Summary
Til stede her er en detaljeret protokol for brugen af zebrafisk embryoner Tg (vtg1: mCherry) til påvisning af østrogene effekter. Protokollen dækker formering af fisk og behandling af embryoner, og understreger detektion, dokumentation, og evaluering af fluorescerende signaler induceret af hormonforstyrrende stoffer (EDC).
Abstract
Der er mange hormonforstyrrende forbindelser (EDC) i miljøet, især østrogene stoffer. Detektionen af disse stoffer er vanskelig på grund af deres kemiske mangfoldighed. derfor anvendes stadig mere effektdetekterende metoder, såsom østrogene effektfølsomme biomonitor/bioindicator organismer. Disse bioovervågning organismer omfatter flere fisk modeller. Denne protokol omfatter anvendelse af transgene linje Tg(vtg1: mCherry) som bioovervågningsorganisme, herunder formering af fisk og behandling af embryoner, med vægt på påvisning, dokumentation og vurdering af fluorescerende signaler fremkaldt af EDC. Målet med arbejdet er demonstration af brugen af Tg (vtg1: mCherry) transgene linje embryoner til at opdage østrogene effekter. Dette arbejde dokumenterer brugen af transgene zebrafisk embryoner Tg(vtg1: mCherry) til påvisning af østrogene effekter ved at teste to østrogene stoffer, α- og β-zearalenol. Den beskrevne protokol er kun et grundlag for at designe analyser; testmetoden kan varieres alt efter testendepunkterne og prøverne. Desuden kan det kombineres med andre analysemetoder, hvilket letter den fremtidige anvendelse af den transgene linje.
Introduction
Der er et betydeligt antal hormonforstyrrende stoffer (EDC), der er blandt de farligste stoffer i vores miljø. Disse er hovedsageligt østrogene forbindelser, der forurener vand fra naturressourcer. Den kemiske mangfoldighed af de stoffer, der tilhører gruppen, gør det vanskeligt at teste for deres tilstedeværelse, da der er behov for forskellige analysemetoder til påvisning ning af dem. Baseret på deres kemiske struktur er det meget vanskeligt at afgøre, om et stof rent faktisk er i stand til at fungere som en østrogen. Desuden er disse stoffer aldrig til stede i en ren form i miljøet, så deres virkninger kan blive påvirket af andre forbindelser, for1. Dette problem kan løses ved effekt-afsløre metoder, såsom brug af biomonitor / bioindikatororganismer,der viser østrogene effekter2,3,4,5.
For nylig, en række celle linje6 og gær-baserede testsystemer2,,3 er blevet udviklet til at opdage østrogene effekter. Men, disse er generelt kun i stand til at opdage bindingen af stoffet til østrogen receptor2,3. Desuden er de ude af stand til at modellere komplekse fysiologiske processer i organismen, eller til at opdage hormon-følsomme faser af livsstadiet; De fører således ofte til falske resultater.
Det er kendt, at visse gener reagerer følsomt på østrogen i levende organismer7. Påvisning af genprodukter ved molekylærbiologi metoder er også muligt på protein eller mRNAniveau 8,9, men normalt indebærer dyr offer. Dyreværnslovgivningen er blevet strengere, og der er en stigende efterspørgsel efter alternative testsystemer, der minimerer antallet og lidelserne hos dyr, der anvendes til forsøg eller udskiftning af dyremodellen med et andet modelsystem10. Med opdagelsen af fluorescerende proteiner og oprettelsen af biomarkørlinjer udgør transgene teknologier et godt alternativ11. Med disse linjer, aktivering af en østrogen-følsomme gen kan testes in vivo.
Blandt hvirveldyr er fiskenes potentiale i miljørisikovurderingen enestående. De tilbyder mange fordele i forhold til pattedyr modeller: at være akvatiske organismer, de er i stand til at absorbere forurenende stoffer gennem hele deres krop, producere et stort antal afkom, og nogle af deres arter er kendetegnet ved kort generation tid. Deres endokrine system og fysiologiske processer viser store ligheder med andre hvirveldyr og endda med pattedyr, herunder mennesker12.
