Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

Использование Tg (Vtg1:mcherry) Эмбрионы зебры для тестирования эстрогенных эффектов эндокринных разрушающих соединений

Published: August 8, 2020 doi: 10.3791/60462
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Aquaculture, Institute of Aquaculture and Environmental Safety, Faculty of Agricultural and Environmental Sciences, Szent István University, 2Institute of Cancer and Genomic Sciences, College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham

Summary

Здесь представлен подробный протокол использования эмбрионов зебры Tg (vtg1: mCherry) для выявления эстрогенных эффектов. Протокол охватывает распространение рыбы и лечение эмбрионов, а также подчеркивает обнаружение, документацию и оценку флуоресцентных сигналов, индуцированных эндокринными разрушающих соединений (EDC).

Abstract

Есть много эндокринных разрушающих соединений (EDC) в окружающей среде, особенно эстрогенных веществ. Обнаружение этих веществ затруднено из-за их химического разнообразия; таким образом, все больше и больше эффект-обнаружение методы используются, такие как эстрогенный эффект чувствительных биомониторов / биоиндикатных организмов. Эти биомониторинговые организмы включают в себя несколько моделей рыб. Этот протокол охватывает использование трансгенной линии зебры Tg (vtg1: mCherry) в качестве биомониторинга организма, включая распространение рыбы и обработку эмбрионов, с акцентом на обнаружение, документацию и оценку флуоресцентных сигналов, индуцированных EDC. Целью работы является демонстрация использования трансгенных эмбрионов Tg (vtg1: mCherry) для обнаружения эстрогенных эффектов. Эта работа документирует использование трансгенных эмбрионов зебры Tg (vtg1: mCherry) для обнаружения эстрогенных эффектов путем тестирования двух эстрогенных веществ, з-и-зеараленол. Описанный протокол является лишь основой для разработки анализов; метод тестирования может быть изменен в зависимости от конечных точек тестирования и образцов. Кроме того, он может быть объединен с другими методами анализа, тем самым облегчая дальнейшее использование трансгенной линии.

Introduction

Существует значительное количество эндокринных разрушающих соединений (EDC), которые являются одними из самых опасных веществ в нашей окружающей среде. В основном это эстрогенные соединения, которые загрязняют воду из природных ресурсов. Химическое разнообразие веществ, принадлежащих к группе, затрудняет тестирование на их присутствие, поскольку для их обнаружения требуются различные аналитические методы. Основываясь на их химической структуре очень трудно определить, является ли вещество на самом деле в состоянии выступать в качестве эстрогена. Кроме того, эти вещества никогда не присутствуют в чистом виде в окружающей среде, поэтому их последствия могут быть затронуты другими соединениями, слишком1. Эта проблема может быть решена с помощью эффект-обнаружение методов, таких как использование биомониторов / биоиндикатных организмов, которые показывают эстрогенные эффекты2,,3,,4,5.

В последнее время, различные клеточные линии6 и дрожжей на основе тестовых систем2,3 были разработаны для обнаружения эстрогенных эффектов. Тем не менее, они, как правило, только в состоянии обнаружить привязку вещества к рецептору эстрогена2,3. Кроме того, они не в состоянии моделировать сложные физиологические процессы в организме или обнаруживать гормоночувствительные фазы жизненных стадий; таким образом, они часто приводят к ложным результатам.

Известно, что некоторые гены чутко реагируют на эстроген в живых организмах7. Обнаружение генных продуктов методами молекулярной биологии также возможно на уровнепротеинаили мРНК 8 ,9,но обычно включает животную жертву. Законы о защите животных стали более строгими, и растет спрос на альтернативные системы испытаний, которые сводят к минимуму количество и страдания животных, используемых в экспериментах или замены животного модели с другой моделью системы10. С открытием флуоресцентных белков и созданием линий биомаркеров, трансгенные технологии обеспечивают хорошую альтернативу11. С помощью этих линий, активация эстроген-чувствительный ген может быть проверена in vivo.

