Summary
Presente aquí es un protocolo detallado para el uso de embriones de pez cebra Tg(vtg1: mCherry) para la detección de efectos estrogénicos. El protocolo abarca la propagación de los peces y el tratamiento de embriones, y hace hincapié en la detección, documentación y evaluación de señales fluorescentes inducidas por compuestos disruptores endocrinos (EDC).
Abstract
Hay muchos compuestos disruptores endocrinos (EDC) en el medio ambiente, especialmente sustancias estrogénicas. La detección de estas sustancias es difícil debido a su diversidad química; por lo tanto, se utilizan cada vez más métodos de detección de efectos, como los organismos biomonitor/bioindicador sensibles al efecto estrogénico. Estos organismos biomonitores incluyen varios modelos de peces. Este protocolo abarca el uso de la línea transgénica Tg(vtg1: mCherry) de peces cebra como organismo biomonitorio, incluida la propagación de peces y el tratamiento de embriones, con énfasis en la detección, documentación y evaluación de señales fluorescentes inducidas por la EDC. El objetivo del trabajo es la demostración del uso de los embriones de línea transgénica Tg(vtg1: mCherry) para detectar efectos estrogénicos. Este trabajo documenta el uso de embriones transgénicos de pez cebra Tg(vtg1: mCherry) para la detección de efectos estrogénicos mediante la prueba de dos sustancias estrogénicas, el zearalenol. El protocolo descrito es sólo una base para diseñar ensayos; el método de prueba puede variar según los puntos finales de prueba y las muestras. Además, puede combinarse con otros métodos de ensayo, facilitando así el uso futuro de la línea transgénica.
Introduction
Hay un número significativo de compuestos disruptores endocrinos (EDC) que se encuentran entre las sustancias más peligrosas en nuestro medio ambiente. Estos son principalmente compuestos estrogénicos que contaminan el agua de los recursos naturales. La diversidad química de las sustancias pertenecientes al grupo dificulta las pruebas de su presencia, ya que se requieren diferentes métodos analíticos para su detección. Basado en su estructura química es muy difícil determinar si una sustancia es realmente capaz de actuar como un estrógeno. Además, estas sustancias nunca están presentes en forma pura en el medio ambiente, por lo que sus efectos pueden verse afectados por otros compuestos, demasiado1. Este problema se puede resolver mediante métodos de detección de efectos, como el uso de biomonitor/bioindicador organismos que muestran efectos estrogénicos2,3,4,5.
Recientemente, una variedad de línea celular6 y sistemas de prueba basados en levadura2,3 se han desarrollado para detectar efectos estrogénicos. Sin embargo, estos son generalmente sólo capaces de detectar la unión de la sustancia al receptor de estrógeno2,3. Además, son incapaces de modelar procesos fisiológicos complejos en el organismo, o para detectar fases sensibles a las hormonas de las etapas de la vida; por lo tanto, a menudo conducen a resultados falsos.
Se sabe que ciertos genes reaccionan sensiblemente al estrógeno en organismos vivos7. La detección de productos genéticos por métodos de biología molecular también es posible en el nivel de proteína o ARNm8,9, pero por lo general implica sacrificio animal. Las leyes de protección animal se han vuelto más estrictas, y existe una creciente demanda de sistemas de ensayo alternativos que minimicen el número y el sufrimiento de los animales utilizados en experimentos o la sustitución del modelo animal por otro modelo10. Con el descubrimiento de proteínas fluorescentes y la creación de líneas de biomarcadores, las tecnologías transgénicas proporcionan una buena alternativa11. Con estas líneas, la activación de un gen sensible al estrógeno se puede probar in vivo.
Entre los vertebrados, el potencial de los peces en la evaluación del riesgo ambiental es excepcional. Ofrecen muchas ventajas sobre los modelos de mamíferos: al ser organismos acuáticos, son capaces de absorber contaminantes a través de todo su cuerpo, producir un gran número de crías, y algunas de sus especies se caracterizan por un corto tiempo de generación. Su sistema endocrino y procesos fisiológicos muestran grandes similitudes con otros vertebrados e incluso con mamíferos, incluidos los humanos12.