Flere gener til påvisning af østrogene effekter i fisk er også kendt. De vigtigste er østrogen receptorer aromatase-b, choriogenin-H, og vitellogenin (vtg)7,13. For nylig, flere østrogen-producerende biosensor linjer er også blevet skabt af fisk modeller, der anvendes i laboratoriet, såsom fra zebrafisk (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Den største fordel ved zebrafisk i at skabe biosensor linjer er den gennemsigtige krop af embryoner og larver, fordi fluorescerende reporter signal kan derefter let studeres in vivo uden at ofre dyret10. Ud over dyrebeskyttelse er det også et værdifuldt træk, da det giver mulighed for at studere den samme persons reaktion på forskellige behandlingstider18.
Disse forsøg bruger en vitellogenin reporter transgene zebrafisk linje15. Den transgene konstruktion, der anvendes til udvikling af Tg(vtg1:mCherry) har en lang (3,4 kbp) naturlig vitellogenin-1 promotor. Østrogen receptor (ER) er en forstærker protein aktiveres af ligander, der er en repræsentant for steroid/nukleare receptor superfamily. ER binder sig til specifikke DNA-sekvenser kaldet østrogen respons elementer (EREs) med høj affinitet og transaktiverer genekspression som reaktion på estradiol og andre østrogene stoffer, så jo mere ERE i promotor forårsager enstærkere respons 19. Der er 17 ERE-lokaliteter i frem initiativtagerregionen for transgenetkonstruktionen Tg(vtg1:mCherry), og de forventes at efterligne udtrykket af det oprindelige vtg-gen15. Der er et kontinuerligt udtryk for det fluorescerende signal hos seksuelt modnede hunner. Hos hanner og embryo er udtrykket i leveren dog kun synligt ved behandling med østrogene stoffer (Figur 1).
Figur 1: Rødt fluorescerende signal i leveren af vtg1:mCherry transgen voksen zebrafisk og 5 dpf embryoner efter 17-ß-estradiol (E2) induktion. Hos hun- og han- og han-patienter behandlet med E2 (25 μg/l eksponeringstid:48 timer) er der tydelig kraftig fluorescens i leveren, selv gennem den pigmenterede hud. Intet fluorescerende signal er synligt hos ubehandlede hanner (A). Efter E2 induktion (50 μg/L eksponeringstid: 0-120 hkf), kan der også observeres et rødt fluorescerende signal i leveren på 5 dpf-embryoner, som ikke er synligt i kontrolembryoner (B). Mens fluorescerende signal er kontinuerligt til stede i voksne kvinder, primært mænd og embryoner af linjen er egnet til påvisning af østrogene effekter. (BF: lyse felt, mCherry: rød fluorescerende filter visning, enkelt plain billeder, Scale bar A: 5mm, skala bar B: 250 μm) Klik her for at se en større version af dette tal.
Svarende til den endogene vitellogenin, mCherry reporter er kun udtrykt i leveren. Fordi vitellogenin kun produceres i nærvær af østrogen, der er ingen fluorescerende signal i kontrollerne. Fordi udtrykket er kun i leveren, evalueringen af resultaterne er meget lettere15.
Følsomheden og anvendeligheden af denne linjes embryoner er blevet undersøgt på forskellige østrogene sammensatte blandinger og også påmiljøprøver 15,20, og i de fleste tilfælde dosis-respons relationer blev dokumenteret (Figur 2). I tilfælde af meget giftige, hovedsagelig hepatotoksiske stoffer (f.eks. zearalenon), kan der dog kun ses et meget svagt fluorescerende signal i leveren af behandlede embryoner, og det maksimale fluorescerende signal kan nås inden for et meget lille koncentrationsområde, hvilket gør det vanskeligt at etablere dosiseffektforhold20.
