिक लाइन के वीवो उपयोग में दो एस्ट्रोजेनिक ज़ेरालेनोन (ZEA) मेटाबोलाइट्स, α-और α-ZOL (α-ZOL और α-ZOL)25की मदद से प्रदर्शन किया गया था । प्रोटोकॉल बेसलाइन टीजी (vtg1:mCherry) भ्रूण पर कई यौगिकों या पर्यावरण के नमूनों के एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

पशु प्रोटोकॉल हंगरी पशु कल्याण कानून के तहत मंजूरी दे दी थी और सभी अध्ययनों से पहले इलाज व्यक्तियों मुफ्त खिला चरण तक पहुंच गया होता पूरा कर लिया गया ।

1. भ्रूण फसल और उपचार

  1. 25.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस, पीएच = 7 ± 0.2, 525 ± 50 μS/m के बीच चालकता, ऑक्सीजन स्तर 80% संतृप्ति, और 14 घंटे प्रकाश और 10 घंटे अंधेरे चक्र पर टीजी (vtg1:mCherry) ज़ेब्राफ़िश बनाए रखें।
  2. संभोग टैंक को सिस्टम के पानी से भरें और अंडे की कटाई से पहले दोपहर को संभोग के लिए मछली स्थापित करें।
  3. नर और मादा मछली को टैंक में रखें और उन्हें डिवाइडर की मदद से अलग करें।
  4. अगली सुबह लाइट स्विच आते ही टंकियों से डिवाइडर हटा दें। हर 15-20 मिनट में अंडे के लिए संभोग टैंक की जांच करें।
  5. चाय छलनी या घनी बुना हुआ ठीक जाल का उपयोग करके सभी भ्रूणों को काटें और उन्हें ई 3 बफर (5 एमएम सोडियम क्लोराइड, 0.17 एमएम पोटेशियम क्लोराइड, 0.33 mM कैल्शियम क्लोराइड, 0.33 m m मैग्नीशियम सल्फेट) या स्पष्ट सिस्टम पानी के साथ एक बड़े पेट्री डिश में मिलाएं।
  6. भ्रूण को इनक्यूबेटर सेट में 25.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस तक रखें।
  7. 1-1.5 घंटे के बाद, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट के साथ अनिषेचित या अपर्याप्त रूप से विभाजित अंडे को हटाएं और त्यागें।
    नोट: अनिषेचित अंडे अपारदर्शी हैं; उर्वरित अंडे पारदर्शी होते हैं। विकास के बाद के चरण में उपचार शुरू करने के लिए, व्यक्तियों के सामान्य विकास पर ध्यान दें।
  8. चयनित भ्रूण को उपचार जहाजों में रखें (उदाहरण के लिए, पेट्री व्यंजन या ऊतक संस्कृति प्लेटों में) जिन्हें पहले से ही लेबल किया गया है और परीक्षण पदार्थ की विभिन्न सांद्रता से भरा गया है।
  9. प्रयोग के अंत तक 25.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण को इनक्यूबेट करें।
    नोट: भ्रूण विभिन्न एस्ट्रोजेनिक यौगिकों के लिए महत्वपूर्ण व्यक्तिगत संवेदनशीलता के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं, तो यह प्रयोग ठीक से मूल्यांकन करने के लिए कम से कम तीन दोहराने उपचार में कम से कम 15 भ्रूण का उपयोग करने की सिफारिश की है। कंटेनर का चयन करते समय, ध्यान रखें कि भ्रूण के विकास के लिए कम से कम 200 माइक्रोन पानी की आवश्यकता होती है26। इस प्रयोग में भ्रूण 25.5 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर 120 एचपीएफ तक इनक्यूबेटेड थे।
  10. यदि उपचार एकाग्रता बनाए रखने के लिए नेक्सेसरी है तो परीक्षण समाधान को ताज़ा करें। भ्रूण को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए परीक्षण समाधान बदलते समय सावधानी बरतें।
    नोट: प्रयोग के दौरान मृत्यु दर या सुबलील लक्षणों की जांच करना भी संभव है। उपयोग की जाने वाली सांद्रता विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए यथासंभव स्थिर रहनी चाहिए। यह परीक्षण समाधान ताज़ा करके आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। परीक्षण पदार्थ के आधार पर ताज़ा की आवृत्ति भिन्न हो सकती है। इसलिए, समाधान अपडेट की आवृत्ति निर्धारित करने के लिए विश्लेषणात्मक माप द्वारा परीक्षण पदार्थ की एकाग्रता की जांच करने की सलाह दी जाती है।

