Summary
Presente aqui está um protocolo detalhado para o uso de embriões de zebrafish Tg(vtg1: mCherry) para a detecção de efeitos estrogênicos. O protocolo abrange a propagação do peixe e o tratamento de embriões, e enfatiza a detecção, documentação e avaliação de sinais fluorescentes induzidos por compostos disruptores endócrinos (EDC).
Abstract
Existem muitos compostos endócrinos (EDC) no ambiente, especialmente substâncias estrogênicas. A detecção dessas substâncias é difícil devido à sua diversidade química; por isso, são utilizados métodos cada vez mais detectadores de efeitos, como organismos biomonitor/bioindicadores sensíveis ao efeito estrogênico. Esses organismos biomonitorantes incluem vários modelos de peixes. Este protocolo abrange o uso da linha transgênica de zebrafish Tg(vtg1: mCherry) como organismo biomonitorador, incluindo a propagação de peixes e o tratamento de embriões, com ênfase na detecção, documentação e avaliação de sinais fluorescentes induzidos pelo EDC. O objetivo do trabalho é a demonstração do uso dos embriões transgênicos Tg(vtg1: mCherry) para detectar efeitos estrogênicos. Este trabalho documenta o uso de embriões transgênicos de zebrafish Tg(vtg1: mCherry) para a detecção de efeitos estrogênicos testando duas substâncias estrogênicas, α- e β-zearalenol. O protocolo descrito é apenas uma base para a concepção de ensaios; o método de teste pode ser variado de acordo com os pontos finais do teste e as amostras. Além disso, pode ser combinado com outros métodos de ensaio, facilitando assim o uso futuro da linha transgênica.
Introduction
Há um número significativo de compostos endócrinos (EDC) que estão entre as substâncias mais perigosas em nosso ambiente. Estes são principalmente compostos estrogênicos que contaminam a água dos recursos naturais. A diversidade química das substâncias pertencentes ao grupo dificulta os testes para sua presença, uma vez que diferentes métodos analíticos são necessários para sua detecção. Com base em sua estrutura química é muito difícil determinar se uma substância é realmente capaz de agir como um estrogênio. Além disso, essas substâncias nunca estão presentes de forma pura no ambiente, de modo que seus efeitos podem ser afetados por outros compostos, também1. Esse problema pode ser resolvido por métodos de detecção de efeitos, como o uso de organismos biomonitor/bioindicadores que apresentam efeitos estrogênicos2,,3,,4,,5.
Recentemente, uma variedade de sistemas de teste baseados em células6 eleveduras 2,3 foram desenvolvidos para detectar efeitos estrogênicos. No entanto, estes são geralmente apenas capazes de detectar a ligação da substância ao receptor de estrogênio2,3. Além disso, são incapazes de modelar processos fisiológicos complexos no organismo, ou detectar fases sensíveis ao hormônio das fases da vida; assim, muitas vezes levam a resultados falsos.
Sabe-se que certos genes reagem sensivelmente ao estrogênio em organismos vivos7. A detecção de produtos genéticos por métodos de biologia molecular também é possível no nível de proteína ou mRNA8,,9, mas geralmente envolve sacrifício animal. As leis de proteção animal tornaram-se mais rigorosas, e há uma demanda crescente por sistemas de teste alternativos que minimizem o número e o sofrimento dos animais usados em experimentos ou a substituição do modelo animal por outro modelo de sistema10. Com a descoberta de proteínas fluorescentes e a criação de linhas biomarcadoras, as tecnologias transgênicas fornecem uma boa alternativa11. Com essas linhas, a ativação de um gene sensível ao estrogênio pode ser testada in vivo.
Entre os vertebrados, destaca-se o potencial dos peixes na avaliação de risco ambiental. Eles oferecem muitas vantagens sobre os modelos de mamíferos: sendo organismos aquáticos, eles são capazes de absorver poluentes através de todo o seu corpo, produzir um grande número de descendentes, e algumas de suas espécies são caracterizadas pelo curto tempo de geração. Seu sistema endócrino e processos fisiológicos mostram grandes semelhanças com outros vertebrados e até mesmo com mamíferos, incluindo humanos12.
Vários genes para a detecção de efeitos estrogênicos em peixes também são conhecidos. Os mais importantes são os receptores de estrogênio aromatase-b, choriogenina-H e vitellogenina (vtg)7,13. Recentemente, várias linhas biosensoras produtoras de estrogênio também foram criadas a partir de modelos de peixes utilizados em laboratório, como a de zebrafish (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. A principal vantagem do zebrafish na criação de linhas biosensoras é o corpo transparente dos embriões e larvas, pois o sinal fluorescente do repórter pode então ser facilmente estudado in vivo sem sacrificar o animal10. Além da proteção animal, também é uma característica valiosa, pois permite estudar a reação do mesmo indivíduo em diferentes momentos do tratamento18.
Esses experimentos usam um repórter de vitellogenina linhazebrafish transgênica 15. A construção transgênica utilizada para o desenvolvimento de Tg(vtg1:mCherry) tem um longo (3,4 kbp) promotor de vitellogenina natural-1. O receptor de estrogênio (ER) é uma proteína melhorador ativada por ligantes que é um representante da superfamília esteroide/receptor nuclear. O ER se liga a sequências específicas de DNA chamadas elementos de resposta de estrogênio (EREs) com alta afinidade e transativa a expressão genética em resposta ao estradiol e outras substâncias estrogênicas, de modo que quanto mais ERE no promotor causa uma resposta mais forte19. Existem 17 locais de ERE na região promotora da construção transgênica Tg(vtg1:mCherry) e espera-se que eles imitem a expressão do gene vtg nativo15. Há uma expressão contínua do sinal fluorescente em fêmeas sexualmente amadurecidas. No entanto, no sexo masculino e embrião a expressão no fígado só é visível após o tratamento com substâncias estrogênicas(Figura 1).
Figura 1: Sinal fluorescente vermelho no fígado de vtg1:mCrestra-se peixe-zebra adulto transgênico e 5 embriões dpf, após indução de 17-ß-estradiol (E2). No feminino e no sexo masculino tratado com E2 (25 μg/L tempo de exposição:48hrs) a fluorescência forte do fígado é visível mesmo através da pele pigmentada. Nenhum sinal fluorescente é visível em macho não tratado(A). Após a indução do E2 (50 μg/L tempo de exposição: 0-120 hpf), também pode ser observado um sinal fluorescente vermelho no fígado de 5 embriões dpf, que não é visível em embriões de controle(B). Embora o sinal fluorescente esteja continuamente presente em fêmeas adultas, principalmente machos e embriões da linha são adequados para detectar efeitos estrogênicos. (BF: campo brilhante, mCherry: visualização do filtro fluorescente vermelho, imagens simples simples, barra de escala A: 5mm, barra de escala B: 250 μm) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Semelhante à vitellogenina endógena, o repórter mCherry só é expresso no fígado. Como a vitellogenina só é produzida na presença de estrogênio, não há sinal fluorescente nos controles. Como a expressão está apenas no fígado, a avaliação dos resultados é muito mais fácil15.
A sensibilidade e a usabilidade dos embriões desta linha têm sido investigadas em várias misturas de compostos estrogênicos e também em amostras ambientais15,,20, e na maioria dos casos foram documentadas relações dose-resposta(Figura 2). No entanto, no caso de substâncias altamente tóxicas, principalmente hepatotóxias (por exemplo, zearalenone), apenas um sinal fluorescente muito fraco pode ser visível no fígado de embriões tratados e o sinal fluorescente de intensidade máxima causado pode ser alcançado dentro de uma faixa de concentração muito pequena, o que dificulta a criação de relações dose-efeito20.
Figura 2: Diagrama de dose-resposta (A) e imagens fluorescentes (mCherry) do fígado (B) expostas a 17-α-ethynilestradiol (EE2), em 5 dpf vtg1:mAsinas decherry. Os resultados são expressos como densidade integrada gerada a partir da força do sinal e do tamanho da área afetada (±SEM, n = 60). 100% refere-se ao máximo observado. A intensidade do sinal fluorescente aumentou gradualmente com a concentração. Barra de escala = 250 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Existem várias substâncias estrogênicas presentes no ambiente, tais como 17-β-estradiol (concentração ambiental: 0.1-5.1 ng/L)21, 17-α-ethynylestradiol (concentração ambiental: 0.16-0.2 μg/L)22, zearalenone (concentração ambiental: 0,095-0,22 μg/L)23, bisfenol-A (concentração ambiental: 0,45-17,2 mg/L)24. Ao testar essas substâncias de forma ativa pura com a ajuda de embriões transgênicos mCherry, as concentrações de efeitos mais baixas observadas (LOEC) para detecção de sinais fluorescentes foram de 100 ng/L para 17-ß-estradiol, 1 ng/L para 17-α-ethynilestradiol, 100 ng/L para zearalenone e 1 mg/L para bisfenol-A (tratamento de 96-120 hpf), que está muito próximo ou dentro da faixa de concentrações ambientais das substâncias15. A linha transgênica Tg(vtg1:mCherry) pode ajudar a detectar estrogenicidade em amostras de águas residuais após exposição direta. A linha é tão sensível quanto o teste de estrogênio de levedura comumente usado, o ensaio de estrogênio bioluminiscente (BLYES)15. Com a ajuda desta linha, os efeitos protetores dos beta-ciclodextrinas contra a toxicidade induzida por zearalenona foram confirmados usando misturas químicas20.
Em um relatório recente, o uso in vivo da linha transgênica foi demonstrado com a ajuda de dois metabólitos zearalenone estrogênico (ZEA), α- e β-zearalenol (α-ZOL e β-ZOL)25. A linha de base do protocolo é apropriada para estudar os efeitos estrogênicos de vários compostos ou amostras ambientais em embriões Tg(vtg1:mCherry).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O Protocolo Animal foi aprovado pela Lei húngara de Bem-Estar Animal e todos os estudos foram concluídos antes que os indivíduos tratados chegassem à fase de alimentação gratuita.
1. Colheita e tratamento de embriões
- Mantenha o peixe-zebra Tg(vtg1:mCherry) a 25,5 ± 0,5 °C, pH = 7 ± 0,2, condutividade entre 525 ± 50 μS/m, nível de oxigênio ≥80% de saturação e luz de 14h e ciclo escuro de 10h.
- Encha os tanques de acasalamento com água do sistema e configure os peixes para acasalar à tarde antes de colher ovos.
- Coloque os peixes machos e fêmeas no tanque e separe-os com a ajuda de um divisor.
- Remova o divisor dos tanques enquanto a luz se acende na manhã seguinte. Verifique os tanques de acasalamento em busca de ovos a cada 15-20 minutos.
- Colher todos os embriões usando um coador de chá ou malha fina densamente tecida e combiná-los em uma grande placa de Petri com tampão E3 (cloreto de sódio de 5 mM, cloreto de potássio de 0,17 mM, cloreto de cálcio de 0,33 mM, 0,33 mM sulfato de magnésio) ou água clara do sistema.
- Coloque os embriões na incubadora definidos para 25,5 ± 0,5 °C.
- Após 1-1,5 h, remova e descarte ovos não fertilizados ou inadequadamente divididos com uma tubulação de transferência de plástico sob um microscópio dissecando.
NOTA: Os ovos não fertilizados são opacos; os ovos fertilizados são transparentes. Para iniciar o tratamento em um estágio posterior de desenvolvimento, preste atenção ao desenvolvimento normal dos indivíduos em tratamento. - Coloque os embriões selecionados nos vasos de tratamento (por exemplo, em placas de Petri ou placas de cultura tecidual) que já tenham sido rotulados e preenchidos com diferentes concentrações da substância de ensaio.
- Incubar os embriões a 25,5 ± 0,5 °C até o final do experimento.
NOTA: Os embriões podem reagir com sensibilidade individual significativa a vários compostos estrogênicos, por isso recomenda-se usar pelo menos 15 embriões em pelo menos três tratamentos repetidos para avaliar o experimento corretamente. Ao selecionar o recipiente, tenha em mente que o desenvolvimento de um embrião requer pelo menos 200 μL de água26. Neste experimento, os embriões foram incubados até 120 cvf a 25,5 ± 0,5 °C. - Atualize a solução de teste se for neccesary para manter a concentração do tratamento. Tenha cuidado ao alterar a solução de teste para evitar danificar os embriões.
NOTA: Também é possível investigar a mortalidade ou sintomas subletais durante o experimento. As concentrações utilizadas devem permanecer o mais estáveis possível para obter resultados confiáveis. Isso pode ser facilmente alcançado atualizando as soluções de teste. A frequência de atualização pode variar dependendo da substância de teste. Portanto, é aconselhável verificar a concentração da substância de ensaio por medições analíticas para determinar a frequência das atualizações da solução.
2. Preparação de larvas para fotografia
- Prepare 4% de metilcelulose com MS-222 (tricaine-metano-sulfonato) de antemão.
- Para isso, adicione 4 mg/mL MS-222 a 100 mL de água dupla destilada a uma concentração final de 0,168 mg/mL, e leve a solução a 4 °C. Em seguida, adicione 4 g de metilcelulose. Mexa-o com um agitador magnético e deixe-o em 4 °C durante a noite.
- No dia seguinte, mexa-o novamente e a solução deve estar pronta para uso. Se o metilcelulose não estiver completamente dissolvido, coloque-o de volta a 4 °C e espere mais algumas horas.
- Coloque larvas de 5 dias de idade em uma placa de Petri de 5 cm por grupo de tratamento com uma pipeta Pasteur.
- Retire a solução de tratamento das larvas com uma pipeta plástica e encha a placa de Petri com 2 mL de solução anestésico MS-222 de 0,02%.
NOTA: A anestesia geralmente é eficaz em menos de um minuto. As larvas são anestesiadas se não nadarem para longe em resposta ao toque. Uma overdose de MS-222 pode matar as larvas. - Encha cada quadrado de uma placa petri de 10 cm especialmente projetada com 4% de metilcelulose com MS-222(Figura 3).
NOTA: Cole duas áreas quadradas de 1,5 x 1,5 cm na parte inferior da placa de Petri usando folhas plásticas (1 mm de altura, 5 mm de largura). Vinte larvas podem ser colocadas uma ao lado da outra em um quadrado. Em vez de uma placa de Petri especialmente projetada, outro recipiente de baixa borda pode ser usado para corrigir a posição dos embriões.
Figura 3: Uma placa de Petri de 10 cm com cola de 1,5 x 1,5 cm de largura, quadrados de folha de plástico de 1 mm de espessura para preparação de larvas para fotografia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
- Transfira as larvas anestesiadas para metilcelulose com um pouco de água em um dos dois quadrados. A partir do primeiro quadrado transfira as larvas para o segundo quadrado.
NOTA: Com a ajuda dessa transferência, a metilcelulose de 4% utilizada para fotografia não será diluída e as larvas não girarão durante a imagem. - No segundo quadrado, gire e oriente larvas para o lado esquerdo e pressione-as suavemente até o fundo da celulose com uma ponta de pipeta de microcarregador cortada até 2 cm.
NOTA: Não use outras pontas de pipeta porque elas causam ferimentos nas larvas.
3. Microscopia
NOTA: A fotografia não mata os animais. Os animais podem ser despertados removendo-os da metilcelulose e colocando-os em água ou solução de tratamento do sistema fresco, de modo que o mesmo indivíduo pode ser examinado várias vezes durante o tratamento.
- Para avaliar o sinal do repórter expresso, imagem os embriões com a mesma visão e configurações.
NOTA: Consulte o passo 2.6 para um posicionamento ideal do embrião. As fotos do manuscrito foram tiradas sob as condições descritas. Campo brilhante: ampliação de 60x, exposição de 6 ms, Iris 100%, Gain:1.1, fotos de fluorescência: 60x de ampliação, exposição de 300 ms, Íris: 100%, Gain:1, filtro mCherry, fonte de luz fluorescente: lâmpada de halido de mercúrio. Para tirar uma foto de estereótipo fluorescente, foram utilizados câmeras dedicadas e software para microscópio. - Coloque a placa de Petri no palco do microscópio.
- Concentre-se no fígado do embrião e capture uma imagem de campo brilhante usando o software associado.
- Mude o microscópio para o filtro mCherry e tire uma imagem fluorescente do fígado sob luz fluorescente usando o software associado.
NOTA: Realize todos os passos de fluorescência no escuro. Não altere a ampliação, o foco ou a posição do embrião entre a captura do campo brilhante e as imagens fluorescentes, pois isso ajudará na análise das imagens. - Repita os passos 3.3 e 3.4 até que todos os embriões do experimento tenham sido imagens.
4. Determinando a densidade integrada
NOTA: Um dos melhores indicadores para comparar a força do sinal fluorescente é o valor de densidade integrada (ou seja, o produto da área e o valor cinza médio). Uma das formas mais fáceis de determinar a densidade integrada é usar o programa ImageJ27. O programa está disponível na internet e pode ser instalado no computador.
- Abra o ImageJ, em seguida, carregue a imagem fluorescente a ser analisada arrastando e soltando a imagem ou clicando em File| Aberto.
- Clique em Imagem| Cor| Canais divididos para dividir a imagem feita pelo filtro fluorescente de acordo com o gráfico de cores RGB.
- Trabalhe com o espectro de imagem do canal vermelho, feche os outros canais.
- Designe uma área elíptica de tamanho semelhante na imagem para que sinais falsos não interfiram na avaliação. Usando as ferramentas Oval, desenhe uma elipse sobre a área hepática destacada da forma mais precisa possível.
- Se o sinal estiver fraco use imagens de microscopia leve (ou seja, o par de campo brilhante da imagem fluorescente) para determinar a localização do fígado.
- Clique em Analisar| Meça para determinar a força do sinal e o tamanho da área afetada. O valor de densidade integrada é calculado automaticamente pelo software (coluna IntDen no gráfico).
- Continue a análise repetindo as etapas 4.1-4.6 até que todas as imagens fluorescentes de todos os embriões do grupo de tratamento sejam analisadas.
- Salve os dados e, em seguida, analise os valores de densidade integrada.
NOTA: Selecione sempre o mesmo tamanho de área nas imagens durante a análise. O tamanho da área a ser analisada depende da ampliação, resolução de imagem, outras configurações para filmagem, etc. A análise pode ser acelerada ou mais precisa usando macros pessoais para análise. Por exemplo, macros podem ser usadas para garantir que a área selecionada seja sempre a mesma nas imagens examinadas. Descrições detalhadas para a criação de macros que permitem a melhor análise de imagem de acordo com configurações de fotos específicas são encontradas no site imageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
No experimento apresentado neste manuscrito, os efeitos de duas substâncias estrogênicas foram testados em cinco concentrações a partir da fertilização por 5 dias em embriões de zebrafish Tg (vtg1:mCherry). Investigamos se os sinais fluorescentes apareceram no fígado dos peixes no final do tempo de exposição por causa das substâncias e se havia diferenças na estrogenicidade das duas substâncias. Os resultados foram avaliados com base nas imagens fluorescentes e nos valores de densidade integrada. Em geral, ambas as substâncias induziram a expressão do transgene ao final do tempo de exposição nessas concentrações de teste nas quais os indivíduos sobreviveram. Nos casos de peixes de controle não tratados, nenhum sinal fluorescente era visível.
No caso do α-ZOL, na maior concentração de teste (8 μM) todos os indivíduos morreram, portanto, neste caso, o sinal fluorescente não pôde ser examinado. Em concentrações mais baixas (0,5 μM-4 μM), observou-se forte sinal fluorescente no fígado dos embriões(Figura 4A). Não foi observada diferença significativa na intensidade da fluorescência e no tamanho das áreas fluorescentes (p < 0,05). Os valores de densidade integrada α-ZOL(Figura 4C),mostram que a substância induziu o aparecimento de um sinal fluorescente. Não foi encontrada diferença significativa entre os valores de densidade integrada e entre os tratamentos (p < 0,05). A densidade média integrada variou entre 31,26 ± 13,95 (0,5 μM) e 34,25 ± 15,36 (4 μM).
Nenhuma mortalidade foi documentada durante o tratamento com β-ZOL, e a substância induzida atividade transgênica em todas as concentrações de tratamento. A intensidade da fluorescência e o tamanho da área fluorescente aumentaram à medida que a concentração aumentava, como visto nas imagens fluorescentes(Figura 4B). Comparando as imagens fluorescentes de α- e β-ZOL visualmente, tanto a força do sinal quanto o tamanho da área fluorescente foram visivelmente mais fracos para β-ZOL nas mesmas concentrações de tratamento das duas substâncias. Estudando os valores integrados de β-ZOL (Figura 4D),o valor médio de densidade integrada quase dobrou entre as concentrações de tratamento mais baixas e as mais altas. Entretanto, no caso do β-ZOL não houve diferença significativa entre os valores de densidade integrada das concentrações individuais (p < 0,05). A densidade média integrada variou entre 15,86 ± 4,08 (0,5 μM) e 21,73 ± 5,94 (8 μM).
Figura 4: Apresentação de valores de densidade integrada derivados da intensidade dos sinais fluorescentes no fígado e do tamanho da área afetada causada pelo tratamento α- e β-zearalenol em embriões de zebrafish transgênicos Tg(vtg1:mCherry) de 5 dias de idade. No experimento, embriões sensíveis ao estrogênio da linha de zebrafish biomarcadores (20 larvas por grupos em três réplicas em cada concentração de tratamento) foram tratados com concentrações de 0,5 μM-8 μM de α- e β-ZOL a partir da fertilização em diante por 5 dias. Imagens dos fígados de peixe para α-ZOL(A)e β-ZOL (B)mostram claramente que as substâncias induziram o aparecimento do sinal fluorescente. Os dados de densidade integrada são apresentados como média ± desvio padrão (SD = barra de erro). Os dados foram analisados com os grubbs iterativos para identificação de outliers, que foram excluídos. Os dados foram verificados quanto à normalidade com o teste de normalidade shapiro-wilk e foi estabelecido o cumprimento dos requisitos dos métodos paramétricos. As análises estatísticas foram realizadas utilizando-se um ANOVA unidirecional seguido de um teste de Dunnett. Estudando os valores de densidade integrada, não foi encontrada diferença significativa entre os tratamentos nos casos de α-ZOL (C) e β-ZOL(D) (p < 0,05). Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Ao examinar os valores de densidade integrados obtidos a partir das mesmas concentrações de tratamento das duas substâncias (Figura 5), α-ZOL apresentou maiores médias de densidade integrada em cada caso em relação ao β-ZOL, o que é consistente com as diferenças entre as forças de sinal observadas nas imagens fluorescentes. Nos casos de todas as concentrações de tratamento, foram encontradas diferenças significativas (0,5 μM, p = 0,0011; 1 μM, p = 0,0003; 2 μM, p = 0,0329; e 4 μM, p = 0,0325).
Figura 5: Comparação dos valores de densidade integrada α e β-zearalenol. Os dados de densidade integrada são apresentados como média ± desvio padrão SD = barra de erro. Os dados foram analisados com grubbs iterativos para identificar outliers, que foram excluídos. Os dados foram verificados quanto à normalidade com o teste de normalidade shapiro-wilk e foi estabelecido o cumprimento dos requisitos dos métodos paramétricos. Foram verificadas diferenças significativas com t-test não remunerado entre α-ZOL e β-ZOL no caso de cada concentração (0,5 μM, p = 0,0011; 1 μM, p = 0,0003; 2 μM, p = 0,0329; e 4 μM, p = 0,0325). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O uso de biomonitoradores/bioindicadores para efeitos estrogênicos vem se espalhando em estudos toxicológicos. Os modelos in vivo desempenham um papel notável, pois ao contrário dos testes in vitro, eles não só fornecem informações sobre a resposta de uma célula ou de um receptor, mas também permitem a investigação de processos complexos no organismo. Várias linhas transgênicas para o estudo de efeitos estrogênicos foram produzidas a partir de zebrafish, uma das quais Tg(vtg1:mCherry) foi usada para estes estudos. O método descrito aqui ilustra um protocolo para o teste de embriões desta linha, a fim de detectar a atividade de estrogênio in vivo em ingredientes puros e ativos.
Machos e embriões da linha também são adequados para detectar efeitos estrogênicos, mas os embriões têm várias vantagens que promovem sua usabilidade. Em particular, o corpo é transparente, de modo que o sinal fluorescente no fígado pode ser facilmente observado. O fígado de zebrafish começa a se desenvolver 6 horas após a fertilização (6 hpf) e começa a trabalhar após 50 horas (50 hpf). Primeiro, o lobo esquerdo do fígado é formado, e às 96 horas (96 hpf) o lobo direito do fígado também aparece. A forma final do fígado é desenvolvida por volta do dia 5 (120 hpf)28,29. O fígado é capaz de produzir vitellogenina endógena a partir dos 2-3 dias de um embrião14, que coincide com o aparecimento do sinal fluorescente nalinha Tg(vtg1:mCherry). Portanto, ao projetar experimentos, deve-se ter em conta que um sinal fluorescente só pode ser esperado no fígado de embrião a partir desse momento. O fígado dos embriões de 5 dias de idade já está bem definido em uma área relativamente grande, onde o sinal fluorescente pode ser facilmente detectado sob um estereóscópio. Isso torna possível o desenvolvimento de protocolos de teste que não estejam sujeitos às leis de proteção animal. A vitellogenina, e da mesma forma a proteína fluorescente, são produzidas pelo lobo esquerdo do fígado dos embriões15. Portanto, a orientação espacial dos embriões é importante para a detecção do sinal mais forte ao examinar o sinal fluorescente ou tirar fotos. É por isso que os embriões foram colocados à esquerda no protocolo. Como pode ser visto nos resultados representativos, o efeito estrogênico de uma amostra de ensaio é claramente indicado pelo sinal fluorescente no fígado, de modo que os resultados podem ser avaliados visualmente também. Se a quantificação dos resultados for necessária, então o valor de densidade integrada definido pelo programa ImageJ é apropriado. No entanto, para uma avaliação adequada, é indispensável que as imagens sejam tiradas com as mesmas configurações durante o experimento, e que o tamanho das áreas fluorescentes destacadas seja o mesmo em cada imagem. Juntamente com o posicionamento preciso dos embriões, estes são os passos mais críticos do protocolo. É importante mencionar que no caso dos embriões a expressão do transgene, similarmente à produção de vitellogenina endógena, mostra uma grande dispersão e diferenças na sensibilidade individual. Em alguns casos, isso pode causar grandes variações nos resultados, que devem ser levados em conta ao projetar os experimentos.
Um aspecto importante na determinação das concentrações de tratamento é que as células dos embriões, e consequentemente as células hepáticas, podem ser danificadas por altas concentrações de substâncias altamente tóxicas, o que pode levar a um declínio na indução de vitellogenina. Portanto, os testes devem ser realizados em concentrações abaixo daLC 1015.
Comparar a sensibilidade das linhas de peixe sensíveis ao estrogênio entre si é uma tarefa difícil, pois as linhas descritas até agora foram testadas de acordo com diferentes protocolos5,,14,,15,,16. A linha testada neste protocolo é capaz de detectar relações dose-efeito em casos de ingredientes ativos puros, misturas e amostras ambientais, e os resultados obtidos correlacionaram-se bem com os resultados com testes BLYES e células HeLa15,,20.
A utilidade dos embriões da linha para testar agentes foi comprovada, incluindo zearalenone15. Neste trabalho, foram testados dois metabólitos da toxina, α-e β-zearalenol. De acordo com dados da literatura, o α-ZOL é mais tóxico que o β-ZOL30 e sua estrogênio também é maior31. Esses resultados são confirmados por nossos estudos. Assim, estudos sobre os embriões da linha também são adequados para comparar os efeitos estrogênicos de outras substâncias estrogênicas.
A contaminação por micotoxinas na cadeia alimentar é um problema global, por isso vários procedimentos foram melhorados para reduzir os níveis de micotoxina na alimentação animal e na alimentação humana25,32. Uma das soluções mais promissoras é a biodegradação de micotoxinas por microrganismos ou por suas enzimas. Pode ser um método pós-estupro essencial para diminuir ou eliminar a descontaminação da micotoxina. A capacidade degradante zea de numerosas cepas bacterianas tem sido testada na literatura até agora, no entanto, descobertas recentes de pesquisas que comprovam alta degradação da toxina raramente especificam o efeito adverso dos metabólitos33. Como os embriões desta linha são teoricamente adequados para testar os efeitos estrogênicos das amostras com conteúdo de matéria orgânica15,pode-se desenvolver um protocolo de tratamento que possa ajudar a testar os produtos de biodegradação da ZEA e a qualificação das cepas degradantes.
Este protocolo pode ser alterado de muitas maneiras de acordo com os pontos finais de teste planejados (por exemplo, início de exposição e comprimento) e para as amostras (por exemplo, misturas ou amostras ambientais) que serão testadas e podem ser completadas com outros métodos de teste (por exemplo, métodos moleculares). Assim, esperamos que o uso da linha Tg(vtg1:mCherry) se torne um modelo de testes de estrogenicidade e para métodos de teste padrão.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho contou com o apoio do Escritório Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação (NKFIH) do Fundo Nacional de Pesquisa, Desenvolvimento e Inovação (NKFIA); Acordo de Subvenção: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 projeto co-financiado pela União Europeia, e o Programa de Excelência Temática NKFIH-831-10/2019 da Universidade Szent István, concedido pelo Ministério da Inovação e Tecnologia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
References
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
- Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
- Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
- Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
- Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
- Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
- Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
- Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
- Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
- Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
- Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
- Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
- Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
- Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
- Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
- Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
- Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
- Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
- Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
- Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
- Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).