Figur 2: Dosis-respons diagram (A) og fluorescerende billeder (mCherry) af leveren (B) eksponeret for 17-α-ethynilestradiol (EE2), i 5 dpf vtg1:mCherry larver. Resultaterne udtrykkes som integreret tæthed, der genereres ud fra signalstyrken og størrelsen af det berørte område (±SEM, n = 60). 100% refererer til det observerede maksimum. Fluorescerende signalintensitet steg gradvist med koncentration. Skalabar = 250 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Der er flere østrogene stoffer til stede i miljøet, 17-β-estradiol (miljøkoncentration: 0,1-5,1 ng/L)21,17-α-ethynylestradiol (miljøkoncentration: 0,16-0,2 μg/L)22, zearalenon (miljøkoncentration: 0,095–0,22 μg/L)23, bisphenol-A (miljøkoncentration: 0,45–17,2 mg/l)24. Ved testning af disse stoffer i ren aktiv form ved hjælp af transgene mCherry-embryoner var de laveste koncentrationer af observeret effekt (LOEC) til fluorescerende tegndetektion 100 ng/L for 17-ß-estradiol. 1 ng/L for 17-α-ethynilestradiol, 100 ng/L for zearalenon og 1 mg/L for bisphenol-A (96-120 hkf behandling), som er meget tæt på eller inden for området af miljømæssige koncentrationeraf stofferne 15. Den Tg (vtg1:mCherry) transgene linje kan hjælpe med at opdage østrogene i spildevand prøver efter direkte eksponering. Linjen er lige så følsom som den almindeligt anvendte gær østrogen test, den bioluminiserende gær østrogen (BLYES) analyse15. Ved hjælp af denne linje er de beskyttende virkninger af beta-cyclodextriner mod zearalenon-induceret toksicitet blevet bekræftet ved hjælp af kemiskeblandinger 20.
I en nylig rapport blev in vivo-brugen af den transgene linje påvist ved hjælp af to østrogene zearalenon (ZEA) metabolitter, α- og β-zearalenol (α-ZOL og β-ZOL)25. Protokollen baseline er hensigtsmæssigt at studere de østrogene virkninger af flere forbindelser eller miljøprøver på Tg (vtg1:mCherry) embryoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreprotokollen blev godkendt i henhold til den ungarske dyrevelfærdslov, og alle undersøgelser blev afsluttet, før de behandlede personer ville være nået frem til den frie fodringsfase.
1. Embryo høst og behandling
- Der opretholdes en zebrafisk med Tg(vtg1:mCherry) ved 25,5 ± 0,5 °C, pH = 7 ± 0,2, ledningsevne mellem 525 ± 50 μS/m, iltniveau ≥80 % af mætningen og 14 timer lys og 10 timer mørk cyklus.
- Fyld parringstankene med systemvand og opsæt fisken til parring om eftermiddagen, før æg høstes.
- Placer den mandlige og kvindelige fisk i tanken og adskille dem ved hjælp af en divider.
- Fjern skillelinjen fra tankene, når lyset tændes næste morgen. Kontroller parringstankene for æg hver 15-20 min.
- Alle embryoner høstes ved hjælp af en tesyr eller tæt vævet finmasket maske, og kombiner dem i en stor petriskål med E3-buffer (5 mM natriumchlorid, 0,17 mm kaliumchlorid, 0,33 mM calciumchlorid, 0,33 mM magnesiumsulfat) eller klart systemvand.
- Embryonerne hældes i inkubatoren til 25,5 ± 0,5 °C.
- Efter 1-1,5 time fjernes og kasseres æg, der ikke er tilsået eller ikke er tilstrækkeligt delt, med et plastoverførselsrør under et dissekeret mikroskop.
BEMÆRK: Ubefrugtede æg er uigennemsigtige; befrugtede æg er gennemsigtige. For at starte behandlingen i et senere udviklingstrin skal du være opmærksom på den normale udvikling af de personer, der behandles. - De udvalgte embryoner placeres i behandlingsbeholderne (f.eks. i petriskåle eller vævskulturplader), der allerede er mærket og fyldt med forskellige koncentrationer af teststoffet.
- Embryonerne inkuberes ved 25,5 ± 0,5 °C indtil forsøgets afslutning.
BEMÆRK: Embryoner kan reagere med betydelig individuel følsomhed over for forskellige østrogene forbindelser, så det anbefales at bruge mindst 15 embryoner i mindst tre gentagne behandlinger for at evaluere forsøget korrekt. Når du vælger beholderen, skal du være opmærksom på, at udviklingen af et embryon kræver mindst 200 μL vand26. I dette forsøg blev embryonerne inkuberet indtil 120 hkf ved 25,5 ± 0,5 °C. - Testopløsningen opdateres, hvis det er nødvendigt at opretholde behandlingskoncentrationen. Vær forsigtig, når du ændrer testopløsningen for at undgå at beskadige embryonerne.
BEMÆRK: Det er også muligt at undersøge dødelighed eller sublettale symptomer under forsøget. De anvendte koncentrationer bør forblive så stabile som muligt for at opnå pålidelige resultater. Dette kan nemt opnås ved at opdatere testløsningerne. Hyppigheden af forfriskende kan variere afhængigt af teststoffet. Det tilrådes derfor at kontrollere koncentrationen af teststoffet ved hjælp af analytiske målinger for at bestemme hyppigheden af opløsningsopdateringerne.
2. Larver forberedelse til fotografering
- Forbered 4% methylcellulose med MS-222 (tricain-metan-sulfonat) på forhånd.
- For at gøre dette, tilsættes 4 mg/ml MS-222 til 100 ml dobbelt destilleret vand til en endelig koncentration på 0,168 mg/ml, og opløsningen bringes til 4 °C. Derefter tilsættes 4 g methylcellulose. Rør det med en magnetomrører, og lad det derefter blive ved 4 °C natten over.
- Næste dag, rør det igen, og opløsningen skal være klar til brug. Hvis methylcellulose ikke er helt opløst sætte det tilbage på 4 °C og vente et par timer mere.
- Placer 5 dage gamle larver i en 5 cm petriskål pr behandlingsgruppe med en Pasteur pipette.
- Rens behandlingsopløsningen fra larverne med en plastpipette, og fyld derefter petriskålen med 2 ml 0,02% MS-222 bedøvelsesmiddelopløsning.
BEMÆRK: Anæstesi er normalt effektiv på mindre end et minut. Larverne er anesthetized hvis de ikke svømmer væk som reaktion på berøring. En overdosis af MS-222 kan dræbe larverne. - Fyld hver firkant af en specielt designet 10 cm petriskål med 4% methylcellulose med MS-222 (Figur 3).
BEMÆRK: Lim to 1,5 x 1,5 cm firkantede områder i bunden af petriskålen ved hjælp af plastplader (1 mm højde, 5 mm bred). Tyve larver kan placeres ved siden af hinanden i en firkant. I stedet for en specielt designet petriskål, kan en anden lav kant beholder bruges til at fastsætte placeringen af embryoner.
Figur 3: En 10 cm petriskål med limet 1,5 x 1,5 cm bred, 1 mm tykke plastplader firkanter til larver forberedelse til fotografering. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Overfør de anesthetiserede larver til methylcellulose med lidt vand i en af de to firkanter. Fra det første torv overfører larverne til det andet felt.
BEMÆRK: Ved hjælp af denne overførsel vil den 4% methylcellulose, der anvendes til fotografering, ikke blive fortyndet, og larverne roterer ikke under billeddannelse. - I den anden firkant, rotere og orientere larver til deres venstre side og forsigtigt trykke dem ned til bunden af cellulose med en microloader pipette spids skåret op til 2 cm.
BEMÆRK: Brug ikke andre pipettespidser, da de forårsager skade på larverne.
3. Mikroskopi
BEMÆRK: Fotografering dræber ikke dyrene. Dyr kan vækkes ved at fjerne dem fra methylcellulose og placere dem i ferskvand vand eller behandling løsning, så den samme person kan undersøges flere gange under behandlingen.
- For at evaluere signalet fra den udtrykte reporter, billede embryonerne med samme visning og indstillinger.
BEMÆRK: Se trin 2.6 for optimal placering af embryoner. Billederne i manuskriptet er taget under de beskrevne betingelser. Bright felt: 60x forstørrelse, 6 ms exposition, Iris 100%, Gain:1.1, fluorescens fotos: 60x forstørrelse, 300 ms redegørelse, Iris: 100%, Gain:1, mCherry filter, fluorescerende lyskilde: kviksølv metal halogenid pære. Til foto tage en fluorescerende stereomikroskop, dedikeret kamera, og software til mikroskop blev brugt. - Placer petriskålen på scenen af mikroskopet.
- Fokus på leveren af fosteret og fange et lyst felt billede ved hjælp af den tilhørende software.
- Skift mikroskopet til mCherry filteret og tage et fluorescerende billede af leveren under fluorescerende lys ved hjælp af den tilhørende software.
BEMÆRK: Udfør alle fluorescenstrin i mørke. Du må ikke ændre forstørrelsen, fokus eller embryonets position mellem optagelse af det lyse felt og de fluorescerende billeder, da dette vil hjælpe med analysen af billederne. - Trin 3.3 og 3.4 gentages, indtil alle embryonerne i forsøget er afbildet.
4. Bestemmelse af integreret tæthed
BEMÆRK: En af de bedste indikatorer til sammenligning af fluorescerende signalstyrke er den integrerede tæthedsværdi (dvs. produktet af området og den gennemsnitlige grå værdi). En af de nemmeste måder at bestemme integreret tæthed er at bruge ImageJ program27. Programmet er tilgængeligt på internettet og kan installeres på computeren.
- Open ImageJ derefter uploade fluorescerende billede, der skal analyseres ved enten at trække og slippe billedet eller klikke på Fil | Åbn.
- Klik på Billede| Farve| Opdel kanaler for at opdele billedet, der er oprettet af lysstoffilteret i henhold til RGB-farvediagrammet.
- Arbejd med det røde kanalbilledespektrum, og luk de andre kanaler.
- Angiv et elliptisk område i samme størrelse i billedet, så falske signaler ikke forstyrrer evalueringen. Brug de ovale værktøjer til at tegne en ellipse over det fremhævede leverområde så præcist som muligt.
- Hvis signalet er svagt bruge lys mikroskopi billeder (dvs. det lyse felt par af fluorescerende billede) til at bestemme placeringen af leveren.
- Klik på Analysér| Mål for at bestemme signalstyrken og størrelsen af det berørte område. Den integrerede tæthedsværdi beregnes automatisk af softwaren (IntDen-kolonne i diagrammet).
- Fortsæt analysen ved at gentage trin 4.1-4.6, indtil alle fluorescerende billeder af alle embryoner i behandlingsgruppen er analyseret.
- Gem dataene, og analysér derefter de integrerede tæthedsværdier.
BEMÆRK: Vælg altid den samme områdestørrelse i billederne under analysen. Størrelsen af det område, der skal analyseres, afhænger af forstørrelse, billedopløsning, andre indstillinger for optagelse osv. Analysen kan fremskyndes eller gøres mere præcis ved hjælp af personlige makroer til analyse. Makroer kan f.eks. Detaljerede beskrivelser til oprettelse af makroer, der giver mulighed for den bedste billedanalyse i henhold til bestemte fotoindstillinger, findes på ImageJ-webstedet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I det eksperiment, der præsenteres i dette manuskript, blev virkningerne af to østrogene stoffer testet ved fem koncentrationer, der startede ved befrugtning i 5 dage på Tg(vtg1:mCherry) zebrafiskembryoner. Vi undersøgte, om fluorescerende signaler dukkede op i leveren af fisk ved udgangen af eksponeringstiden på grund af stofferne, og om der var forskelle i østrogenicitet af de to stoffer. Resultaterne blev evalueret på grundlag af fluorescerende billeder og integrerede tæthedsværdier. Generelt fremkaldte begge stoffer transgenets udtryk ved afslutningen af eksponeringstiden ved de testkoncentrationer, hvor individer overlevede. I tilfælde af ubehandlede kontrolfisk var der ikke noget fluorescerende signal synligt.
I tilfælde af α-ZOL døde alle individer ved den højeste testkoncentration (8 μM), så i dette tilfælde kunne fluorescerende signal ikke undersøges. Ved lavere koncentrationer (0,5 μM–4 μM) blev der observeret et stærkt fluorescerende signal i embryornes lever (figur 4A). Der blev ikke observeret nogen signifikant forskel i fluorescensintensiteten og størrelsen af fluorescerende områder (p < 0,05). Α-ZOL-integrerede masseværdier (figur 4C) viser, at stoffet fremkaldte et fluorescerende signals udseende. Der blev ikke fundet nogen signifikant forskel mellem de integrerede tæthedsværdier og mellem behandlinger (p < 0,05). Den gennemsnitlige integrerede masseitet varierede mellem 31,26 ± 13,95 (0,5 μM) og 34,25 ± 15,36 (4 μM).
Ingen dødelighed blev dokumenteret under behandlingen med β-ZOL, og stoffet induceret transgene aktivitet ved alle behandlingskoncentrationer. Fluorescensintensiteten og størrelsen af fluorescerende område steg i det stigende antal fluorescerende områder, efterhånden som koncentrationen steg, som det ses i de fluorescerende billeder (figur 4B). Ved at sammenligne fluorescerende billeder af α- og β-ZOL visuelt var både signalstyrken og størrelsen af fluorescerende område synligt svagere for β-ZOL ved de samme behandlingskoncentrationer af de to stoffer. Undersøgelse af de integrerede værdier af β-ZOL (Figur 4D), den gennemsnitlige integrerede densitetsværdi næsten fordoblet mellem de laveste og de højeste behandlingskoncentrationer. For β-ZOL's tilfælde var der imidlertid ingen signifikant forskel mellem de integrerede masseitetsværdier for de enkelte koncentrationer (p < 0,05). Den gennemsnitlige integrerede masseitet varierede mellem 15,86 ± 4,08 (0,5 μM) og 21,73 ± 5,94 (8 μM).
Figur 4: Præsentation af integrerede tæthedsværdier, der er afledt af intensiteten af fluorescerende signaler i leveren og af størrelsen af det berørte område forårsaget af α- og β-zearalenolbehandling den 5 dage gamle Tg(vtg1:mCherry) transgene zebrafiskembryoner. I forsøget blev østrogenfølsomme embryoner i biomarkør zebrafisklinjen (20 larver pr. grupper i tre replikater i hver behandlingskoncentration) behandlet med 0,5 μM–8 μM koncentrationer af α- og β-ZOL fra befrugtning og fremefter i 5 dage. Billeder af fiskelever for α-ZOL (A) og β-ZOL (B) viser tydeligt, at stofferne fremkaldte fluorescerende signals udseende. Integrerede tæthedsdata præsenteres som middel ± standardafvigelse (SD = fejllinje). Data blev analyseret med det iterative Grubbs ' for at identificere afvigende værdier, som blev udelukket. Der blev kontrolleret data for normalitet med normalitetstesten i Shapiro-Wilk, og det blev fastslået, at kravene til parametriske metoder var opfyldt. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af en envejs ANOVA fulgte en Dunnetts test. Ved at undersøge de integrerede masseitetsværdier blev der ikke fundet nogen signifikant forskel mellem behandlingerne i tilfælde af α-ZOL (C) og β-ZOL (D) (p < 0,05). Skalabar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Ved at undersøge de integrerede tæthedsværdier, der opnås ved de samme behandlingskoncentrationer af de to stoffer (figur 5),præsenterede α-ZOL højere integrerede tæthedsgennemsnit i hvert enkelt tilfælde i forhold til β-ZOL, hvilket er i overensstemmelse med forskellene mellem de signalstyrker, der er observeret i de fluorescerende billeder. I tilfælde af alle behandlingskoncentrationer blev der fundet signifikante forskelle (0,5 μM, p = 0,0011; 1 μM, p = 0,0003; 2 μM, p = 0,0329 og 4 μM, p = 0,0325).
Figur 5: Sammenligning af α- og β-zearalenol-integrerede tæthedsværdier. Integrerede tæthedsdata præsenteres som middel ± standardafvigelse SD = fejllinje. Data blev analyseret med iterative Grubbs 'at identificere outliers, som blev udelukket. Der blev kontrolleret data for normalitet med normalitetstesten i Shapiro-Wilk, og det blev fastslået, at kravene til parametriske metoder var opfyldt. Signifikante forskelle blev kontrolleret med en ikke-parret t-test mellem α-ZOL og β-ZOL for hver koncentration (0,5 μM, p = 0,0011; 1 μM, p = 0,0003; 2 μM, p = 0,0329; og 4 μM, p = 0,0325). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brugen af biomonitorer /bioindikatorer for østrogene effekter har spredt sig i toksikologiske undersøgelser. In vivo modeller spiller en fremragende rolle, fordi i modsætning til in vitro-test, de ikke kun give oplysninger om reaktionen af en celle eller en receptor, men også tillade undersøgelse af komplekse processer i organismen. Flere transgene linjer til at studere østrogene effekter er blevet produceret af zebrafisk, hvoraf den ene Tg (vtg1:mCherry) blev brugt til disse undersøgelser. Den metode, der er beskrevet her illustrerer en protokol til test af embryoner af denne linje for at opdage østrogen aktivitet in vivo i rene, aktive ingredienser.
Hanner og embryoner af linjen er også velegnet til påvisning af østrogene effekter, men embryoner har flere fordele, der fremmer deres anvendelighed. Især kroppen er gennemsigtig, så fluorescerende signal i leveren kan nemt observeres. Zebrafiskleveren begynder at udvikle sig 6 timer efter befrugtningen (6 hk) og begynder at arbejde efter 50 timer (50 hkf). Først dannes den venstre lap af leveren, og ved 96 timer (96 hkf) vises også den højre lap af leveren. Leverens endelige form er udviklet omkring dag 5 (120 hkf)28,29. Leveren er i stand til at producere endogent vitellogenin fra en alder af 2-3 dage af et foster14, hvilket falder sammen med udseendet af fluorescerende signal i Tg(vtg1:mCherry) linje15. Når der udformes forsøg, bør det derfor tages i betragtning, at der kun kan forventes et fluorescerende signal i fosterleverne fra det tidspunkt. Leveren af de 5 dage gamle embryoner er allerede veldefineret i et relativt stort område, hvor det fluorescerende signal let kan detekteres under et stereomikroskop. Dette gør det muligt at udvikle testprotokoller, der ikke er underlagt dyrebeskyttelseslovgivningen. Vitellogenin, og ligeledes fluorescerende protein, produceres af den venstre lap afembryonerleverne 15. Derfor er embryoners rumlige orientering vigtig for detektion af det stærkeste signal, når man undersøger fluorescerende signal eller tager billeder. Derfor blev embryoner lagt til venstre i protokollen. Som det fremgår af de repræsentative resultater, den østrogene effekt af en testprøve er tydeligt angivet ved fluorescerende signal i leveren, så resultaterne kan evalueres visuelt også. Hvis der er behov for kvantificering af resultaterne, er den integrerede tæthedsværdi, der er defineret af ImageJ-programmet, passende. Men for korrekt evaluering er det absolut nødvendigt, at billeder tages med de samme indstillinger under eksperimentet, og at størrelsen af de fremhævede fluorescerende områder er den samme i hvert billede. Sammen med den præcise positionering af embryonerne er disse de mest kritiske trin i protokollen. Det er vigtigt at nævne, at for embryoners skyld viser transgenets ekspression på samme måde som produktionen af endogent vitellogenin en stor spredning og forskelle i individuel følsomhed. I nogle tilfælde kan dette forårsage store variationer i resultaterne, som bør tages i betragtning ved udformningen af forsøgene.
Et vigtigt aspekt ved bestemmelse af behandlingskoncentrationer er, at embryonernes celler og dermed levercellerne kan blive beskadiget af høje koncentrationer af meget giftige stoffer, hvilket kan føre til et fald i vitellogenin induktion. Derfor bør der udføres test ved koncentrationer under LC1015.
Sammenligning af følsomheden af østrogen-følsomme fisk linjer til hinanden er en vanskelig opgave, fordi de linjer, der er beskrevet hidtil er blevet testet i henhold til forskelligeprotokoller 5,14,15,16. Den linje, der testes i denne protokol, er i stand til at påvise dosis-effekt relationer i tilfælde af rene aktive ingredienser, blandinger, og miljømæssige prøver, og de opnåede resultater korreleret godt med resultater med BLYES test og HeLa celler15,20.
Nytten af embryonerne i linjen til testmidler er blevet bevist, herunder zearalenon15. I dette arbejde blev to metabolitter af toksinet, α- og β-zearalenol, testet. Ifølge litteratur data, α-ZOL er mere giftigt end β-ZOL30 og dens østrogene er også højere31. Disse resultater bekræftes af vores undersøgelser. Således, undersøgelser af embryoner af linjen er også velegnet til at sammenligne de østrogene virkninger af andre østrogene stoffer.
Mykotoksinforurening i fødekæden er et globalt problem, så flere procedurer er blevet forbedret for at reducere mykotoksinindholdet i dyrefoder og fødevarer25,32. En af de mest lovende løsninger er mykotoksin bionedbrydning af mikroorganismer eller af deres enzymer. Det kan være en væsentlig postharvest metode til at mindske eller fjerne mykotoksin dekontaminering. Den ZEA nedværdigende evne af mange bakteriestammer er blevet testet i litteraturen hidtil, dog, nyere forskningsresultater, der viser høj nedbrydning af toksinet sjældent angive den negative virkning af metabolitter33. Fordi embryoner af denne linje er teoretisk egnet til at teste de østrogene virkninger af prøver med organisk stofindhold 15, en behandling protokol kan udvikles, der kan hjælpe med at teste bionedbrydning produkter af ZEA og kvalifikation af de nedbrydende stammer.
Denne protokol kan ændres på mange måder i henhold til de planlagte testendepunkter (f.eks. eksponeringsdesæt og længde) og til de prøver (f.eks. blandinger eller miljøprøver), der skal testes og kan suppleres med andre testmetoder (f.eks. molekylære metoder). Således håber vi, at brugen af Tg (vtg1:mCherry) linje vil blive en model af østrogenetest og for standard testmetoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Det Nationale Forsknings-, Udviklings- og Innovationskontor (NKFIH) fra Den Nationale Forsknings-, Udviklings- og Innovationsfond (NKFIA); Tilskudsaftale: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008-projekt, der samfinansieres af Den Europæiske Union, og det tematiske ekspertiseprogram NKFIH-831-10/2019 fra Szent István University, tildelt af Ministeriet for Innovation og Teknologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
References
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
- Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
- Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
- Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
- Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
- Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
- Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
- Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
- Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
- Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
- Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
- Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
- Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
- Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
- Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
- Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
- Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
- Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
- Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
- Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
- Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).