2. फोटोग्राफी के लिए लार्वा तैयारी

  1. एमएस-222 (ट्राइकेन-मीथेन-सल्फोनेट) के साथ 4% मिथाइलसेलुलोस पहले से तैयार करें।
    1. ऐसा करने के लिए, 0.168 मिलीग्राम/एमएल की अंतिम एकाग्रता में 4 मिलीग्राम/एमएल एमएस-222 से 100 एमएल डबल डिस्टिल्ड पानी जोड़ें, और समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस तक लाएं। इसके बाद इसमें 4 ग्राम मिथाइलसेलुलोस डालें। इसे एक चुंबकीय उभारने के साथ हिलाएं, फिर इसे रात भर 4 डिग्री सेल्सियस में छोड़ दें।
    2. अगले दिन, इसे फिर से हिलाएं और समाधान का उपयोग करने के लिए तैयार होना चाहिए। यदि मिथाइलसेलुलोस पूरी तरह से भंग नहीं होता है तो इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर वापस रखें और कुछ और घंटों तक प्रतीक्षा करें।
  2. 5 दिन पुराने लार्वा को एक पाश्चर पिपेट के साथ प्रति उपचार समूह 5 सेमी पेट्री डिश में रखें।
  3. एक प्लास्टिक पिपेट के साथ लार्वा से उपचार समाधान निकालें, फिर पेट्री डिश को 0.02% एमएस-222 एनेस्थेटिक समाधान के 2 एमएल के साथ भरें।
    नोट: संज्ञाहरण आमतौर पर एक मिनट से भी कम समय में प्रभावी है। लार्वा को छूने के जवाब में तैरने नहीं दिया जाता है। एमएस-222 का ओवरडोज लार्वा को मार सकता है।
  4. एमएस-222(चित्रा 3)के साथ 4% मिथाइलसेलुलोस के साथ विशेष रूप से डिजाइन किए गए 10 सेमी पेट्री डिश के प्रत्येक वर्ग को भरें।
    नोट: प्लास्टिक शीट (1 मिमी ऊंचाई, 5 मिमी चौड़ा) का उपयोग करके पेट्री डिश के तल पर दो 1.5 x 1.5 सेमी वर्ग क्षेत्रों को गोंद करें। बीस लार्वा एक वर्ग में एक दूसरे के बगल में रखा जा सकता है। विशेष रूप से डिजाइन किए गए पेट्री डिश के बजाय, भ्रूण की स्थिति को ठीक करने के लिए एक और कम किनारे वाले कंटेनर का उपयोग किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: फोटोग्राफी के लिए लार्वा तैयार करने के लिए 10 सेमी पेट्री डिश जिसमें चिपके 1.5 x 1.5 सेमी चौड़े, 1 मिमी मोटी प्लास्टिक शीट वर्ग हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

  1. एनेस्थेटाइज्ड लार्वा को दो वर्गों में से एक में थोड़ा पानी के साथ मिथाइलसेलुलोस में स्थानांतरित करें। पहले वर्ग से लार्वा को दूसरे वर्ग में स्थानांतरित करें।
    नोट: इस हस्तांतरण की मदद से, फोटोग्राफी के लिए उपयोग किए जाने वाले 4% मिथाइलसेलुलोस को पतला नहीं किया जाएगा और लार्वा इमेजिंग के दौरान नहीं घूमेगा।
  2. दूसरे वर्ग में, लार्वा को अपने बाईं ओर घुमाएं और उन्मुख करें और धीरे-धीरे उन्हें सेल्यूलोज के नीचे दबाएं जिसमें माइक्रोलोडर पिपेट टिप 2 सेमी तक कट जाता है।
    नोट: अन्य पिपेट युक्तियों का उपयोग न करें क्योंकि वे लार्वा को चोट पहुंचाते हैं।