También se conocen varios genes para la detección de efectos estrogénicos en peces. Los más importantes son los receptores de estrógeno aromatasa-b, coriogenina-H, y vitellogenina (vtg)7,13. Recientemente, varias líneas de biosensores productores de estrógenos también se han creado a partir de modelos de peces utilizados en el laboratorio, como de pez cebra (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. La principal ventaja del pez cebra en la creación de líneas de biosensor es el cuerpo transparente de los embriones y larvas, ya que la señal de reportero fluorescente puede entonces ser fácilmente estudiada in vivo sin sacrificar al animal10. Además de la protección animal, también es una característica valiosa ya que permite estudiar la reacción del mismo individuo en diferentes momentos del tratamiento18.
Estos experimentos utilizan un reportero de vitellogenin linótez de la línea15. La construcción transgene utilizada para el desarrollo de Tg(vtg1:mCherry) tiene un largo (3,4 kbp) promotor natural vitellogenin-1. El receptor de estrógeno (ER) es una proteína potenciadora activada por ligandos que es un representante de la superfamilia de los receptores de esteroides /nuclear. ER se une a secuencias de ADN específicas llamadas elementos de respuesta de estrógeno (EERE) con alta afinidad y transactiva la expresión génica en respuesta al estradiol y otras sustancias estrogénicas, por lo que cuanto más ERE en el promotor causa una respuesta más fuerte19. Hay 17 sitios ERE en la región promotora de la construcción transgén de Tg(vtg1:mCherry) y se espera que imitan la expresión del gen vtg nativo15. Hay una expresión continua de la señal fluorescente en hembras maduradas sexualmente. Sin embargo, en varones y embriones la expresión en el hígado sólo es visible en el tratamiento con sustancias estrogénicas (Figura 1).
Figura 1: Señal fluorescente roja en el hígado de vg1:mCherry transgenic adult zebrafish y 5 dpf embryos, después de 17-estradiol (E2) inducción. En hembras y en hombres tratados con E2 (25 g/L de tiempo de exposición:48hrs) la fuerte fluorescencia del hígado es visible incluso a través de la piel pigmentada. No se puede ver ninguna señal fluorescente en los machos no tratados (A). Después de la inducción de E2 (50 g/L de tiempo de exposición: 0-120 hpf), también se puede observar una señal fluorescente roja en el hígado de embriones de 5 dpf, que no es visible en los embriones de control (B). Mientras que la señal fluorescente está continuamente presente en las hembras adultas, principalmente los machos y embriones de la línea son adecuados para detectar efectos estrogénicos. (BF: campo brillante, mCherry: vista de filtro fluorescente rojo, imágenes simples, barra de escala A: 5 mm, barra de escala B: 250 m) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Al igual que la vitellogenina endógena, el reportero de mCherry sólo se expresa en el hígado. Debido a que la vitellogenina sólo se produce en presencia de estrógeno, no hay señal fluorescente en los controles. Debido a que la expresión está sólo en el hígado, la evaluación de los resultados es mucho más fácil15.
La sensibilidad y usabilidad de los embriones de esta línea se han investigado en diversas mezclas de compuestos estrogénicos y también en muestras ambientales15,20, y en la mayoría de los casos se documentaron las relaciones dosis-respuesta ( Figura2). Sin embargo, en el caso de sustancias altamente tóxicas, principalmente hepatotóxicas ,por ejemplo, zearalenona), sólo una señal fluorescente muy débil puede ser visible en el hígado de embriones tratados y la señal fluorescente de intensidad máxima causada puede alcanzarse dentro de un rango de concentración muy pequeño, lo que dificulta el establecimiento de relaciones dosis-efecto20.
Figura 2: Diagrama de dosis-respuesta (A) e imágenes fluorescentes (mCherry) del hígado (B) expuestos a 17-etilestradiol (EE2), en 5 dpf vtg1:mCherry larvas. Los resultados se expresan como densidad integrada generada a partir de la intensidad de la señal y el tamaño de la zona afectada (-SEM, n a 60). 100% se refiere al máximo observado. La intensidad de la señal fluorescente aumentó gradualmente con la concentración. Barra de escala de 250 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Hay varias sustancias estrogénicas presentes en el medio ambiente, tales como 17-í-estradiol (concentración ambiental: 0,1–5,1 ng/L)21, 17-etilestradiol (concentración ambiental: 0,16–0,2 g/L)22, zearalenona (concentración ambiental: 0,095–0,22 g/L)23, bisfenol-A (concentración ambiental: 0,45–17,2 mg/L)24. Al probar estas sustancias en forma activa pura con la ayuda de embriones transgénicos mCherry, las concentraciones de efecto observadas más bajas (LOEC) para la detección de signos fluorescentes fueron 100 ng/L para 17-és-estradiol, 1 ng/L para 17-etilestradiol, 100 ng/L para zearalenona y 1 mg/L para el tratamiento con bisfenol-A (96–120 hpf), que está muy cerca o dentro del rango de concentraciones ambientales de las sustancias15. La línea transgénica Tg(vtg1:mCherry) puede ayudar a detectar la estrofica en muestras de aguas residuales después de la exposición directa. La línea es tan sensible como la prueba de estrógeno de levadura de uso común, el ensayo de estrógeno de levadura bioluminiscente (BLYES)15. Con la ayuda de esta línea, se han confirmado los efectos protectores de las beta-ciclodextrinas contra la toxicidad inducida por zearalenona utilizando mezclas químicas20.
En un informe reciente, el uso in vivo de la línea transgénica se demostró con la ayuda de dos metabolitos estrogénicos de zearalenona (ZEA), los anudalenol de los ácidos (ZEA) y los a-zearalenol (a-ZOL y a-ZOL)25. La línea de base del protocolo es apropiada para estudiar los efectos estrogénicos de varios compuestos o muestras ambientales en embriones Tg(vtg1:mCherry).
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Protocol
El Protocolo de los Animales fue aprobado en virtud de la Ley Húngara de Bienestar Animal y todos los estudios se completaron antes de que los individuos tratados hubieran llegado a la etapa de alimentación libre.
1. Cosecha y tratamiento de embriones
- Mantener el pez cebra Tg(vtg1:mCherry) a 25,5 a 0,5 oC, pH a 7 a 0,2, conductividad entre 525 s/m, nivel de oxígeno al 80 % de saturación y 14 horas de luz y 10 h de ciclo de oscuridad.
- Llene los tanques de apareamiento con agua del sistema y configure el pescado para aparearse la tarde antes de cosechar los huevos.
- Coloque el pez macho y hembra en el tanque y sepárelos con la ayuda de un divisor.
- Retire el divisor de los tanques mientras la luz se enciende a la mañana siguiente. Revise los tanques de apareamiento en busca de huevos cada 15-20 min.
- Cosecha todos los embriones usando un colador de té o una malla fina densamente tejida y combínalos en una placa grande de Petri con tampón E3 (cloruro de sodio de 5 mM, cloruro de potasio de 0,17 mM, cloruro de calcio de 0,33 mM, sulfato de magnesio de 0,33 mM) o agua clara del sistema.
- Colocar los embriones en la incubadora establecido en 25,5 a 0,5 oC.
- Después de 1–1.5 h, retire y deseche los huevos no fertilizados o que dividan inadecuadamente con una tubería de transferencia de plástico bajo un microscopio diseccionado.
NOTA: Los huevos no fertilizados son opacos; los óvulos fertilizados son transparentes. Para iniciar el tratamiento en una etapa posterior de desarrollo, preste atención al desarrollo normal de las personas que están siendo tratadas. - Coloque los embriones seleccionados en los recipientes de tratamiento (por ejemplo, en platos petri o placas de cultivo de tejidos) que ya hayan sido etiquetados y llenos de diferentes concentraciones de la sustancia de ensayo.
- Incubar los embriones a 25,5 oC a 0,5 oC hasta el final del experimento.
NOTA: Los embriones pueden reaccionar con una sensibilidad individual significativa a varios compuestos estrogénicos, por lo que se recomienda utilizar al menos 15 embriones en al menos tres tratamientos repetidos para evaluar el experimento correctamente. Al seleccionar el recipiente, tenga en cuenta que el desarrollo de un embrión requiere al menos 200 l de agua26. En este experimento, los embriones se incubaron hasta 120 cvf a 25,5 a 0,5 oC. - Actualice la solución de prueba si es necesario mantener la concentración del tratamiento. Tenga cuidado al cambiar la solución de prueba para evitar dañar los embriones.
NOTA: También es posible investigar la mortalidad o los síntomas subletales durante el experimento. Las concentraciones utilizadas deben permanecer lo más estables posible para obtener resultados fiables. Esto se puede lograr fácilmente actualizando las soluciones de prueba. La frecuencia de actualización puede variar dependiendo de la sustancia de ensayo. Por lo tanto, es aconsejable comprobar la concentración de la sustancia de ensayo mediante mediciones analíticas para determinar la frecuencia de las actualizaciones de la solución.
2. Preparación de larvas para la fotografía
- Preparar 4% metilcelulosa con MS-222 (tricaine-mena-sulfonato) de antemano.
- Para ello, añadir 4 mg/ml de MS-222 a 100 ml de agua destilada doble a una concentración final de 0,168 mg/ml, y llevar la solución a 4 oC. A continuación, agregue 4 g de metilcelulosa. Revuelva con un agitador magnético, luego déjelo en 4 oC durante la noche.
- Al día siguiente, revuelva de nuevo y la solución debe estar lista para usar. Si la metilcelulosa no se disuelve por completo, vuelve a colocarla a 4oC y espera unas horas más.
- Coloque larvas de 5 días de edad en un plato Petri de 5 cm por grupo de tratamiento con una pipeta Pasteur.
- Retire la solución de tratamiento de las larvas con una pipeta de plástico, luego llene el plato Petri con 2 ml de solución anestésica 0.02% MS-222.
NOTA: La anestesia suele ser eficaz en menos de un minuto. Las larvas son anestesiadas si no nadan en respuesta al tacto. Una sobredosis de MS-222 puede matar a las larvas. - Llene cada cuadrado de un plato Petri de 10 cm especialmente diseñado con 4% de metilcelulosa con MS-222 (Figura 3).
NOTA: Pegue dos áreas cuadradas de 1,5 x 1,5 cm en la parte inferior del plato Petri utilizando láminas de plástico (1 mm de altura, 5 mm de ancho). Veinte larvas se pueden colocar una al lado de la otra en un cuadrado. En lugar de un plato Petri especialmente diseñado, se puede utilizar otro recipiente de borde bajo para fijar la posición de los embriones.
Figura 3: Un plato Petri de 10 cm con pegamento de 1,5 x 1,5 cm de ancho, cuadrados de lámina de plástico de 1 mm de espesor para la preparación de larvas para la fotografía. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Transfiera las larvas anestesiadas a metilcelulosa con un poco de agua en uno de los dos cuadrados. Desde la primera plaza transfiera las larvas a la segunda plaza.
NOTA: Con la ayuda de esta transferencia, la metilcelulosa del 4% utilizada para la fotografía no se diluirá y las larvas no rotarán durante la toma de imágenes. - En el segundo cuadrado, gire y oriente las larvas hacia su lado izquierdo y presione suavemente hacia abajo hasta el fondo de la celulosa con una punta de pipeta de microcargador cortada hasta 2 cm.