Среди позвоночных неотябавный потенциал рыбы в оценке экологического риска. Они предлагают много преимуществ перед моделями млекопитающих: будучи водными организмами, они способны поглощать загрязняющие вещества через все их тело, производить большое количество потомства, а некоторые из их видов характеризуются коротким временем поколения. Их эндокринная система и физиологические процессы показывают большое сходство с другими позвоночными и даже с млекопитающими, в том числе людей12.

Также известно несколько генов для выявления эстрогенных эффектов у рыб. Наиболее важными являются рецепторы эстрогена ароматазы-b, чориогенин-H, и вителлогенин (втг)7,13. В последнее время несколько эстроген-производящих биосенсорных линий также были созданы из рыбных моделей, используемых в лаборатории, таких как из зебры(Данио рерио)4,5,14,15,16,17. Основным преимуществом зебры в создании биосенсорных линий является прозрачное тело эмбрионов и личинок, потому что флуоресцентный сигнал репортера можно легко изучить в виво, не жертвуя животным10. В дополнение к защите животных, это также ценная особенность, поскольку она позволяет для изучения реакции одного и того же человека в разное время лечения18.

Эти эксперименты используют vitellogenin репортер трансгенной зебры линии15. Трансгенная конструкция, используемая для разработки Tg (vtg1:mCherry), имеет длинный (3,4 кбп) естественный вителлогенин-1 промоутер. Рецептор эстрогена (ER) является усилитель белка активируется лиганды, который является представителем стероидных / ядерных рецепторов суперсемейства. ER связывается с конкретными последовательностями ДНК, называемыми элементами реакции эстрогена (EREs) с высоким сродством и трансактивирует экспрессию генов в ответ на эстрадиол и другие эстрогенные вещества, поэтому чем больше ERE в промоутере вызывает более сильную реакцию19. Есть 17 ERE сайтов в области промоутера Tg (vtg1:mCherry) трансгена построить, и они, как ожидается, имитировать выражение родного гена vtg15. Существует непрерывное выражение флуоресцентного сигнала у сексуально созревает самок. Однако у мужчин и эмбрионов экспрессия в печени видна только при лечении эстрогенными веществами(рисунок 1).

Figure 1
Рисунок 1: Красный флуоресцентный сигнал в печени vtg1:mЧерри трансгенных взрослых зебры и 5 dpf эмбрионов, после 17-я-эстрадиол (E2) индукции. У самок и у мужчин, обработанных Е2 (25 мкг/л времени воздействия:48hrs) сильная флуоресценция печени видна даже через пигментированную кожу. Нет флуоресцентный сигнал не виден в необработанных мужчин (). После индукции E2 (время экспозиции 50 мкг/л: 0-120 л.с.) можно также наблюдать красный флуоресцентный сигнал в печени 5 эмбрионов dpf, который не виден в контрольных эмбрионах(B). В то время как флуоресцентный сигнал постоянно присутствует у взрослых самок, в первую очередь мужчины и эмбрионы линии подходят для обнаружения эстрогенных эффектов. (BF: яркое поле, mCherry: красный флуоресцентный вид фильтра, однозначные изображения, шкала бар A: 5mm, масштаб бар B: 250 мкм) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Как и эндогенный вителлогенин, репортер mCherry выражается только в печени. Поскольку вителлогенин производится только в присутствии эстрогена, нет флуоресцентного сигнала в элементах управления. Потому что выражение только в печени, оценка результатов гораздо проще15.

Чувствительность и удобство использования эмбрионов этой линии были исследованы на различных эстрогенных смеси, а также на экологических образцов15,,20, и в большинстве случаев доза-ответ отношения были задокументированы (Рисунок 2). Однако, в случае высокотоксичных, в основном гепатотоксических веществ (например, зеараленон), только очень слабый флуоресцентный сигнал может быть виден в печени обработанных эмбрионов и максимальной интенсивности флуоресцентный сигнал, вызванный может быть достигнуто в пределах очень небольшой диапазон концентрации, что делает его трудно установить доза-эффект отношений20.