3. माइक्रोस्कोपी

नोट: फोटोग्राफी जानवरों को नहीं मारता है । जानवरों को मिथाइलसेल्यूलोस से हटाकर और उन्हें ताजा प्रणाली के पानी या उपचार समाधान में रखकर जागृत किया जा सकता है, इसलिए उपचार के दौरान एक ही व्यक्ति की कई बार जांच की जा सकती है।

  1. व्यक्त रिपोर्टर के संकेत का मूल्यांकन करने के लिए, एक ही दृश्य और सेटिंग्स के साथ भ्रूण छवि ।
    नोट: इष्टतम भ्रूण स्थिति के लिए चरण 2.6 देखें। पांडुलिपि में तस्वीरें वर्णित शर्तों के तहत ली गई थीं । उज्ज्वल क्षेत्र: 60x आवर्धन, 6 एमएस प्रदर्शनी, आइरिस 100%, लाभ: 1.1, फ्लोरेसेंस फोटो: 60x आवर्धन, 300 एमएस प्रदर्शनी, आइरिस: 100%, लाभ:1, रीचेरी फिल्टर, फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत: पारा धातु हैलाइड बल्ब। माइक्रोस्कोप के लिए फ्लोरोसेंट स्टीरियोमाइक्रोस्कोप, डेडिकेटेड कैमरा और सॉफ्टवेयर लेने वाली फोटो का इस्तेमाल किया गया ।
  2. पेट्री डिश को माइक्रोस्कोप के स्टेज पर रखें।
  3. भ्रूण के जिगर पर ध्यान केंद्रित करें और संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक उज्ज्वल क्षेत्र छवि पर कब्जा करें।
  4. माइक्रोस्कोप को रीचेरी फिल्टर पर स्विच करें और संबंधित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट प्रकाश के तहत जिगर की फ्लोरोसेंट छवि लें।
    नोट: अंधेरे में सभी फ्लोरेसेंस चरणों का प्रदर्शन करें। उज्ज्वल क्षेत्र और फ्लोरोसेंट छवियों को कैप्चर करने के बीच आवर्धन, ध्यान या भ्रूण की स्थिति को न बदलें, क्योंकि यह छवियों के विश्लेषण में सहायता करेगा।
  5. प्रयोग में सभी भ्रूणों को चित्रित किए जाने तक चरण 3.3 और 3.4 दोहराएं।

4. एकीकृत घनत्व का निर्धारण

नोट: फ्लोरोसेंट सिग्नल स्ट्रेंथ की तुलना करने के लिए सबसे अच्छे संकेतकों में से एक एकीकृत घनत्व मूल्य (यानी, क्षेत्र का उत्पाद और मतलब ग्रे मूल्य) है। एकीकृत घनत्व निर्धारित करने के सबसे आसान तरीकों में से एक इमेजजे कार्यक्रम27का उपयोग करना है। कार्यक्रम इंटरनेट पर उपलब्ध है और कंप्यूटर पर स्थापित किया जा सकता है।

  1. इसके बाद ओपन इमेजजे फ्लोरोसेंट इमेज अपलोड करें, जिसे या तो खींचकर और छोड़कर इमेज को ड्रॉप करके या फाइल पर क्लिक करके विश्लेषण किया जा सके । खुला।
  2. इमेज पर क्लिक करें। रंग। आरजीबी कलर चार्ट के अनुसार फ्लोरोसेंट फिल्टर द्वारा बनाई गई छवि को विभाजित करने के लिए स्प्लिट चैनल।
  3. लाल चैनल छवि स्पेक्ट्रम के साथ काम करते हैं, अन्य चैनलों को बंद करें।
  4. छवि में इसी तरह के आकार के अण्डाकार क्षेत्र को नामित करें ताकि झूठे संकेत मूल्यांकन में हस्तक्षेप न करें। ओवल उपकरणों का उपयोग करना, जितना संभव हो उतना सटीक रूप से हाइलाइट किए गए यकृत क्षेत्र पर एक अंडा आकर्षित करें।
  5. यदि संकेत कमजोर है तो यकृत के स्थान का निर्धारण करने के लिए हल्के माइक्रोस्कोपी छवियों (यानी, फ्लोरोसेंट छवि की उज्ज्वल क्षेत्र जोड़ी) का उपयोग करें।
  6. विश्लेषण पर क्लिक करें । सिग्नल की ताकत और प्रभावित क्षेत्र के आकार को निर्धारित करने के लिए उपाय। एकीकृत घनत्व मूल्य स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर (चार्ट में IntDen कॉलम) द्वारा गणना की जाती है।
  7. उपचार समूह में सभी भ्रूणों की सभी फ्लोरोसेंट छवियों का विश्लेषण किए जाने तक चरण 4.1-4.6 दोहराकर विश्लेषण जारी रखें।
  8. डेटा को सहेजें और फिर एकीकृत घनत्व मूल्यों का विश्लेषण करें।
    नोट: विश्लेषण के दौरान छवियों में हमेशा एक ही क्षेत्र के आकार का चयन करें। विश्लेषण किए जाने वाले क्षेत्र का आकार आवर्धन, छवि संकल्प, शूटिंग के लिए अन्य सेटिंग्स आदि पर निर्भर करता है। विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत मैक्रो का उपयोग करके विश्लेषण को त्वरित या अधिक सटीक बनाया जा सकता है। उदाहरण के लिए, मैक्रो का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है कि चयनित क्षेत्र हमेशा जांचकी गई छवियों में समान है। मैक्रो बनाने के लिए विस्तृत विवरण जो विशेष फोटो सेटिंग्स के अनुसार सर्वश्रेष्ठ छवि विश्लेषण की अनुमति देते हैं, इमेजजे वेबसाइट पर पाए जाते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रयोग में, दो एस्ट्रोजेनिक पदार्थों के प्रभाव का परीक्षण पांच सांद्रता पर किया गया जो टीजी (vtg1:mCherry) जेब्राफिश भ्रूण पर 5 दिनों के लिए निषेचन से शुरू होता है । हमने जांच की कि क्या पदार्थों की वजह से एक्सपोजर समय के अंत तक मछली के जिगर में फ्लोरोसेंट सिग्नल दिखाई दिए और क्या दोनों पदार्थों की एस्ट्रोजनिटी में अंतर थे । फ्लोरोसेंट छवियों और एकीकृत घनत्व मूल्यों के आधार पर परिणामों का मूल्यांकन किया गया। सामान्य तौर पर, दोनों पदार्थों ने उन परीक्षण सांद्रता पर एक्सपोजर समय के अंत तक ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित किया जिस पर व्यक्ति बच गए। अनुपचारित नियंत्रण मछली के मामलों में, कोई फ्लोरोसेंट संकेत दिखाई दे रहा था ।

α-ZOL के मामले में, उच्चतम परीक्षण एकाग्रता (8 माइक्रोन) में सभी व्यक्तियों की मृत्यु हो गई, इसलिए इस मामले में फ्लोरोसेंट सिग्नल की जांच नहीं की जा सकती थी। कम सांद्रता (0.5 माइक्रोन-4 माइक्रोन) पर, भ्रूण(चित्रा 4 ए)के जिगर में एक मजबूत फ्लोरोसेंट संकेत देखा गया था। फ्लोरेसेंस तीव्रता और फ्लोरोसेंट क्षेत्रों (पी एंड एलटी; 0.05) के आकार में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था। α-ZOL एकीकृत घनत्व मूल्यों(चित्रा 4C),से पता चलता है कि पदार्थ एक फ्लोरोसेंट संकेत की उपस्थिति प्रेरित किया । एकीकृत घनत्व मूल्यों और उपचार (पी एंड एलटी; 0.05) के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया। औसत एकीकृत घनत्व 31.26 ± 13.95 (0.5 माइक्रोन) और 34.25 ± 15.36 (4 माइक्रोन) के बीच भिन्न था।

ए-जेडओएल के साथ उपचार के दौरान कोई मृत्यु दर प्रलेखित नहीं की गई थी, और पदार्थ ने सभी उपचार सांद्रता पर ट्रांसजीन गतिविधि को प्रेरित किया था। फ्लोरोसेंट तीव्रता और फ्लोरोसेंट क्षेत्र का आकार बढ़ गया क्योंकि एकाग्रता बढ़ी, जैसा कि फ्लोरोसेंट छवियों(चित्रा 4B)में देखा गया है। α-और α-ZOL नेत्रहीन की फ्लोरोसेंट छवियों की तुलना करते हुए, दोनों सिग्नल की ताकत और फ्लोरोसेंट क्षेत्र का आकार दो पदार्थों की एक ही उपचार सांद्रता पर ए-जेडओएल के लिए कमजोर दिख रहा था। ज़ो-जेडओएल(चित्रा 4डी)के एकीकृत मूल्यों का अध्ययन करते हुए, औसत एकीकृत घनत्व मूल्य सबसे कम और उच्चतम उपचार सांद्रता के बीच लगभग दोगुना हो गया। हालांकि, जी-जेडओएल के मामले में व्यक्तिगत सांद्रता (पी एंड एलटी; 0.05) के एकीकृत घनत्व मूल्यों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। औसत एकीकृत घनत्व 15.86 ± 4.08 (0.5 माइक्रोन) और 21.73 ± 5.94 (8 माइक्रोन) के बीच भिन्न था।

Figure 4
चित्र 4: एकीकृत घनत्व मूल्यों की प्रस्तुति जिगर में फ्लोरोसेंट संकेतों की तीव्रता से प्राप्त और प्रभावित क्षेत्र के आकार से α-और 5 दिन पुराने टीजी (vtg1:mCherry) ट्रांसजेनिक ज़ेब्राफिश भ्रूण पर α-और α-zearalenol उपचार की वजह से । प्रयोग में, बायोमार्कर जेब्राफिश लाइन के एस्ट्रोजन-संवेदनशील भ्रूण (हर उपचार एकाग्रता में तीन प्रतिकृति में प्रति समूह 20 लार्वा) को 5 दिनों के लिए निषेचन से α-α-8 माइक्रोन की सांद्रता और α-ZOL के साथ इलाज किया गया था। α-ZOL(ए),और α-ZOL(बी)के लिए मछली यकृत की छवियों से स्पष्ट रूप से पता चलता है कि पदार्थों ने फ्लोरोसेंट सिग्नल की उपस्थिति को प्रेरित किया। एकीकृत घनत्व डेटा को मतलब ± मानक विचलन (एसडी = त्रुटि बार) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। आउटलर्स की पहचान के लिए पुनरावृत्ति ग्रब्स के साथ डेटा का विश्लेषण किया गया, जिन्हें बाहर रखा गया था । शापिरो-विल्क सामान्य परीक्षण के साथ सामान्यता के लिए डेटा की जांच की गई और पैरामेट्रिक विधियों की आवश्यकताओं के अनुपालन की स्थापना की गई। एक तरह से ANOVA का उपयोग कर सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया एक डननेट परीक्षण के बाद । एकीकृत घनत्व मूल्यों का अध्ययन करते हुए, α-ZOL(C)और α-ZOL(D)(पी एंड एलटी; 0.05) के मामलों में उपचार के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया था। स्केल बार = 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

दो पदार्थों(चित्रा 5)की एक ही उपचार सांद्रता से प्राप्त एकीकृत घनत्व मूल्यों की जांच करके, α-ZOL ने प्रत्येक मामले में उच्च एकीकृत घनत्व औसत प्रस्तुत किया, जो फ्लोरोसेंट छवियों में मनाए गए सिग्नल शक्तियों के बीच मतभेदों के अनुरूप है। सभी उपचार सांद्रता के मामलों में, महत्वपूर्ण अंतर (0.5 माइक्रोन, पी = 0.0011; 1 μM, p = 0.0003; 2 μM, p = 0.0329; और 4 माइक्रोन, पी = 0.0325) पाए गए।

Figure 5
चित्रा 5: α-और एकीकृत घनत्व मूल्यों की तुलना। एकीकृत घनत्व डेटा मतलब ± मानक विचलन एसडी = त्रुटि बार के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं। आउटलर्स की पहचान करने के लिए पुनरावर्तक ग्रब्स के साथ डेटा का विश्लेषण किया गया, जिन्हें बाहर रखा गया था । शापिरो-विल्क सामान्य परीक्षण के साथ सामान्यता के लिए डेटा की जांच की गई और पैरामेट्रिक विधियों की आवश्यकताओं के अनुपालन की स्थापना की गई। प्रत्येक एकाग्रता (0.5 माइक्रोन, पी = 0.0011; 1 μM, p = 0.0003; 2 μM, p = 0.0329; और 4 μM, पी = 0.0325) के मामले में α-ZOL और μl के बीच अकर्मित टी-परीक्षण के साथ महत्वपूर्ण मतभेदों को सत्यापित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

एस्ट्रोजेनिक प्रभावों के लिए बायोमॉनिटर/बायोइंडिटेटर का उपयोग विष विज्ञानीय अध्ययनों में फैल रहा है। वीवो मॉडल में एक उत्कृष्ट भूमिका निभाते हैं, क्योंकि इन विट्रो परीक्षणों के विपरीत, वे न केवल कोशिका या रिसेप्टर की प्रतिक्रिया के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं, बल्कि जीव में जटिल प्रक्रियाओं की जांच की अनुमति भी देते हैं। एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए कई ट्रांसजेनिक लाइनों का उत्पादन जेब्राफिश से किया गया है, जिनमें से एक टीजी (vtg1:mCherry) इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल किया गया था । यहां वर्णित विधि शुद्ध, सक्रिय अवयवों में वीवो में एस्ट्रोजन गतिविधि का पता लगाने के लिए इस लाइन के भ्रूण के परीक्षण के लिए एक प्रोटोकॉल दिखाता है।

लाइन के नर और भ्रूण भी एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का पता लगाने के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन भ्रूण में कई फायदे होते हैं जो उनकी उपयोगिता को बढ़ावा देते हैं। विशेष रूप से, शरीर पारदर्शी है, इसलिए जिगर में फ्लोरोसेंट संकेत आसानी से देखा जा सकता है। जेब्राफिश लिवर निषेचन (6 एचपीएफ) के 6 घंटे बाद विकसित होना शुरू हो जाता है और 50 घंटे (50 एचपीएफ) के बाद काम करना शुरू कर देता है। सबसे पहले, जिगर का बायां पालि बनता है, और 96 घंटे (96 एचपीएफ) पर जिगर का दाहिना पालि भी दिखाई देता है। यकृत का अंतिम आकार लगभग 5 (120 एचपीएफ)28, 29,के आसपास विकसित कियाजाताहै। यकृत भ्रूण14के 2-3 दिनों की उम्र से अंतर्जात विटेलोजेनिन का उत्पादन करने में सक्षम है, जो टीजी (vtg1:mCherry) लाइन15में फ्लोरोसेंट सिग्नल की उपस्थिति के साथ मेल खाता है। इसलिए, प्रयोगों को डिजाइन करते समय, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि उस समय से केवल भ्रूण के यकृत में फ्लोरोसेंट सिग्नल की उम्मीद की जा सकती है। 5 दिन पुराने भ्रूण का जिगर पहले से ही अपेक्षाकृत बड़े क्षेत्र में अच्छी तरह से परिभाषित है, जहां फ्लोरोसेंट सिग्नल को स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत आसानी से पता लगाया जा सकता है। यह परीक्षण प्रोटोकॉल है कि पशु संरक्षण कानूनों के अधीन नहीं है के विकास संभव बनाता है । विटेलेजेनिन, और इसी तरह फ्लोरोसेंट प्रोटीन, भ्रूण के जिगर15के बाएं पालि द्वारा उत्पादित होते हैं। इसलिए, फ्लोरोसेंट सिग्नल की जांच या तस्वीरें लेते समय सबसे मजबूत संकेत का पता लगाने के लिए भ्रूण का स्थानिक अभिविन्यास महत्वपूर्ण है। यही कारण है कि प्रोटोकॉल में बाईं ओर भ्रूण रखे गए थे। जैसा कि प्रतिनिधि परिणामों से देखा जा सकता है, परीक्षण नमूने का एस्ट्रोजेनिक प्रभाव स्पष्ट रूप से यकृत में फ्लोरोसेंट सिग्नल द्वारा इंगित किया जाता है, इसलिए परिणामों का मूल्यांकन नेत्रहीन भी किया जा सकता है। यदि परिणामों की मात्रा की आवश्यकता है, तो इमेजजे कार्यक्रम द्वारा परिभाषित एकीकृत घनत्व मूल्य उपयुक्त है। हालांकि, उचित मूल्यांकन के लिए, यह अपरिहार्य है कि छवियों को प्रयोग के दौरान एक ही सेटिंग्स के साथ लिया जाए, और हाइलाइट किए गए फ्लोरोसेंट क्षेत्रों का आकार प्रत्येक छवि में समान है। भ्रूण की सटीक स्थिति के साथ, ये प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं। यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि भ्रूण के मामले में ट्रांसजीन की अभिव्यक्ति, इसी तरह अंतर्जात विटेलोजेनिन के उत्पादन के लिए, व्यक्तिगत संवेदनशीलता में एक बड़ा फैलाव और अंतर दिखाता है। कुछ मामलों में, यह परिणामों में बड़ी विविधताओं का कारण बन सकता है, जिसे प्रयोगों को डिजाइन करते समय ध्यान में रखा जाना चाहिए।

उपचार सांद्रता का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि भ्रूण की कोशिकाओं, और इसलिए जिगर की कोशिकाओं, अत्यधिक विषाक्त पदार्थों की उच्च सांद्रता से क्षतिग्रस्त हो सकता है, जो vitellogenin प्रेरण में गिरावट का कारण बन सकता है । इसलिए, परीक्षण एलसी1015से नीचे सांद्रता पर किया जाना चाहिए।

एस्ट्रोजन के प्रति संवेदनशील मछली रेखाओं की संवेदनशीलता की तुलना एक दूसरे से करना एक कठिन कार्य है, क्योंकि अब तक वर्णित रेखाओं का परीक्षण विभिन्न प्रोटोकॉल5,14, 15,,,16के अनुसार किया गया है ।,15 इस प्रोटोकॉल में परीक्षण की गई लाइन शुद्ध सक्रिय अवयवों, घोला जा सकता है, और पर्यावरण के नमूनों के मामलों में खुराक प्रभाव संबंधों का पता लगाने में सक्षम है, और प्राप्त परिणाम BLYES परीक्षणों और हेला कोशिकाओं15,,20के साथ परिणामों के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध हैं।

एजेंटों का परीक्षण करने के लिए लाइन के भ्रूण की उपयोगिता साबित हो गई है, जिसमें ज़ेरालेनोन15शामिल हैं। इस काम में टॉक्सिन के दो मेटाबोलाइट्स, α-α-1-zearalenol का परीक्षण किया गया। साहित्य के आंकड़ों के अनुसार, α-ZOL30 की तुलना में अधिक विषाक्त है और इसकी एस्ट्रोजनिटी भी31अधिक है । इन परिणामों की पुष्टि हमारी पढ़ाई से होती है । इस प्रकार, रेखा के भ्रूण पर अध्ययन अन्य एस्ट्रोजेनिक पदार्थों के एस्ट्रोजेनिक प्रभावों की तुलना करने के लिए भी उपयुक्त हैं।

खाद्य श्रृंखला में माइकोटॉक्सिन संदूषण एक वैश्विक समस्या है, इसलिए पशु चारे और मानव भोजन25, 32,32में माइकोटॉक्सिन के स्तर को कम करने के लिए कई प्रक्रियाओं में सुधार किया गया है। सबसे आशाजनक समाधानों में से एक सूक्ष्मजीवों या उनके एंजाइमों द्वारा माइकोटॉक्सिन बायोडिग्रेडेशन है। यह माइकोटॉक्सिन विसंदूषण को कम करने या खत्म करने के लिए एक आवश्यक पोस्टहैर्वेस्ट विधि हो सकती है। साहित्य में अब तक कई जीवाणु उपभेदों की जीईए अपमानजनक क्षमता का परीक्षण किया गया है, हालांकि, हाल के शोध निष्कर्ष जो विष के उच्च क्षरण को साबित करते हैं, शायद ही कभी मेटाबोलाइट्स33के प्रतिकूल प्रभाव को निर्दिष्ट करते हैं। क्योंकि इस लाइन के भ्रूण सैद्धांतिक रूप से कार्बनिक पदार्थ सामग्री15के साथ नमूनों के एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का परीक्षण करने के लिए उपयुक्त हैं, एक उपचार प्रोटोकॉल विकसित किया जा सकता है जो ज़ीरा के बायोडिग्रेडेशन उत्पादों और अपमानजनक उपभेदों की योग्यता का परीक्षण करने में मदद कर सकता है।

इस प्रोटोकॉल को नियोजित परीक्षण एंडपॉइंट्स (जैसे, एक्सपोजर शुरुआत और लंबाई) और नमूनों (जैसे, मिश्रण या पर्यावरणीय नमूनों) के अनुसार कई मायनों में बदला जा सकता है जिनका परीक्षण किया जा रहा है और अन्य परीक्षण विधियों (जैसे, आणविक विधियों) के साथ पूरा किया जा सकता है। इस प्रकार, हमें उम्मीद है कि टीजी (vtg1:mCherry) लाइन का उपयोग एस्ट्रोजेनिकिटी परीक्षणों का मॉडल और मानक परीक्षण विधियों के लिए बन जाएगा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय अनुसंधान, विकास और नवाचार कोष (एनकेएफआईएच) से राष्ट्रीय अनुसंधान, विकास और नवाचार कार्यालय (एनकेएफआईएच) द्वारा समर्थित किया गया था; अनुदान समझौता: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 परियोजना सह यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषित, और विषयगत उत्कृष्टता कार्यक्रम NKFIH-831-10/2019 S Szent István विश्वविद्यालय मंत्रालय, नवाचार और प्रौद्योगिकी के लिए संमानित किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well tissue culture plate Jet Biofil TCP011024
Calcium-chloride (CaCl2) Reanal Laborvegyszer Ltd. 16383-0-27-39
GraphPad Prism 6.01 software GraphPad Software Inc.
ImageJ software National Institutes of Health, USA Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/
Leica Application Suite X calibrated software Leica Microsystems GmbH. We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests
Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera Leica Microsystems GmbH. We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests
Magnesium-sulphate (MgSO4) Reanal Laborvegyszer Ltd. 20342-0-27-38
mCherry filter Leica Microsystems GmbH.
Mehyl-cellulose Sigma Aldrich Ltd. 274429
Microloader pipette tip Eppendorf GmbH. 5242956003
Pasteur pipette VWR International LLC. 612-1684
Petri-dish Jet Biofil TCD000060
Potassium-chloride (KCl) Reanal Laborvegyszer Ltd. 18050-0-01-33
Sodium-chloride (NaCl) Reanal Laborvegyszer Ltd. 24640-0-01-38
Tricane-methanesulfonate (MS-222) Sigma Aldrich Ltd. E10521

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
  2. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
  3. Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
  4. Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
  5. Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
  6. Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
  7. Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
  8. Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
  9. Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
  10. Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
  11. Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
  12. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
  13. Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
  14. Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
  15. Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
  16. Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
  17. Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
  18. Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
  19. Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
  20. Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
  21. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
  22. Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
  23. Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
  24. Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
  25. Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
  26. Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
  29. Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
  30. Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
  31. Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
  32. Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
  33. Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).

Tags

पर्यावरण विज्ञान अंक 162 एंडोक्राइन बाधित यौगिकों ईडीसी ज़ेरालेनोन ज़ेरालेनॉल बायोमॉनिटर बायोइंडिकेटर ज़ेनोएस्ट्रोजेन्स विटेलोजेनिन
एंडोक्राइन बाधित यौगिकों के एस्ट्रोजेनिक प्रभावों का परीक्षण करने के लिए टीजी (Vtg1:mcherry) ज़ेब्राफ़िश भ्रूण का उपयोग करना
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Csenki, Z., Horváth, Á., Bock,… More

Csenki, Z., Horváth, Á., Bock, I., Garai, E., Kerekes, F., Vásárhelyi, E., Kovács, B., Urbányi, B., Mueller, F., Bakos, K. Using Tg(Vtg1:mcherry) Zebrafish Embryos to Test the Estrogenic Effects of Endocrine Disrupting Compounds. J. Vis. Exp. (162), e60462, doi:10.3791/60462 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter