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Engineering

Controlando as velocidades de fluxo de fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura

doi: 10.3791/60484 Published: November 26, 2019

Summary

O objetivo deste protocolo é usar a temperatura para controlar as velocidades de fluxo de fluidos ativos tridimensionais. A vantagem deste método não só permite regular as velocidades de fluxo in situ, mas também permite o controle dinâmico, como ajustar periodicamente as velocidades de fluxo para cima e para baixo.

Abstract

Apresentamos um método para usar a temperatura para ajustar as velocidades de fluxo de fluidos ativos tridimensionais (3D) orientados por quineinas, à base de microtúbulos. Este método permite ajustar as velocidades in situ sem a necessidade de fabricar novas amostras para atingir diferentes velocidades desejadas. Além disso, este método permite o controle dinâmico da velocidade. Andar de bicicleta a temperatura leva os fluidos a fluir rápido e lento, periodicamente. Essa controlabilidade é baseada na característica de Arrhenius da reação kinesin-microtubule, demonstrando uma faixa de velocidade de fluxo média controlada de 4-8 μm/s. O método apresentado abrirá a porta para o projeto de dispositivos microfluídicos onde as taxas de fluxo no canal são localmente tunable sem a necessidade de uma válvula.

Introduction

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A matéria ativa é diferenciada da matéria passiva convencional devido à sua capacidade de converter energia química em trabalho mecânico. Um material que possui tal capacidade pode consistir em entidades vivas ou não vivas, como bactérias, insetos, coloides, grãos e filamentos citoesqueléticos1,2,3,4,5,7,8,9,10. Essas entidades materiais interagem com seus vizinhos. Em maior escala, eles se auto-organizam em vórtices turbulentos (turbulência ativa) ou fluxos materiais11,12,13,14,15,16,18,19,20. Uma compreensão da auto-organização da matéria ativa levou a várias aplicações em ônibus moleculares, dispositivos ópticos e computação paralela21,22,23. Para trazer aplicativos para o próximo nível requer controle além da auto-organização. Por exemplo, Palacci et al. desenvolveram um coloide hematita encapsulado que se autopropelia apenas quando exposto à luz azul controlada manualmente, o que levou ao surgimento de cristais vivos24. Morin et al. estabeleceram o controle dos coloides quincke rolando usando um campo elétrico externo tunable, resultando em coloidal reunindo-se em uma pista de corrida como canal25. Esses trabalhos anteriores demonstram o papel do controle local nas aplicações e promovem a base de conhecimento da matéria ativa.

Neste artigo, nos concentramos na controlabilidade dos fluidos ativos 3D baseados em quinesina, microtubule (MT). Os fluidos consistem em três componentes principais: MTs, motores moleculares de cinese e depletantes. Os depletantes induzem uma força de esgotamento para agrupar as MTs, que mais tarde são superadas por aglomerados de motores. Estes motores andam ao longo do MTstoward a extremidade mais. Quando um par de MTsis ponte anti-paralelo, os motores correspondentes andar em direções opostas. No entanto, os motores estão ligados em um cluster e são incapazes de se afastar, então eles deslizam cooperativamente pares de MTs (deslizamento de interfilamento, Figura 1A). Estas dinâmicas deslizantes se acumulam, fazendo com que os feixes de MTsto se estendem até atingir seu ponto de instabilidade e quebra (pacotes extensile, Figura 1B)26. Os feixes quebrados são annealed pela força do esgotamento, que estende subseqüentemente outra vez, e a dinâmica repete. Durante o processo de dinâmica de repetição, os movimentos do feixe agitam o líquido próximo, induzindo fluxos que podem ser visualizados pelo doping com traçadores em escala de mícron (Figura 1C). Sanchez et al. e Henkin et al. caracterizaram as velocidades médias dos traçadores, descobrindo que as velocidades eram tunable variando as concentrações de triphosfato de adenosina (ATP), depletantes, clusters motores e MTs19,27. No entanto, essa tunabilidade existia apenas antes da síntese de fluidos ativos. Após a síntese, a tunability foi perdida, e os líquidos auto-organizados em sua própria maneira. Para controlar a atividade do fluido ativo após a síntese, Ross.et al. relatou um método usando a imersão ativada pela luz das proteínas motoras, permitindo que a atividade fluida fosse ajustada e desligasse usando a luz28. Enquanto o controle de luz é conveniente em termos de ativar localmente os fluidos, o método requer redesenhar as estruturas de proteínas motoras, juntamente com a modificação dos caminhos ópticos em um microscópio. Aqui, fornecemos um método fácil de usar para controlar localmente os fluxos de fluidos sem modificação do microscópio, mantendo a estrutura motora intacta.

Nosso método de ajuste local do fluxo de fluido ativo é baseado na lei Arrhenius porque a reação kinesin-MT tem sido relatado para aumentar com a temperatura29,30,31,32. Nossos estudos anteriores mostraram que a dependência de temperatura da velocidade média de um fluxo de fluido ativo seguiu a equação de Arrhenius: v = A exp (-Ea/RT), onde A é um fator pré-exponencial, R é a constante de gás, Ea é a energia de ativação, e T é a temperatura do sistema33. Portanto, a atividade fluida é sensível ao ambiente de temperatura, e a temperatura do sistema precisa ser consistente para estabilizar o desempenho do motor e, consequentemente, a velocidade de fluxo defluido34. Neste artigo, demonstramos o uso da dependência de temperatura do motor para ajustar continuamente as velocidades de fluxo de fluidos ativos, ajustando a temperatura do sistema. Também demonstramos a preparação de uma amostra de fluido ativo, seguida pela montagem da amostra em um estágio de microscópio cuja temperatura é controlada através de software de computador. Aumentar a temperatura de 16 °C para 36 °C acelera as velocidades médias de fluxo de 4 para 8 μm/s. Além disso, a tunabilidade é reversível: aumentar e diminuir repetidamente a temperatura acelera sequencialmente e desacelera o fluxo. O método demonstrado é aplicável a uma ampla gama de sistemas onde as principais reações obedecem à lei Arrhenius, como o ensaio de deslizamento mt29,30,31,32.

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Protocol

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1. Preparação de MTs

ATENÇÃO: Nesta etapa, purificamos as tubulinas do tecido cerebral bovino. Cérebro bovino pode causar variante doença de Creutzfeldt-Jakob (vCJD)35. Portanto, os resíduos cerebrais e soluções relacionadas, garrafas e dicas de pipetas devem ser coletados em um saco de biolixo e descartados como resíduos bioperigosos de acordo com as regras da instituição.

  1. Purify tubulins do cérebro bovino (modificado de Castoldi et al.36).
    1. Transporte aproximadamente 1,5 kg de cérebros bovinos frescos de um matadouro local para uma sala fria da universidade. Durante o transporte, guarde os cérebros em tampão de fosfato (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7.2) no gelo.
      NOTA: Para maximizar o rendimento final da tubulina, a quantidade inicial de tubulina funcional no tecido cerebral fresco é fundamental. Cérebros mais frescos contêm tubulina mais funcional. Para obter os cérebros mais frescos do matadouro, recomendamos pedir ao açougueiro para fornecer cérebros das vacas mais recentemente abatidas. Os cérebros não devem ter mais de 3 h quando iniciar o procedimento, porque reduzir o tempo entre abate e início do procedimento produzirá melhores rendimentos.
    2. Homogeneize e esclareça os cérebros.
      1. Limpe o cérebro usando bisturis para cortar os vasos sanguíneos e tecido conjuntivo em pedaços menores e removê-los do cérebro com a mão.
        NOTA: Os cérebros limpos devem ser cor-de-rosa.
      2. Mergulhe o tecido cerebral limpo em 1 L de buffer de despolimerização (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic, 1 mM CaCl2, pH 6.6) por quilograma de cérebro.
      3. Homogeneize os cérebros com um liquidificador de cozinha.
      4. Centrífuga a solução cerebral homogeneizada a 10.000 x g e 4 °C por 150 min.
    3. Polimernize MTs (primeira polimerização).
      1. Coletar e misturar o supernatant com volumes iguais das seguintes soluções em 37 °C: glicerol, tampão de tubos de alta molaridade (HMPB: 1 M PIPES, 10 mM MgCl2, 20 mM etileno glicol-bis (β-aminoehyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic ácido [EGTA], pH 6.9)
      2. Adicione 1,5 mM ATP e 0,5 mM guanosine triphosfato (GTP) à mistura.
      3. Incubar a mistura a 37 °C por 1 h.
    4. Depolinizam MTs (primeira depolimerização do MT).
      1. Pelota MT por centrífuga em 151.000 x g e 37 °C por 30 min.
      2. Descarte supernatant e resuspende cada pelota de MT em 10 mL de 4 °C DB.
      3. Incubar no gelo por 30 min.
      4. Agitaa a mistura a cada 5 min com uma ponta de pipeta para evitar a sedimentação do MT.
        NOTA: A mistura deve ficar clara em 30 min, indicando a conclusão da depolimerização mt.
    5. Polimernize MTs (segunda polimerização mt).
      1. Esclareça a solução centrífuga a 70.000 x g e 4 °C por 30 min.
      2. Coletar e misturar o supernatant com volumes iguais de 37 °C glicerol e HMPB.
      3. Adicione 1,5 mM ATP e 0,5 mM GTP à mistura.
      4. Incubar a mistura a 37 °C por 30 min.
    6. Repita o passo 1.1.4, substituindo o HMPB pelo buffer de remontagem Brinkley (BRB) 80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, pH 6.8), seguido de esclarecer a mistura desmatada por centrífuga em 79.000 x g e 4 °C por 30 min.
    7. Recolher o supernatant. Medir a absorção de 280 nm com um espectrômetro. Determinar a concentração de tubulina usando a lei Cerveja-Lambert (coeficiente de extinção da tubulina: 1,15 (mg/mL)-1cm-1)37,38.
    8. Guarde a proteína a -80 °C.
  2. Reciclar tubulins (modificados de Castoldi et al.36).
    NOTA: Para aumentar a pureza da tubina, a tubulina purificada é polimerizada e depolimerizada novamente.
    1. Polimerzique os MTs misturando a tubbulina purificada (passo 1.1.7) com 500 μM dithiothreitol (DTT) e 20 μM GTP, seguido por 30 min de incubação a 37 °C.
    2. Pelotas os MTs.
      1. Carga 1 mL de almofada de glicerol (80 tubos mM, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6.8) na parte inferior de um tubo de centrífuga.
      2. Coloque as MTs polimerizadas em cima da almofada.
      3. Centrífuga a 172.000 x g por 90 min a 37 °C.
    3. Depolinizam as MTs.
      1. Retire o supernatant e almofada.
      2. Resuspender cada pelota MT em 150 μL de 4 °C MT buffer (M2B: 80 mM PIPES, 2 mM MgCl2,1 mM EGTA, pH 6.8).
      3. Incubar a mistura no gelo por 30 min.
      4. Agita a mistura com uma ponta de pipeta a cada 5 min. A mistura deve ficar clara.
    4. Esclareça a mistura centrífuga em 172.000 x g e 4 °C por 30 min.
    5. Recolher o supernatant. Medir a concentração de proteínas. Armazenar a -80 °C.
  3. Rotular a tubulina com corante fluorescente39.
    1. Polimerizar as MTs. Misture a tubbulina purificada (passo 1.1.7) com 500 μM DTT e 16.7 μM GTP, e incubaa a mistura em 37 °C para 30 min.
    2. Pelotas os MTs.
      1. Coloque 1 mL de 37 °C almofada de alto pH (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 8.6) em um tubo de centrífuga.
      2. Coloque as MTs polimerizadas na almofada.
      3. Centrífuga a 327.000 x g por 50 min a 37 °C.
    3. Etiqueta tubulina.
      1. Resuspender cada pelota MT com 700 μL de 37 °C de rotulagem tampão (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2,1 mM EGTA, 40% v/v glicerol, pH 8.6).
      2. Misture a suspensão com um excesso de 10-20 molar de corante fluorescente muito vermelho funcionalizado com um éster succinimidyl.
      3. Incubar a mistura a 37 °C por 30 min no escuro para permitir que as MTs reajam com o éster do corante fluorescente.
      4. Pare a reação de rotulagem saturando o éster do tintura suspenso com 50 mM K-glutamato, incubando por 5 min a 37 °C.
    4. Pelotas os MTs rotulados: Repita a etapa 1.3.2, substituindo a almofada de alto pH por almofada de baixo pH (80 tubos mM, 2 mM MgCl2,1 mM EGTA, 60% v/v glicerol, pH 6.8).
    5. Depolinizam As MTs.
      1. Descarte o supernatant e a almofada.
      2. Resuspenda a pelota em 700 μL de 4 °C M2B.
      3. Incubar a suspensão no gelo.
      4. Agita cada 5 min com uma ponta da pipeta até que a solução esteja desobstruída.
    6. Esclareça a solução limpa centrífuga a 184.000 x g e 4 °C por 35 min.
    7. Aumente a pureza da solução de tubulina rotulada, repetindo etapas 1.2.1-1.2.4.
    8. Medir a concentração de proteínas e corante fluorescente. Use essas medidas para determinar a concentração de tubina e as frações de tubulina rotulada, definidas como a proporção de concentrações de corante fluorescente para a tubulina.
    9. Guarde a solução de tubulina rotulada a -80 °C.
  4. Polimerização das MTs (adotadas a partir de Sanchez et al.19):
    1. Misture a tubulina reciclada (passo 1,2,5) com tubulina rotulada (passo 1,3,9) em uma proporção que rende uma fração de tubulina de 3% rotulada.
    2. Misture a mistura de tubulina de 8 mg/mL com 1 mM DTT e 0,6 mM guanosina-5'[α, β)-metileno]triphosfato (GMPCPP), seguido por 30 min de incubação a 37 °C.
    3. Após a incubação, aneal as MTs à temperatura ambiente no escuro por 6 h.
    4. Aliquot e armazenar a -80 °C.

2. Aglomerados de cinesesina sintetizar

NOTA: As bactérias existem onipresentemente e podem crescer na mídia e contaminar o processo de preparação. Para evitar a contaminação, ações que envolvam contato com as culturas celulares (por exemplo, tubulação) devem ser realizadas perto de uma chama. Ferramentas como frascos, pipetas, dicas de pipetas, mídia e placas devem ser autolavadas antes do uso.

  1. Motores expressos de kinesin em Escherichia coli40.
    1. Transforme as células.
      1. Pipette 1 μL do plasmid K401-BCCP-H6 em 10 μL de células competentes.
      2. Incubar no gelo por 5 min.
      3. Choque térmico a 42,5 °C para 45 s.
      4. Incubar as células no gelo por 2 min para permitir a recuperação.
      5. Misture as células com 300 μL de 2XYT livre de antibióticos (5 g/L NaCl, extrato de levedura 10 g/L, 16 g/L tripptone).
      6. Incubar as células a 37 °C por 1 h.
        NOTA: A menos que especificado, monitorar o crescimento da célula não é necessário durante a incubação.
    2. Inocular mídia placa.
      1. Espalhe a cultura celular em uma placa 2XYT (10 g/L NaCl, extrato de levedura 5g/L, 10 g/L tripptone, 15 g/L ágar, 100 μg/mL ampicilina, 25 μg/mL chloramphenicol).
      2. Incubar a placa de cabeça para baixo em 37 °C durante a noite.
    3. Inocular mídia líquida.
      1. A partir da placa durante a noite, colher uma colônia isolada com uma ponta de pipeta.
      2. Ejetar a ponta em um frasco contendo 50 mL de 2XYT.
      3. Incubar e agitar a mídia cultural em 37 °C e 200 rpm para 12-16 h.
    4. Expandir as células.
      1. Misture 2,5 mL da cultura celular em 500 mL de 2XYT.
      2. Incubar e agitar a cultura de 500 mL em 37 °C e 250 rpm para 3-6 h.
    5. Induzir a expressão proteica.
      1. Durante a incubação, monitore o crescimento celular medindo a absorção em 600 nm, usando 2XYT como referência. Medir a absorção a cada 60 min, até atingir OD600 = 0,3. Em seguida, medir a absorção a cada 30 min até atingir 0,5-0,6.
      2. Permitir que as células cresçam até que a absorção atinja o od600 = 0,5-0,6
      3. Adicione 24 μg/mL biotina e 1 mm isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à cultura celular.
        NOTA: IPTG é usado para induzir a expressão de proteína dos motores de cinese, que são marcados com proteína de portador de carboxyl biotina (BCCP) e seis histidinas (H6). A etiqueta H6 é usada no processo de purificação (passo 2.2), enquanto o BCCP se liga às moléculas de biotina adicionadas para biotinylate os motores de cinese expressa.
      4. Incubar e agitar a cultura celular em 20 °C e 250 rpm para 12-20 h.
    6. Colher as células por centrífuga em 5.000 x g e 4 °C por 10 min. Descarte o supernatant. Guarde as pelotas celulares a -80 °C.
  2. Purify a proteína motora da cinese (modificada de Spriestersbach eoutros41):
    1. Suspender a pelota celular (passo 2.1.6) com um volume igual de d'água (50 tubos de mM, 4 mM MgCl2,50 μM ATP, 10 mM 2-mercaptoethanol (βME), 20 mM imidazole, pH 7.2), seguido pela adição de um comprimido de inibidor de protease, 2 mg de flúor fenilmetil sulfonilo (PMSF) e 2 mg de lysozyme.
    2. Lyse as células por congelamento flash em nitrogênio líquido (LN) 3x e descongelando a mistura celular.
      NOTA: Depois de lysing, a mistura deve tornar-se viscosa.
    3. Esclareça a mistura de células linilhadas centrífugas a 230.000 x g e 4 °C por 30 min.
    4. Colete o supernatant e flua-o através de uma coluna da gravidade, seguida lavando a coluna com 10 mL do amortecedor da lyse.
      NOTA: Proteínas com uma etiqueta H6, como a cineesina K401-BCCP-H6, devem permanecer na coluna.
    5. Eluate a proteína marcada com 5 mL de tampão de elução (50 mM PIPES, 4 mM MgCl2,50 μM ATP, 500 mM imidazole, pH 7.2). Colete o fluxo sequencialmente em 1 frações mL. Para determinar as frações contendo proteínas, misture 3 μL de cada fração com 100 μL de tinuoso triphenylmetano. As frações contendo proteínas devem ficar azuis. Combine estas frações e diluir por 5x com o amortecedor da lysis.
    6. Concentre a solução proteica.
      1. Carregue a solução em um tubo de filtro centrífuga.
      2. Centrífuga a 3.000 x g por 10 min a 4 °C.
      3. Agite o tubo suavemente e centrífuga novamente até que o volume da solução é <3 mL.
    7. Medir a concentração de proteínacom um espectrômetro (coeficiente de extinção: 0,549 (mg/mL)-1cm-1)42,43. Diluir a proteína para 1 mg/mL, acrescentando 35% w / v sacarose.
    8. Armazenar a -80 °C.
  3. Medir as concentrações de cinesina com um gel de eletroforese (modificado de Taylor et al.44).
    NOTA: Para medir a concentração de cinesina com um gel de eletroforese, a tubulina é uma escada de concentração ideal por causa de sua alta pureza e sua concentração mensurável através de um espectrômetro (Figura 2A)36.
    1. Prepare amostras de tubulina com concentrações de 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 e 1,25 mg/mL. Misture 15 μL de cada amostra de tubulina e amostra de cinenina (passo 2.2.8) separadamente com 5 μL de buffer de amostra (200 mM Tris-HCl, 8% de sulfato de dodcyl de sódio (SDS), 400 mM DTT, 0,2% bromehenol azul, 40% glicerol, pH 6,8) e incubado a 90 °C para 3min.
    2. Prepare a eletroforese.
      1. Tranque um gel de eletroforese na caixa de gel.
      2. Preencha a caixa com tampão de execução (50 mM MOPS, base de 50 mM Tris, 0,1% SDS, 1 mM etilediaminatetraacetic ácido (EDTA), pH 7,7).
        NOTA: Certifique-se de que o nível tampão está acima da abertura superior do gel.
    3. Carregue 10 μL de proteína padrão escada, amostras de tubulina, e amostra de cinese em poços separados e aplicar 200 V em todo o gel para 45 min.
    4. Coloração de gel.
      1. Incubar e balançar o gel com fervida (aproximadamente 95 °C) solução de mancha A (0,5 g/L tinuche triphenylmethane, 10% v/v ácido acético, 25% isopropanol) por 5 minutos, em seguida, lave o gel com água desionizada (DI).
      2. Repita com soluções de manchas B (0,05 g/L tinativo triphenylmethane, 10% v/v ácido acético, 10% isopropanol), C (0,02 g/L tine triphenylmethane, 10% v/v ácido acético) e D (10% v/v ácido acetic), sequencialmente. Incubar e balançar o gel em di água durante a noite.
    5. Escaneie o gel. Converta a imagem do gel em uma imagem em tons de cinza, seguida por uma inversão em preto e branco e um aprimoramento do contraste para revelar bandas de proteína brilhantes no fundo preto.
    6. Medir o brilho de cada faixa, resumindo os valores de pixel. Aplique o ajuste linear C = aB + b, onde B é o brilho de uma banda de tubulina, C é a concentração correspondente, e a e b são parâmetros adequados. Determinar a concentração de cinese Ck usando o brilho da banda kinesin Bk para calcular a equação linear: Ck = aB k + b.
  4. Acomode os motores de cinese.
    1. Misture 1,5 μM kinesin (passo 2.2.8) com 120 μM DTT e 120 nM streptavidin. Incubar no gelo por 30 min.
    2. Armazenar a -80 °C.

3. Prepare slides de vidro revestidos de poliacrilamida e coverslips (modificados de Lau et al.45)

  1. Carregue novos slides de vidro e cobres de vidro em recipientes correspondentes. Submergir os slides e coverslips em 1% v / v detergente em água DI e, em seguida, ferver a água no microondas.
  2. Sonicate os slides e coverslips por 5 minutos e, em seguida, enxaguar com água DI para remover detergente.
  3. Submergir e sonicate os slides e coverslips em etanol por 5 minutos Enxágüe com água DI.
  4. Submergir e sonicate os slides e coverslips em 100 mM potássio hidróxido (KOH) para 5 min. Enxágüe com água DI.
  5. Incubar os slides e coverslips em uma solução silane (1% de ácido acético e 0,5% 3-(trimexisilyl) metionlato de propyl em etanol) por 15 minutos e depois enxaguar com água DI.
  6. Incubar os slides e coverslips em solução de acrilamida (2% w/w acrilamida, 0,7 mg/mL de amônio persulfato e 0,0035% v/v tetrametiletilediamina em água DI) por ≥3 h.
  7. Armazenar os slides e coverslips na solução de acrilamida.

4. Prepare fluidos ativos baseados em kinesin, baseados em MT

  1. Prepare fluidos ativos (modificados de Sanchez et al.19).
    NOTA: As seguintes etapas demonstram o processo de preparação de 100 μL de um fluido ativo usando estoques de exemplo. O volume final é escalável, e as concentrações dos estoques de exemplo podem ser ajustadas enquanto a concentração final de cada componente for mantida.
    1. Misture 16,7 μL de 8 mg/mL MTs (passo 1.4.4) com 6,7 μL de 1,8 μM kinesin clusters motores (passo 2.4.2), e 1.1 μL de 500 mM DTT em M2B de sal alto (M2B + 3.9 mM MgCl2).
    2. Pacote MTs adicionando 11,4 μL de 7% w/w polietileno glicol (PEG).
    3. Ativar os motores de cinese adicionando 2,8 μL de 50 mM ATP.
    4. Mantenha as concentrações atp adicionando 2,8 μL de estoque pyruvate kinase/lactato dehydrogenase (PK/LDH) e 13,3 μL de 200 mM fosfenol pyruvate (PEP).
    5. Reduza o efeito de clareamento, adicionando 10 μL de 20 mM Trolox, 1,1 μL de 3,5 mg/mL catalase, 1,1 μL de 20 mg/mL glicose oxidase, e 1,1 μL de 300 mg/mL de glicose.
    6. Acompanhe o movimento do fluido adicionando 1,6 μL de partículas traçadoras de 0,025% v/v.
    7. Adicione m2b de alto sal para alcançar um volume total de 100 μL.
      NOTA: As ordens de mistura nos passos 4.1.1-4.1.6 são intercambiáveis. No entanto, uma vez ATP, MTs, e os motores são misturados, os motores começam a consumir ATP ao pisar ao longo das MTs. A amostra é ativada com uma vida finita devido aos combustíveis limitados (ATP e PEP), de modo que o experimento deve ser iniciado prontamente. O fluido ativo final deve conter 1,3 mg/mL MT, 120 nM kinesin clusters motores, 5,5 mM DTT, 0,8% w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2,8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/mL catalase, 0,22 mg/mL de glicose oxidase, 3,3 mg/mL de glicose e 0,0004% v/v colloid em M2B de sal alto.
  2. Prepare uma amostra em um canal de fluxo (modificado de Chandrakar et al.46):
    1. Lave um slide de vidro revestido de poliacrilamida e coverslip (passo 3,7) com água DI. Seque os óculos com ar pressurizado. Coloque em uma superfície limpa e plana.
    2. Corte duas tiras de filmes de cera com uma largura de 3 mm e o mesmo comprimento que o coverslip de vidro (20 mm). Insira as tiras entre o slide e coverslip como espaçadores de canal.
    3. Adere o vidro ao filme de cera, colocando o complexo de cera de vidro em uma placa quente de 80 °C para derreter a cera. Durante o derretimento, pressione o coverslip delicadamente com uma ponta da pipeta para aderir uniformemente a película da cera às superfícies de vidro. Após a adesão, arrefecer o complexo de vidro à temperatura ambiente.
    4. Carregue os fluidos ativos (passo 4.1) para o canal de fluxo. Selar o canal com cola UV.

5. Temperatura da amostra de controle

  1. Construir uma configuração de controle de temperatura (modificado a partir de projetos em Lowensohn et al. e Wu et al.47,48,49).
    1. Prepare um bloco de resfriamento de alumínio.
      1. Moa uma placa de alumínio com dimensões de aproximadamente 30 mm × 30 mm × 5 mm.
      2. Perfurar um canal interno através da placa(Figura 3A)e instalar acessórios mangueira no canal termina.
      3. Engancha cada encaixe a um tubo de água.
      4. Ligue um tubo a uma bomba de tanque de peixes em um reservatório de água enquanto estende o outro tubo até o reservatório.
        NOTA: A bomba circulará a água do reservatório através dos canais internos de alumínio para manter a temperatura do bloco em aproximadamente a temperatura ambiente.
    2. Fio um refrigerador termelétrico (TEC) e um termosensor a um controlador de temperatura. Conecte o controlador a um computador usando uma porta USB(Figura 3B).
    3. Conecte o controlador de temperatura para uma fonte de alimentação de corrente direta (DC). Ligue o controlador, ligando o fornecimento de energia a uma tomada elétrica.
    4. Executar a configuração inicial do TEC seguindo o guia do fabricante do controlador. Teste a saída do TEC. Recomenda-se controlar o controlador de temperatura através de software fornecido pelo fabricante, permitindo a gravação de dados termosensores e manipulação mais fácil do controlador de temperatura.
    5. Identifique os lados de aquecimento e resfriamento do TEC.
    6. Anexe o lado de resfriamento do TEC no bloco de resfriamento (passo 5.1.1) usando pasta térmica.
    7. Anexe um disco de safira ao lado de aquecimento do TEC usando pasta térmica.
    8. A configuração está completa. A superfície de safira e o termosensor podem entrar em contato com uma amostra para resfriar e aquecer a amostra com base em sua temperatura e temperatura alvo.
      NOTA: Recomenda-se que o TEC e o bloco refrigerando tenham um furo central alinhado para a imagem latente as amostras usando a microscopia do brilhante-campo(figura 3C).
  2. Use a configuração de controle de temperatura para controlar a temperatura da amostra33.
    1. Monte a amostra para a configuração.
      1. Coloque a amostra de fluido ativo (passo 4.2.4) na superfície de safira com o lado da lâmina entrando em contato com a superfície.
      2. Fixe o slide de vidro com fita adesiva de papel.
      3. Anexar o termosensor para a superfície coverslip usando fita de cobre.
    2. Monte a configuração em um estágio de microscópio com o lado coverslip voltado para os objetivos. Por exemplo, em um microscópio invertido, o lado do coverslip deve enfrentar para baixo. Proteger a configuração com fita de papel e os grampos de agulha de estágio do microscópio, se aplicável.
      NOTA: O estágio de temperatura apresentado deve trabalhar com microscópios comuns que são invertidos ou eretos. Para garantir que o estágio de temperatura não seja movido durante o experimento, é melhor garantir o estágio de temperatura para o estágio do microscópio com fita adesiva.
    3. Controlar a temperatura da amostra.
      1. Ligue o controlador de temperatura e bomba de tanque de peixes.
      2. Siga o guia do fabricante para definir a temperatura alvo e permitir o controle de temperatura. O controlador ajustará a potência de aquecimento ou resfriamento com base na temperatura alvo e na temperatura da amostra, conforme avaliado pelo termosensor.
    4. Recorde de temperaturas de amostra.
      1. Siga o guia do fabricante para registrar dados de temperatura do termosensor durante o experimento.
        NOTA: A temperatura da amostra deve agora ser controlada pelo controlador e gravada pelo computador(Figura 3D).

6. Caracterizar a atividade do fluido ativo (modificado a partir de métodos por Henkin et al. e Wu et al.20,27)

NOTA: As seções anteriores são usadas para preparar amostras de fluido ativo (seções 1-4) e controlar sua temperatura (seção 5). Demonstrar o uso da temperatura para controlar a atividade do fluido ativo, observar os comportamentos fluidos, analisar suas atividades e caracterizar sua resposta à temperatura.

  1. Monitore os traçadores.
    1. Imagem da amostra com um intervalo constante Δt usando proteína fluorescente verde (GFP) fluorescência para capturar o movimento das partículas traçadoras.
      NOTA: Δt deve ser escolhido para permitir que o movimento tracer a ser rastreado. Os valores de Δt grandes, tais como 100 s, conduzem a perder os trajectories tracer, visto que os valores curtos de Δt, tais como 0.1 s, impedem que o algoritmo de seguimento detecte o movimento do tracer entre frames. Um δt de trabalho deve permitir que o deslocamento tracer entre quadros para estar dentro de ~ 9 pixels. Para traçadores de imagem que se deslocam a 10 μm/s usando um objetivo 4x, o Δt é recomendado para ser 1-5 s.
    2. Salve as imagens como arquivos TIFF, nomeie os arquivos com base no número do quadro e armazene-os em uma pasta separada. Esses processos são necessários para garantir que as imagens adquiridas sejam corretamente analisadas com o script MATLAB fornecido (passo 6.2.2).
  2. Track traçadores adotando o software de rastreamento desenvolvido por Ouellette et al.50,51):
    1. Baixe o software de rastreamento do Laboratório de Complexidade Ambiental da Universidade de Stanford (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Certifique-se de que cada arquivo MATLAB está na mesma pasta.
    2. Rastrear traçadores usando um script Personalizado MATLAB: particle_tracking.m. O script lê imagens traçador (passo 6.1) e faixas tracer movimento usando o software de Ouellette et al.50,51. Ele produzindo dois arquivos: 1) background.tif, representando o fundo da imagem, e 2) Tracking.mat, contendo as trajetórias de partículas e velocidades em cada quadro(Figura 4A).
  3. Analise as velocidades médias do traçador usando um script Personalizado MATLAB: analysis.m. The script reads the tracking file (Tracking.mat) and outputs the mean speed of tracers vs. time, along with a time-averaged mean speed with specified averaging windows (Figure 4B)33.
  4. Record the time-averaged mean speed.
  5. Measure the time-averaged mean speed by repeating the experiment (steps 4, 5.2 and 6.1–6.4) at 10–40 °C. Use as velocidades médias registradas para traçar a velocidade média versus temperatura (Figura 4C)33.

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Representative Results

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Preparar os fluidos ativos orientados por quinesinas e MT requer ciinina e MTs. As MTs foram polimerizadas de tubulins rotuladas (etapas 1.3 e 1.4) que foram purificadas dos cérebros bovinos (passo 1.1, Figura 2A),seguidos de reciclagem para aumentar a pureza (passo 1.2, Figura 2B). As proteínas motoras de cinese foram expressas e purificadas de E. coli (passos 2.1 e 2.2, Figura 2B)41,52. A concentração do estoque de cinese preparado foi medida com um gel SDS comparando o brilho da banda principal com o de tubulins reciclados com concentrações conhecidas (passo 2.3, Inserção da Figura 2B). Os valores de brilho das bandas de tubina (B)foram linearmente aptos à sua concentração correspondente (C)usando a equação C = aB + ε, produzindo um = 3,1 × 10-2 mg/mL e = ε 8,7 × 10-4 mg/mL (Figura 2C). A equação ajustada foi usada para determinar a concentração de uma faixa de cinese aplicando o brilho medido da banda, Bk = 1.060, produzindo uma concentração de cinese ck = 0,95 mg/mL. Amostras de MT e cinesina com concentrações conhecidas foram utilizadas para preparar amostras de fluidoativo. Os fluidos ativos foram sintetizados, carregados em uma célula de fluxo revestida de poliacrilamida, e a célula foi selada com cola UV (seções 3 e 4)46.

Para demonstrar o controle da atividade de fluido ativo com a temperatura, a amostra de fluido ativo foi montada no estágio de temperatura caseira (passo 5.2, Figura 3A-C). A temperatura da amostra foi monitorada e controlada pelo controlador de acordo com um algoritmo de derivado proporcional-integral (PID)53. Amostras controladas a 10 °C, 20 °C, 30 °C e 40 °C pareciam flutuar em temperatura dentro de 0,1-0,3 °C por 4 h, demonstrando a estabilidade e confiabilidade dessa configuração de controle de temperatura(Figura 3D).

Para observar a amostra, a configuração foi montada em um microscópio de epifluorescência. A amostra foi dopada com traçadores com rótulo Alexa 488, que foram imageados com microscopia de fluorescência através de um canal GFP (passo 6.1). Os traçadores foram imaged cada Δt = 2 s. As imagens sequenciais permitidas para rastreamento de trajetórias traçadorr ri, onde eu representa o índice traçador (passo 6.2, Figura 4A). As trajetórias revelaram uma velocidade média v(t)<| ri(t) - ri(t- Δ t)|/Δt>I (passo 6.3). As velocidades médias medidas em 20-36 °C pareciam ser quase independentes no tempo = 0-2 h, enquanto que a 10 °C e 40 °C as velocidades médias deterioraram-se rapidamente (Figura 4B). A decadência a 10 °C foi causada pela despolimerização do MT abaixo de 16 °C. A decadência a 40 °C foi devido aos aglomerados de cinese funcionando mal acima de 36 °C. De acordo com nossos estudos anteriores, esses aglomerados motores de cinesesina perdem a capacidade de dirigir pares de MTs após a preincubação em >36 °C33. Para caracterizar as velocidades médias para cada temperatura, refletindo a decadência induzida por esses fatores, as velocidades médias foram médias entre t = 1-2 h (passos 6,3 e 6,4)33. As velocidades médias médias médias médias médias médias médias foram medidas entre 10 °C-40 °C (passo 6,5, Figura 4C). Abaixo de 16 °C e acima de 36 °C, as velocidades médias deterioraram-se rapidamente devido à despolimerização de MT e ao avaria de cienina33,enquanto o aumento das temperaturas de 16 °C para 36 °C acelerou as velocidades médias de 4 a 8 μm/s, demonstrando a viabilidade de ajustar a velocidade média de um fluxo de fluido ativo usando temperatura. Para demonstrar ainda mais a capacidade do controle de temperatura, as temperaturas do sistema foram alternadas entre 20 °C e 30 °C a cada 30 min. As velocidades médias dos fluidos ativos não só acelerar amada e desacelerar em conformidade, mas eles também responderam à mudança de temperatura dentro de 10 s (Figura 5). Uma resposta tão reversível e rápida do fluido ativo demonstra a capacidade de trabalho do uso da temperatura para controlar dinamicamente as atividades fluidas.

Figure 1
Figura 1: Introdução de fluidos ativos 3D baseados em kinesin, baseados em MT. (A)Esquemas de interfilamento deslizando. Pares de MTs anti-paralelos foram empacotados por depletantes e separados por aglomerados de motores. (B) Os aglomerados de motores conduziram coletivamente pares de MTs, levando os pacotes MT a se estenderem. (C) Os feixes de extensile constituíam um gel ativo baseado em MT (verde) que mexeu o líquido circundante para induzir um fluxo. Para rastrear o fluxo, o líquido foi dopado com traçadores (vermelho). Este número foi adaptado de Bate et al.33. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Imagens de géis SDS das purificações de tubulina e cinese. Imagemde um gel SDS de tubulina purificada. Imagemde um gel SDS de tubulins reciclados e cinese purificada. As pistas da esquerda para a direita eram padrões proteicos, em branco, 1,25-0,25 mg/mL de tubulins reciclados, em branco e estoque de cinese. C) A concentração de cinese purificada foi determinada comparando o brilho da banda com as bandas sequenciais de tubulins com concentrações medidas (retângulos vermelhos e azuis tracejados no início). O brilho de cada faixa foi medido pelo sonação dos valores de pixels dentro de uma imagem de banda cortada. Para reduzir o ruído de fundo, antes de cortar a imagem do gel foi transferida para tons de cinza, preto e branco invertido, e, em seguida, contrastado para revelar um fundo preto (inserção). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Configuração de controle de temperatura. (A)Esquemas do bloco de alumínio para a configuração de controle de temperatura. O bloco contém um canal interno para que a água flua através dele e leve o calor gerado pelo TEC. O buraco central permite que a amostra seja iluminada pela microscopia de campo brilhante de um lado e imagemcom um objetivo do outro lado. (B) Esquemas da configuração de controle de temperatura. A pasta térmica de silício é aplicada entre o bloco de resfriamento de alumínio e o TEC e entre o TEC e o disco de safira. Imagemde uma amostra montada no estágio de temperatura controlada. Os tubos de água são conectados a uma bomba imersa em um reservatório de água. (D)Temperaturas amostrais registradas versus tempo para temperaturas-alvo 10 °C, 20 °C, 30 °C e 40 °C, respectivamente. As temperaturas da amostra foram mantidas em temperaturas com uma flutuação de 0,1-0,3 °C. B e D foram adaptados de Bate et al.33. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: O líquido ativo de ajuste flui através da temperatura. (A)Traçadores de imagem (pontos brancos) permitidos para rastrear as trajetórias de fluxo sequencialmente (curvas coloridas diversas). Os traçadores foram monitorados a cada 5 s (Δt = 5 s) à temperatura ambiente (~20 °C). (B) Tracer média velocidade versus tempo em 10 °C, 20 °C, 30 °C, 36 °C e 40 °C, respectivamente. (C)Tracer média velocidade versus temperatura. Cada ponto representa a velocidade média do traçador médio durante as primeira s horas e a segunda. Abaixo de 16 °C, as MTs depolimeradas, e acima de 36 °C, os aglomerados de cinesina funcionaram mal. Portanto, a temperatura de trabalho é entre 16-36 °C, onde as velocidades médias variaram de 4-8 μm/s. As barras de erro representam o desvio padrão das velocidades médias médias médias médias médias médias. B e C foram adaptados de Bate et al.33. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: Alternando a velocidade de fluxo de fluidos ativos alternando periodicamente a temperatura do sistema. Mudar a temperatura entre 20 °C e 30 °C a cada 30 min acelerou e desacelerou velocidades de fluxo repetidamente, demonstrando o controle local das atividades de fluidoativo com a temperatura. Este número foi adaptado de Bate et al.33. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

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Controlar a matéria ativa in situ abre a porta para a auto-organização direcionada da matéria ativa4,5,24,28,54. Neste artigo, apresentamos um protocolo para o uso da temperatura para controlar os fluidos ativos in situ baseados em quinesina e MT, com base na característica arrhenius do sistema29,30,31. Como o sistema é à base de proteínas, manter a funcionalidade proteica ao longo do experimento é fundamental para aplicar com sucesso o protocolo. As principais proteínas do sistema são MTs e aglomerados de cinese. O primeiro depoliniza abaixo de 16 °C e o último mau funcionamento acima de 36 °C33. Manter a temperatura do sistema entre 16-36 °C é, portanto, vital para que os fluidos ativos desenvolvam dinâmicas estáveis e permitam sua resposta à temperatura de forma reversível(Figura 4 e Figura 5). No entanto, a temperatura é controlada com base em um algoritmo PID, que tende a ultrapassar a temperatura alvo53. Para reduzir essa superação, recomendamos definir várias temperaturas de alvo intermediário antes de definir a temperatura alvo final. Por exemplo, para aquecer a amostra da temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) a 35 °C, em vez de definir a temperatura alvo diretamente em 35 °C, recomendamos uma temperatura-alvo intermediária de 30 °C para reduzir a chance de que a temperatura aumenta acima de 36 °C, o que prejudicaria irreversivelmente as proteínas33. Da mesma forma, ao resfriar a amostra da temperatura ambiente para ~16 °C, recomenda-se definir uma temperatura-alvo intermediária de 18 °C, porque antes de atingir um estado estável, o PID pode resfriar a amostra abaixo de 16 °C, despoliminizando as MTs33.

O método de controle de temperatura apresentado depende de resfriamento e aquecimento usando um TEC. O uso do TEC garante que a amostra atinja a temperatura alvo em segundos, enquanto uma configuração convencional de controle de temperatura usando um banho de água com temperatura controlada leva minutos para atingir a temperatura desejada (Figura 5)55. O TEC gera calor líquido não zero que é dissipado por um sistema interno de circulação de água de alumínio. Entretanto, a água permite que o molde cresça, que obstruirá eventualmente a canaleta56. Um canal entupido inibe o fluxo de água, e o calor se acumulará no bloco de alumínio, eventualmente derretendo os tubos de água. Os tubos derretidos fazem com que a água derrame sobre o microscópio e a câmera, danificando os instrumentos eletrônicos. Portanto, para adotar a configuração de controle de temperatura apresentada, recomendamos a adição de 0,1% de peróxido de hidrogênio à água para inibir o crescimento do molde57,58,59. Esperamos que esta etapa garanta que o canal interno de alumínio permaneça sem entupimento e evite danos causados pela água em dispositivos eletrônicos próximos.

Manipular a temperatura, revestir as superfícies das células de fluxo com poliacrilamida e sintetizar fluidos ativos são três passos críticos para perceber isso no fluido ativo controlado pelo in situ. No entanto, esta controlabilidade é limitada à faixa de temperatura onde as proteínas envolvidas podem funcionar normalmente. No sistema de fluidoativo, as proteínas primárias são MTs e aglomerados de cinese, que funcionam normalmente entre 16-36 °C33. Dentro desta faixa de temperatura, os fluidos ativos variam suas velocidades médias de fluxo de 4-8 μm/s (Figura 4C). As velocidades médias fora desse intervalo estão além do limite do método de controle apresentado. Em contraste, Ross et al. relataram uma alternativa que permite que as atividades de fluido ativo sejam ligadas e desligadas usando luz28. O controle de luz também permite ativar fluidos ativos em uma escala de 50 μm de limite opticamente definido. No entanto, tal alternativa requer modificar a estrutura da cinese, juntamente com a afinação de um caminho óptico em um microscópio. Em comparação, as vantagens de adotar o método apresentado neste artigo são 1) os fluidos ativos não precisam ser redesenhados, 2) os microscópios não precisam ser modificados, 3) a configuração de controle de temperatura é de baixo custo e fácil de usar, e 4) o método é transferível para outros sistemas dependentes da temperatura, como o assay29,30,32, 32 ou mais geralmente baseados emenzimas. Esperamos também que o método apresentado abra a porta para a concepção de sistemas microfluídicos onde os fluxos de canais são controlados localmente sem válvulas.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Plasmid K401-BCCP-H6 foi um presente do Dr. Zvonimir Dogic. Esta pesquisa foi apoiada pelo fundo start-up do Dr. Kun-Ta Wu no Worcester Polytechnic Institute. Agradecemos ao Dr. Zvonimir Dogic pelos protocolos para purificar e rotular a tubulina e sintetizar fluidos ativos. Somos gratos ao Dr. Marc Ridilla por sua experiência em expressão e purificação de proteínas. Agradecemos ao Dr. William Benjamin Roger por nos ajudar na construção do estágio de temperatura controlada. Reconhecemos Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) para uso da Unidade de Materiais Biológicos (BMF). Reconhecemos a Royal Society of Chemistry para adaptar os números de Bate et al. em Soft Matter33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

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References

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Controlando as velocidades de fluxo de fluidos ativos 3D baseados em microtúbulos usando temperatura
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Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).More

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