NOTA: No utilice otras puntas de pipeta porque causan lesiones en las larvas.
3. Microscopía
NOTA: La fotografía no mata a los animales. Los animales pueden ser despertados quitándolos de la metilcelulosa y colocándolos en agua fresca del sistema o solución de tratamiento, por lo que el mismo individuo puede ser examinado varias veces durante el tratamiento.
- Para evaluar la señal del reportero expresado, imagine los embriones con la misma vista y configuración.
NOTA: Consulte el paso 2.6 para un posicionamiento óptimo del embrión. Las fotos en el manuscrito fueron tomadas bajo las condiciones descritas. Campo brillante: aumento de 60x, exposición de 6 ms, iris 100%, ganancia:1.1, fotos de fluorescencia: aumento de 60x, exposición de 300 ms, iris: 100%, ganancia:1, filtro mCherry, fuente de luz fluorescente: bombilla de halogenuros de metal de mercurio. Para tomar fotos se utilizó un estereomicroscopio fluorescente, una cámara dedicada y un software para el microscopio. - Coloque el plato Petri en el escenario del microscopio.
- Concéntrese en el hígado del embrión y capture una imagen de campo brillante utilizando el software asociado.
- Cambie el microscopio al filtro mCherry y tome una imagen fluorescente del hígado bajo luz fluorescente utilizando el software asociado.
NOTA: Realice todos los pasos de fluorescencia en la oscuridad. No cambie el aumento, el enfoque o la posición del embrión entre la captura del campo brillante y las imágenes fluorescentes, ya que esto ayudará en el análisis de las imágenes. - Repita los pasos 3.3 y 3.4 hasta que se hayan evaluado todos los embriones del experimento.
4. Determinación de la densidad integrada
NOTA: Uno de los mejores indicadores para comparar la intensidad de la señal fluorescente es el valor de densidad integrado (es decir, el producto del área y el valor gris medio). Una de las formas más fáciles de determinar la densidad integrada es utilizar el programa ImageJ27. El programa está disponible en Internet y se puede instalar en el ordenador.
- Abra ImageJ y, a continuación, cargue la imagen fluorescente que se analizará arrastrando y soltando la imagen o haciendo clic en Archivo. Abrir.
- Haga clic en Imagen . . . . . . . . . . Color ? Dividir canales para dividir la imagen realizada por el filtro fluorescente según la carta de colores RGB.
- Trabaje con el espectro de imágenes del canal rojo, cierre los otros canales.
- Designe un área elíptica de tamaño similar en la imagen para que las señales falsas no interfieran con la evaluación. Con las herramientas Oval, dibuje una elipse sobre el área hepática resaltada con la mayor precisión posible.
- Si la señal es débil, utilice imágenes de microscopía de luz (es decir, el par de campos brillantes de la imagen fluorescente) para determinar la ubicación del hígado.
- Haga clic en Analizar . Medir para determinar la intensidad de la señal y el tamaño de la zona afectada. El software calcula automáticamente el valor de densidad integrado en el gráfico.
- Continúe el análisis repitiendo los pasos 4.1–4.6 hasta que se analicen todas las imágenes fluorescentes de todos los embriones del grupo de tratamiento.
- Guarde los datos y, a continuación, analice los valores de densidad integrados.
NOTA: Seleccione siempre el mismo tamaño de área en las imágenes durante el análisis. El tamaño del área a analizar depende de la ampliación, la resolución de la imagen, otros ajustes para la toma, etc. El análisis se puede acelerar o hacer más preciso mediante el uso de macros personales para el análisis. Por ejemplo, las macros se pueden utilizar para asegurarse de que el área seleccionada es siempre la misma en las imágenes examinadas. En el sitio web de ImageJ se encuentran descripciones detalladas para crear macros que permiten el mejor análisis de imágenes de acuerdo con la configuración de fotos en particular.
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Representative Results
En el experimento presentado en este manuscrito, los efectos de dos sustancias estrogénicas se probaron en cinco concentraciones comenzando en la fertilización durante 5 días en embriones de pez cebra Tg(vtg1:mCherry). Investigamos si las señales fluorescentes aparecieron en el hígado de los peces al final del tiempo de exposición debido a las sustancias y si había diferencias en la estrofia de las dos sustancias. Los resultados se evaluaron sobre la base de las imágenes fluorescentes y los valores de densidad integrados. En general, ambas sustancias indujeron la expresión del transgén al final del tiempo de exposición en aquellas concentraciones de ensayo a las que sobrevivieron los individuos. En los casos de peces de control no tratados, no se vio visible ninguna señal fluorescente.
En el caso de la o-ZOL, en la concentración de prueba más alta (8 m) todos los individuos murieron, por lo que en este caso la señal fluorescente no pudo ser examinada. A concentraciones más bajas (0,5 m–4 m), se observó una señal fluorescente fuerte en el hígado de los embriones (Figura 4A). No se observó ninguna diferencia significativa en la intensidad de fluorescencia y el tamaño de las áreas fluorescentes (p < 0.05). Los valores de densidad integrada de la serie ZOL(Figura 4C) muestran que la sustancia indujo la aparición de una señal fluorescente. No se encontró ninguna diferencia significativa entre los valores de densidad integrados y entre los tratamientos (p < 0.05). La densidad media integrada varió entre 31,26 a 13,95 (0,5 oM) y 34,25 a 15,36 (4 oM).
No se documentó mortalidad durante el tratamiento con el o-ZOL, y la sustancia indujo la actividad transgénero en todas las concentraciones de tratamiento. La intensidad de fluorescencia y el tamaño del área fluorescente aumentaron a medida que aumentaba la concentración, como se ve en las imágenes fluorescentes (Figura 4B). Comparando visualmente las imágenes fluorescentes de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los valores de los ZOL. El estudio de los valores integrados de laFigura 4D, el valor medio de densidad integrada casi se duplicó entre las concentraciones de tratamiento más bajas y las más altas. Sin embargo, en el caso de la ZOL no hubo diferencia significativa entre los valores de densidad integrados de las concentraciones individuales (p < 0,05). La densidad media integrada varió entre 15,86 a 4,08 (0,5 oM) y 21,73 a 5,94 (8 oM).
Figura 4: Presentación de valores de densidad integrados derivados de la intensidad de las señales fluorescentes en el hígado y del tamaño de la zona afectada causada por el tratamiento de zearalenol de 5 días de edad en embriones de pez cebra transgénicos Tg(vtg1:mCherry). En el experimento, los embriones sensibles al estrógeno de la línea de peces cebra biomarcadores (20 larvas por grupo en tres réplicas en cada concentración de tratamiento) fueron tratados con concentraciones de 0,5 oM–8 oM de ZOL y de ZOL a partir de la fertilización durante 5 días. Las imágenes de los hígados de los peces para los idiomasde la clase Ay de los ZOL(B)muestran claramente que las sustancias indujeron la aparición de la señal fluorescente. Los datos de densidad integrados se presentan como la media de la desviación estándar (SD - barra de error). Los datos se analizaron con los Grubbs iterativos para identificar los valores atípicos, que fueron excluidos. Se comprobó la normalidad de los datos con la prueba de normalidad Shapiro-Wilk y se estableció el cumplimiento de los requisitos de los métodos paramétricos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando un ANOVA unidireccional después de una prueba de Dunnett. El estudio de los valores de densidad integrados, no se encontró ninguna diferencia significativa entre los tratamientos en los casos de los valores de los valores de la densidad integrada(C)y de los valores de la densidad(D)(p < 0,05). Barra de escala de 200 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Mediante el examen de los valores de densidad integrados obtenidos a partir de las mismas concentraciones de tratamiento de las dos sustancias (Figura 5), el oZOL presentó mayores promedios de densidad integrados en cada caso en relación con el -ZOL, lo que es coherente con las diferencias entre las intensidades de señal observadas en las imágenes fluorescentes. En el caso de todas las concentraciones de tratamiento, se encontraron diferencias significativas (0,5 m, p a 0,0011; 1 m, p a 0,0003; 2 m, p a 0,0329; y 4 m, p a 0,0325).
Figura 5: Comparación de los valores de densidad integrada de los valores de densidad integrada de los valores de densidad integrada de los valores de densidad integrada de los valores de los valores de densidad integrada de los valores de los valores de densidad integrados de los valores de la densidad integrada de los valores de los valores de densidad integrados de los Los datos de densidad integrados se presentan como la media de la desviación estándar SD - barra de error. Los datos se analizaron con Grubbs iterativos para identificar valores atípicos, que fueron excluidos. Se comprobó la normalidad de los datos con la prueba de normalidad Shapiro-Wilk y se estableció el cumplimiento de los requisitos de los métodos paramétricos. En el caso de cada concentración se verificaron diferencias significativas con la prueba t no parís entre los o-ZOL y el ZOL en el caso de cada concentración (0,5 m, p a 0,0011; 1 m, p a 0,0003; 2 m, p a 0,0329; y a 4 m, p a 0,0325). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El uso de biomonitores/bioindicadores para efectos estrogénicos se ha propagado en estudios toxicológicos. Los modelos in vivo desempeñan un papel sobresaliente, ya que a diferencia de las pruebas in vitro, no sólo proporcionan información sobre la respuesta de una célula o un receptor, sino que también permiten la investigación de procesos complejos en el organismo. Varias líneas transgénicas para el estudio de efectos estrogénicos se han producido a partir de peces cebra, uno de los cuales Tg(vtg1:mCherry) se utilizó para estos estudios. El método descrito aquí ilustra un protocolo para la prueba de embriones de esta línea con el fin de detectar la actividad de estrógeno in vivo en ingredientes puros y activos.
Los machos y embriones de la línea también son adecuados para detectar efectos estrogénicos, pero los embriones tienen varias ventajas que promueven su usabilidad. En particular, el cuerpo es transparente, por lo que la señal fluorescente en el hígado se puede observar fácilmente. El hígado de pez cebra comienza a desarrollarse 6 horas después de la fertilización (6 cvf) y comienza a trabajar después de 50 horas (50 cvf). En primer lugar, se forma el lóbulo izquierdo del hígado, y a las 96 horas (96 cvf) también aparece el lóbulo derecho del hígado. La forma final del hígado se desarrolla alrededor del día 5 (120 hpf)28,29. El hígado es capaz de producir vitellogenina endógena a partir de la edad de 2-3 días de un embrión14, que coincide con la aparición de la señal fluorescente en la línea Tg(vtg1:mCherry) 15. Por lo tanto, al diseñar experimentos, debe tenerse en cuenta que una señal fluorescente sólo se puede esperar en el hígado embrionario de ese momento. El hígado de los embriones de 5 días de edad ya está bien definido en un área relativamente grande, donde la señal fluorescente se puede detectar fácilmente bajo un estereomicroscopio. Esto hace posible el desarrollo de protocolos de prueba que no están sujetos a las leyes de protección animal. La vitellogenina, y de forma similar la proteína fluorescente, son producidas por el lóbulo izquierdo del hígado de los embriones15. Por lo tanto, la orientación espacial de los embriones es importante para la detección de la señal más fuerte al examinar la señal fluorescente o tomar fotografías. Esta es la razón por la que los embriones fueron colocados a la izquierda en el protocolo. Como se puede ver en los resultados representativos, el efecto estrogénico de una muestra de prueba está claramente indicado por la señal fluorescente en el hígado, por lo que los resultados pueden ser evaluados visualmente también. Si se necesita la cuantificación de los resultados, entonces el valor de densidad integrado definido por el programa ImageJ es apropiado. Sin embargo, para una evaluación adecuada, es indispensable que las imágenes se tomen con los mismos ajustes durante el experimento, y que el tamaño de las áreas fluorescentes resaltadas sea el mismo en cada imagen. Junto con el posicionamiento preciso de los embriones, estos son los pasos más críticos en el protocolo. Es importante mencionar que en el caso de los embriones la expresión del transgén, de manera similar a la producción de vitellogenina endógena, muestra una gran dispersión y diferencias en la sensibilidad individual. En algunos casos, esto puede causar grandes variaciones en los resultados, que deben tenerse en cuenta al diseñar los experimentos.
Un aspecto importante para determinar las concentraciones de tratamiento es que las células de los embriones, y por lo tanto las células hepáticas, pueden ser dañadas por altas concentraciones de sustancias altamente tóxicas, lo que puede conducir a una disminución de la inducción de vitellogenina. Por lo tanto, los ensayos deberán realizarse a concentraciones inferiores a1015DE LA LC.
Comparar la sensibilidad de las líneas de peces sensibles al estrógeno entre sí es una tarea difícil, porque las líneas descritas hasta ahora han sido probadas de acuerdo con diferentes protocolos5,,14,,15,,16. La línea probada en este protocolo es capaz de detectar relaciones dosis-efecto en casos de ingredientes activos puros, mezclas y muestras ambientales, y los resultados obtenidos se correlacionan bien con los resultados con las pruebas BLYES y las células de HeLa15,,20.
Se ha demostrado la utilidad de los embriones de la línea a los agentes de ensayo, incluida la zearalenona15. En este trabajo, se probaron dos metabolitos de la toxina, el zearalenol y el de los a-zearalenol. De acuerdo con los datos de la literatura, el -ZOL es más tóxico que el30 y su estrógeno también es mayor31. Estos resultados son confirmados por nuestros estudios. Por lo tanto, los estudios sobre los embriones de la línea también son adecuados para comparar los efectos estrogénicos de otras sustancias estrogénicas.
La contaminación por micotoxinas en la cadena alimentaria es un problema global, por lo que se han mejorado varios procedimientos para reducir los niveles de micotoxinas en los piensos y alimentos humanos25,,32. Una de las soluciones más prometedoras es la biodegradación de micotoxinas por microorganismos o por sus enzimas. Puede ser un método esencial después de la descosecución para disminuir o eliminar la descontaminación de la micotoxina. La capacidad degradante de ZEA de numerosas cepas bacterianas ha sido probada en la literatura hasta ahora, sin embargo, recientes hallazgos de investigación que demuestran una alta degradación de la toxina rara vez especifican el efecto adverso de los metabolitos33. Debido a que los embriones de esta línea son teóricamente adecuados para probar los efectos estrogénicos de las muestras con contenido de materia orgánica15, se puede desarrollar un protocolo de tratamiento que puede ayudar a probar los productos de biodegradación de ZEA y la calificación de las cepas degradantes.
Este protocolo puede modificarse de muchas maneras de acuerdo con los puntos finales de prueba planificados (por ejemplo, inicio y longitud de exposición) y a las muestras (por ejemplo, mezclas o muestras ambientales) que se van a probar y se pueden completar con otros métodos de ensayo (por ejemplo, métodos moleculares). Por lo tanto, esperamos que el uso de la línea Tg(vtg1:mCherry) se convierta en un modelo de pruebas de estrogénicos y para métodos de prueba estándar.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo contó con el apoyo de la Oficina Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación (NKFIH) del Fondo Nacional de Investigación, Desarrollo e Innovación (NKFIA); Acuerdo de subvención: proyecto NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 cofinanciado por la Unión Europea, y el Programa de Excelencia Temática NKFIH-831-10/2019 de la Universidad Szent István, otorgado por el Ministerio de Tecnología y Innovación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
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