Figure 2
Рисунок 2: Диаграмма доза-реакция (A) и флуоресцентные изображения (mCherry) печени (B) подвергаются 17-З-этинилэстрадиол (EE2), в 5 dpf vtg1:mCherry личинок. Результаты выражаются как интегрированная плотность, генерируемая из силы сигнала и размера пораженного участка (SEM, n ю 60). 100% относится к наблюдаемым максимуму. Интенсивность флуоресцентного сигнала постепенно увеличивалась с концентрацией. Масштабная панель No 250 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Есть несколько эстрогенных веществ, присутствующих в окружающей среде, 17-э-эстрадиол (экологическая концентрация: 0,1-5,1 нг/л)21,17-й-этинилэстрадиол (экологическая концентрация: 0,16–0,2 г/л) L)22, зеараленон (экологическая концентрация: 0,095-0,22 мкг/л)23, бисфенол-А (экологическая концентрация: 0,45-17,2 мг/л)24. При тестировании этих веществ в чистом активном виде с помощью трансгенных эмбрионов mCherry, самые низкие наблюдаемые концентрации эффекта (LOEC) для обнаружения флуоресцентных знаков были 100 нг/л для 17-й-эстрадиола, 1 нг/л для 17-З-этинилэстрадиола, 100 нг/л для зеараленона и 1 мг/л для бисфенола-А (96-120 л.с.), что очень близко к или в пределах экологических концентраций веществ15. Трансгенная линия Tg (vtg1:mCherry) может помочь обнаружить эстрогенность в образцах сточных вод после прямого воздействия. Линия так же чувствительна, как обычно используемый тест дрожжевого эстрогена, биолюминисцентный дрожжевой эстроген (BLYES) анализ15. С помощью этой линии, защитные эффекты бета-циклодекстрина против зеараленона индуцированной токсичности было подтверждено с помощью химических смесей20.

В недавнем докладе, in vivo использование трансгенной линии было продемонстрировано с помощью двух эстрогенных зеленонов (ЗЕА) метаболитов, з-- и Зеараленол (З-ЗОЛ И-ЗОЛ)25. Базовый протокол подходит для изучения эстрогенного воздействия нескольких соединений или образцов окружающей среды на эмбрионах Tg (vtg1:mCherry).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Протокол о животных был утвержден в соответствии с Венгерским законом о защите животных, и все исследования были завершены до того, как пролеченные лица достигли стадии бесплатного кормления.

1. Урожай эмбрионов и лечение

  1. Поддерживайте Tg (vtg1:mCherry) зебру на 25,5 и 0,5 градуса по Цельсию, рН , 7 й 0,2, проводимость между 525 и 50 градусами/м, уровень кислорода 80% насыщения, и 14 ч света и 10 ч темного цикла.
  2. Заполните брачные баки с системной водой и настроить рыбу для спаривания во второй половине дня перед уборкой яиц.
  3. Поместите самца и самку рыбы в бак и отделить их с помощью разделителя.
  4. Удалите разделитель из цистерн, как свет включается на следующее утро. Проверяйте брачные баки на яйца каждые 15-20 мин.
  5. Урожай всех эмбрионов с помощью чайного ситечко или плотно сплетенной тонкой сетки и объединить их в одну большую чашку Петри с буфером E3 (5 мМ хлорида натрия, 0,17 мм хлорида калия, 0,33 мм хлорида кальция, 0,33 мМ сульфата магния) или чистой системой воды.
  6. Поместите эмбрионы в набор инкубатора до 25,5 и 0,5 градусов по Цельсию.
  7. После 1-1,5 ч удалите и выбросьте неоплодотворенных или недостаточно разделяющих яйца с пластиковой трубой передачи под рассекающим микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неоплодотвореские яйца непрозрачны; оплодотворенные яйцеклетки прозрачны. Чтобы начать лечение на более поздней стадии развития, обратите внимание на нормальное развитие людей, пролеченных.
  8. Поместите выбранные эмбрионы в лечебные сосуды (например, в чашки Петри или пластины культуры тканей), которые уже были помечены и заполнены различными концентрациями тест-вещества.
  9. Инкубировать эмбрионы при 25,5 и 0,5 градусов по Цельсию до конца эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы могут реагировать со значительной индивидуальной чувствительностью к различным эстрогенным соединениям, поэтому рекомендуется использовать по крайней мере 15 эмбрионов, по крайней мере в трех повторных процедур для того, чтобы оценить эксперимент должным образом. При выборе контейнера имейте в виду, что для развития эмбриона требуется не менее 200 мл воды26. В этом эксперименте эмбрионы были инкубированы до 120 л.с. при 25,5 и 0,5 градусов по Цельсию.
  10. Обновите тестовое решение, если оно не является нецеремарной для поддержания концентрации лечения. Будьте осторожны при изменении тестового решения, чтобы избежать повреждения эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также можно исследовать смертность или сублетальные симптомы во время эксперимента. Используемые концентрации должны оставаться как можно более стабильными для получения надежных результатов. Это может быть легко достигнуто путем обновления тестовых решений. Частота освежения может варьироваться в зависимости от испытательного вещества. Поэтому желательно проверить концентрацию испытательного вещества аналитическими измерениями для определения частоты обновления раствора.

2. Подготовка к фотографии

  1. Предварительно подготовьте 4% метилцеллюлозу с MS-222 (трекаин-метан-сульфонат).
    1. Для этого добавьте 4 мг/мЛ MS-222 до 100 мЛ двойной дистиллированной воды до конечной концентрации 0,168 мг/мл, и доведите раствор до 4 градусов по Цельсию. Затем добавьте 4 г метилцеллюлозы. Перемешать с магнитным мешалкой, а затем оставить его в 4 градусов по Цельсию на ночь.
    2. На следующий день снова перемешайте и раствор должен быть готов к использованию. Если метилцеллюлоза не полностью растворилась, положите его обратно при 4 градусах Цельсия и подождите еще несколько часов.
  2. Поместите 5-дневных личинок в 5-сантиметровую чашку Петри на группу лечения с пастер-пипеткой.
  3. Снимите раствор лечения с личинок с помощью пластиковой пипетки, а затем заполните чашку Петри 2 мЛ 0,02% MS-222 анестезирующим раствором.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия, как правило, эффективна менее чем за минуту. Личинки под наркозом, если они не уплывают в ответ на ощупь. Передозировка МС-222 может убить личинок.
  4. Заполните каждый квадрат специально разработанной 10 см чашки Петри с 4% метилцеллюлозы с MS-222(рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клей два 1,5 х 1,5 см квадратных площадей в нижней части чашки Петри с использованием пластиковых листов (1 мм высотой, 5 мм в ширину). Двадцать личинок могут быть размещены рядом друг с другом в квадрате. Вместо специально разработанной чашки Петри, другой контейнер с низким краем может быть использован для фиксации положения эмбрионов.

Figure 3
Рисунок 3: 10 см Петри блюдо с клееным 1,5 х 1,5 см в ширину, 1 мм толщиной пластиковые квадраты листа для личинок подготовки к фотографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Перенесите подлечировая личинки метилцеллюлозы с небольшим количеством воды в одном из двух квадратов. С первого квадрата переносит личинки во второй квадрат.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этого переноса, 4% метилцеллюлозы, используемые для фотографии не будет разбавлена и личинки не будут вращаться во время визуализации.
  2. Во втором квадрате, вращать и ориентировать личинок на левую сторону и осторожно прижмите их к нижней части целлюлозы с микроплатежом пипетки наконечник разрезать до 2 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте другие советы пипетки, потому что они вызывают травму личинок.

3. Микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: Фотография не убивает животных. Звери могут быть пробуждены, удалив их из метилцеллюлозы и поместив их в пресноводное водное или очистное раствор, поэтому один и тот же человек может быть осмотрен несколько раз во время лечения.

  1. Для того, чтобы оценить сигнал выраженного репортера, изображение эмбрионов с тем же видом и настройками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите шаг 2.6 для оптимального позиционирования эмбриона. Фотографии в рукописи были сделаны в описанных условиях. Яркое поле: 60-х увеличение, 6 мс экспозиция, Iris 100%, Прибыль:1.1, флуоресценция фотографии: 60x увеличение, 300 мс экспозиция, Iris: 100%, Прибыль:1, фильтр mCherry, флуоресцентный источник света: ртутная металлическая галидная лампа. Для фотосъемки использовались флуоресцентный стереомикроскоп, специальная камера и программное обеспечение для микроскопа.
  2. Поместите чашку Петри на сцену микроскопа.
  3. Сосредоточьтесь на печени эмбриона и захватите яркое изображение поля с помощью связанного программного обеспечения.
  4. Переключите микроскоп на фильтр mCherry и возьмите флуоресцентное изображение печени под флуоресцентным светом с помощью связанного программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги флуоресценции в темноте. Не меняйте увеличение, фокус или положение эмбриона между захватом яркого поля и флуоресцентными изображениями, так как это поможет в анализе изображений.
  5. Повторите шаги 3.3 и 3.4 до тех пор, пока все эмбрионы в эксперименте не будут изображены.

4. Определение интегрированной плотности

ПРИМЕЧАНИЕ: Одним из лучших индикаторов для сравнения силы флуоресцентного сигнала является интегрированное значение плотности (т.е. продукт области и среднее значение серого). Один из самых простых способов определения интегрированной плотности является использование программы ImageJ27. Программа доступна в Интернете и может быть установлена на компьютере.

  1. Затем Open ImageJ загрузите флуоресцентное изображение для анализа путем перетаскивания и падения изображения или нажатия на файл. Открыть.
  2. Нажмите на изображение Цвет Сплит каналов для разделения изображения, сделанного флуоресцентным фильтром в соответствии с цветовой диаграммой RGB.
  3. Работайте с красным спектром изображения канала, закройте другие каналы.
  4. Назначьте эллиптической области аналогичного размера в изображении, чтобы ложные сигналы не мешали оценке. Используя овальные инструменты, нарисуйте эллипс над выделенной областью печени как можно точнее.
  5. Если сигнал слабый, используйте световые микроскопии (т.е. яркую полевую пару флуоресцентного изображения) для определения местоположения печени.
  6. Нажмите на Анализ Мера для определения силы сигнала и размера пораженного участка. Значение интегрированной плотности автоматически рассчитывается программным обеспечением (столбец IntDen в диаграмме).
  7. Продолжайте анализ, повторяя шаги 4.1-4.6 до тех пор, пока не будут проанализированы все флуоресцентные изображения всех эмбрионов в группе лечения.
  8. Сохраните данные, а затем проанализируйте значения интегрированной плотности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда выберите один и тот же размер области в изображениях во время анализа. Размер исследуемой области зависит от увеличения, разрешения изображения, других параметров съемки и т.д. Анализ можно ускорить или сделать более точным с помощью персональных макросов для анализа. Например, макросы могут быть использованы для обеспечения того, чтобы выбранная область всегда была одинаковой в исследуемых изображениях. Подробные описания для создания макросов, позволяющих проводить лучший анализ изображений в соответствии с определенными настройками фотографии, можно найти на веб-сайте ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В эксперименте, представленном в этой рукописи, эффекты двух эстрогенных веществ были протестированы при пяти концентрациях, начиная с оплодотворения в течение 5 дней на Tg (vtg1:mCherry) эмбрионов зебры. Мы исследовали, появились ли флуоресцентные сигналы в печени рыбы к концу времени воздействия из-за веществ и были ли различия в эстрогенности этих двух веществ. Результаты оценивались на основе флуоресцентных изображений и значений интегрированной плотности. В целом, оба вещества индуцировали экспрессию трансгена к концу времени воздействия в тех испытательных концентрациях, в которых люди выжили. В случаях необработанной рыбы контроля не было видно флуоресцентного сигнала.

В случае З-ЗОЛ, при самой высокой концентрации теста (8 МЛ) все люди погибли, поэтому в этом случае флуоресцентный сигнал не мог быть исследован. При более низких концентрациях (0,5-м-4 МК) в печени эмбрионов наблюдался сильный флуоресцентный сигнал(рисунок 4A). Не наблюдалось существенной разницы в интенсивности флуоресценции и размерах флуоресцентных зон (p q lt; 0.05). Значения интегрированной плотности q-ЗОЛ(рисунок 4C),показывают, что вещество индуцировало появление флуоресцентного сигнала. Не было обнаружено существенной разницы между значениями интегрированной плотности и между процедурами (p q lt; 0.05). Средняя интегрированная плотность варьировалась от 31,26 и 13,95 (0,5 МК) и 34,25 и 15,36 (4 МК).

Во время лечения З-ЗОЛ не было зафиксировано ни одной смертности, и вещество, индуцированное трансгенной активностью во всех лечебных концентрациях. Интенсивность флуоресценции и размер флуоресцентной области увеличились по мере увеличения концентрации, как видно на флуоресцентных изображениях(рисунок 4B). Сравнивая флуоресцентные изображения з-и З-ЗОЛ визуально, как сила сигнала, так и размер флуоресцентной области были заметно слабее для З-ЗОЛ при одинаковых лечебных концентрациях двух веществ. Изучение интегрированных значений q-ЗОЛ(рисунок 4D),среднее значение интегрированной плотности почти удвоилось между самой низкой и самой высокой концентрацией лечения. Однако в случае З-ЗОЛ не было существенной разницы между значениями интегрированной плотности отдельных концентраций (p q lt; 0.05). Средняя интегрированная плотность варьировалась от 15,86 и 4,08 (0,5 МК) и 21,73 и 5,94 (8 МКМ).

Figure 4
Рисунок 4: Презентация значений интегрированной плотности, полученных от интенсивности флуоресцентных сигналов в печени и от размера пораженного участка, вызванного лечением з- и Зеараленола на 5-дневном Tg (vtg1:mCherry) трансгенных эмбрионах зебры. В ходе эксперимента эстроген-чувствительные эмбрионы линии биомаркеров зебры (20 личинок на группы в трех реплицах в каждой концентрации лечения) были обработаны 0,5 -М-8 -М концентрации q- и q-ЗОЛ от оплодотворения и далее в течение 5 дней. Изображения печени рыбы для З-ЗОЛ (A), и Q-ЗОЛ(B) ясно показывают, что вещества индуцированных появление флуоресцентного сигнала. Данные о интегрированной плотности представлены в виде среднего стандартного отклонения (SD - бар ошибок). Данные были проанализированы с итеративными Граббсами для выявления выбросов, которые были исключены. Данные были проверены на нормальность с тестом на нормальность Шапиро-Вилка и были установлены требования параметрических методов. Статистический анализ проводился с использованием одностороннего ANOVA после теста Даннетта. Изучая значения интегрированной плотности, не было обнаружено существенной разницы между методами лечения в случаях С-ЗОЛ(C)и З-ЗОЛ(D)(p q lt; 0.05). Масштабная панель No 200 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Изучая значения интегрированной плотности, полученные из тех же концентраций обработки двух веществ(рисунок 5),З-ЗОЛ представил более высокие значения интегрированной плотности в каждом случае по отношению к З-ЗОЛ, что согласуется с различиями между сильными сторонами сигнала, наблюдаемыми на флуоресцентных изображениях. В случаях всех лечебных концентраций были обнаружены значительные различия (0,5 мкМ, р 0,0011; 1 мкм, р 0,0003; 2 мкм, р 0,0329; и 4 мкм, р 0,0325).

Figure 5
Рисунок 5: Сравнение значений интегрированной плотности q-и q-zearalenol. Интегрированные данные плотности представлены в виде средней стандартной панели отклонений SD и ошибки. Данные были проанализированы с итеративными Граббсами для выявления выбросов, которые были исключены. Данные были проверены на нормальность с тестом на нормальность Шапиро-Вилка и были установлены требования параметрических методов. Значительные различия были проверены с помощью неспаренных т-теста между З-ЗОЛ И ЗОЛО в случае каждой концентрации (0,5 МКМ, р 0,0011; 1 qM, р 0,0003; 2 qM, p 0.0329; и 4 м, р, р 0,0325). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Использование биомониторов/биоиндикатов для эстрогенного воздействия распространяется в токсикологических исследованиях. In vivo модели играют выдающуюся роль, так как в отличие от проб в пробирке, они не только предоставляют информацию о реакции клетки или рецептора, но и позволяют исследовать сложные процессы в организме. Несколько трансгенных линий для изучения эстрогенных эффектов были произведены из зебры, одна из которых Tg (vtg1:mCherry) была использована для этих исследований. Метод, описанный здесь, иллюстрирует протокол для тестирования эмбрионов этой линии для того, чтобы обнаружить активность эстрогена в vivo в чистых, активных ингредиентов.

Самцы и эмбрионы линии также подходят для обнаружения эстрогенных эффектов, но эмбрионы имеют ряд преимуществ, которые способствуют их удобству использования. В частности, тело прозрачное, поэтому флуоресцентный сигнал в печени можно легко наблюдать. Печень зебры начинает развиваться через 6 часов после оплодотворения (6 л.с.) и начинает работать через 50 часов (50 л.с.). Во-первых, левая доля печени формируется, и в 96 часов (96 л.с.) правая доля печени также появляется. Окончательная форма печени разработана примерно на день 5 (120 л.с.)28,29. Печень способна производить эндогенный вителлогенин в возрасте от 2 до 3 дней эмбриона14,что совпадает с появлением флуоресцентного сигнала в линии Tg (vtg1:mCherry) 15. Поэтому при проектировании экспериментов следует учитывать, что флуоресцентный сигнал можно ожидать только в печени эмбриона того времени. Печень 5-дневных эмбрионов уже четко определена на относительно большой площади, где флуоресцентный сигнал можно легко обнаружить под стереомикроскопом. Это делает возможным разработку протоколов испытаний, которые не подпадают под действие законов о защите животных. Вителлогенин, и так же флуоресцентный белок, производятся левой долей печени эмбрионов15. Поэтому пространственная ориентация эмбрионов важна для обнаружения самого сильного сигнала при изучении флуоресцентного сигнала или фотографировании. Вот почему эмбрионы были заложены слева в протоколе. Как видно из репрезентативных результатов, эстрогенный эффект тестового образца четко указывается флуоресцентным сигналом в печени, поэтому результаты могут быть оценены и визуально. Если необходима количественная оценка результатов, то значение интегрированной плотности, определяемое программой ImageJ, является целесообразным. Однако для надлежащей оценки необходимо, чтобы изображения были сделаны с теми же настройками во время эксперимента, и что размер выделенных флуоресцентных областей одинаков в каждом изображении. Вместе с точным позиционированием эмбрионов, это наиболее важные шаги в протоколе. Важно отметить, что в случае эмбрионов экспрессия трансгена, подобно производству эндогенного вителлогенина, показывает большую дисперсию и различия в индивидуальной чувствительности. В некоторых случаях это может привести к большим колебаниям результатов, которые следует учитывать при проектировании экспериментов.

Важным аспектом в определении концентрации лечения является то, что клетки эмбрионов, и, следовательно, клетки печени, могут быть повреждены высокой концентрацией высокотоксичных веществ, что может привести к снижению индукции вителлогенина. Поэтому тесты должны проводиться в концентрациях ниже LC1015.

Сравнение чувствительности эстроген-чувствительных линий рыб друг с другом является трудной задачей, потому что линии, описанные до сих пор были протестированы в соответствии с различными протоколами5,,14,15,16. Линия, проверенная в этом протоколе, способна обнаруживать отношения доза-эффекта в случаях чистых активных ингредиентов, смесей и экологических образцов, а полученные результаты хорошо коррелируют с результатами с тестами BLYES и клетками HeLa15,,20.

Доказана полезность эмбрионов линии для тестирования агентов, в том числе зеараленона15. В этой работе были протестированы два метаболита токсина, З-и З-зеараленол. Согласно данным литературы, З-ЗОЛ более токсичен, чем ЗОЛ30, а его эстрогенность также выше31. Эти результаты подтверждаются нашими исследованиями. Таким образом, исследования на эмбрионах линии также подходят для сравнения эстрогенных эффектов других эстрогенных веществ.

Загрязнение микотоксином в пищевой цепи является глобальной проблемой, поэтому несколько процедур были улучшены для снижения уровня микотоксина в кормах для животных и человеческой пищи25,32. Одним из наиболее перспективных решений является биодеградация микотоксина микроорганизмами или их ферментами. Это может быть важным методом postharvest для уменьшения или устранения микотоксина обеззаражить. Деградируя способность КЭА многочисленных бактериальных штаммов была протестирована в литературе до сих пор, однако, последние результаты исследований, которые доказывают высокую деградацию токсина редко указывают неблагоприятное влияние метаболитов33. Поскольку эмбрионы этой линии теоретически подходят для проверки эстрогенных эффектов образцов с содержанием органических веществ15, можноразработать протокол лечения, который может помочь проверить биодеградационную продукцию ЗЭА и квалификацию деградурющих штаммов.

Этот протокол может быть изменен во многих отношениях в соответствии с запланированными конечными точками испытаний (например, начало и длина экспозиции) и в образцы (например, смеси или образцы окружающей среды), которые будут проверены и могут быть завершены с другими методами испытаний (например, молекулярные методы). Таким образом, мы надеемся, что использование линии Tg (vtg1:mCherry) станет моделью тестов эстрогенности и для стандартных методов тестирования.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Национальным управлением по исследованиям, разработкам и инновациям (NKFIH) из Национального фонда исследований, разработок и инноваций (NKFIA); Грантовое соглашение: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 проект, совместно финансируемый Европейским Союзом, и тематическая программа передового опыта NKFIH-831-10/2019 Университета Сента Иштвана, присуждаемая Министерством инноваций и технологий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 well tissue culture plate Jet Biofil TCP011024
Calcium-chloride (CaCl2) Reanal Laborvegyszer Ltd. 16383-0-27-39
GraphPad Prism 6.01 software GraphPad Software Inc.
ImageJ software National Institutes of Health, USA Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/
Leica Application Suite X calibrated software Leica Microsystems GmbH. We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests
Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera Leica Microsystems GmbH. We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests
Magnesium-sulphate (MgSO4) Reanal Laborvegyszer Ltd. 20342-0-27-38
mCherry filter Leica Microsystems GmbH.
Mehyl-cellulose Sigma Aldrich Ltd. 274429
Microloader pipette tip Eppendorf GmbH. 5242956003
Pasteur pipette VWR International LLC. 612-1684
Petri-dish Jet Biofil TCD000060
Potassium-chloride (KCl) Reanal Laborvegyszer Ltd. 18050-0-01-33
Sodium-chloride (NaCl) Reanal Laborvegyszer Ltd. 24640-0-01-38
Tricane-methanesulfonate (MS-222) Sigma Aldrich Ltd. E10521

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
  2. Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
  3. Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
  4. Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
  5. Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
  6. Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
  7. Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
  8. Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
  9. Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
  10. Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
  11. Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
  12. Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
  13. Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
  14. Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
  15. Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
  16. Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
  17. Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
  18. Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
  19. Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
  20. Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
  21. Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
  22. Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
  23. Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
  24. Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
  25. Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
  26. Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
  29. Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
  30. Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
  31. Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
  32. Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
  33. Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).

Tags

Экологические науки выпуск 162 эндокринные разрушающие соединения ЭДК зеараленон зеараленол биомонитор биоиндикулятор ксеноэстрогены вителлогенин
Использование Tg (Vtg1:mcherry) Эмбрионы зебры для тестирования эстрогенных эффектов эндокринных разрушающих соединений
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Csenki, Z., Horváth, Á., Bock,… More

Csenki, Z., Horváth, Á., Bock, I., Garai, E., Kerekes, F., Vásárhelyi, E., Kovács, B., Urbányi, B., Mueller, F., Bakos, K. Using Tg(Vtg1:mcherry) Zebrafish Embryos to Test the Estrogenic Effects of Endocrine Disrupting Compounds. J. Vis. Exp. (162), e60462, doi:10.3791/60462 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter