Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Контроль скорости потока microtubule основе 3D активных жидкостей с использованием температуры

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

Целью этого протокола является использование температуры для управления скоростью потока трехмерных активных жидкостей. Преимущество этого метода не только позволяет регулировать скорость потока на месте, но и позволяет динамический контроль, такие как периодические настройки скорости потока вверх и вниз.

Abstract

Мы представляем метод использования температуры для настройки скорости потока кинезина, основанной на микротрубах трехмерных (3D) активных жидкостей. Этот метод позволяет для настройки скорости на месте без необходимости производства новых образцов для достижения различных желаемых скоростях. Кроме того, этот метод позволяет динамическое управление скоростью. Велоспорт температура приводит жидкости течь быстро и медленно, периодически. Эта управляемость основана на характеристике Arrheus реакции кинезин-микротрубуле, демонстрируя контролируемый средний диапазон скорости потока 4-8 мкм/с. Представленный метод откроет дверь к конструкции микрофлюидных устройств, где скорость потока в канале локально настраивается без необходимости клапана.

Introduction

Активная материя отличается от обычной пассивной материи из-за его способности преобразовывать химическую энергию в механическую работу. Материал, обладающий такой способностью, может состоять из живых или неживых существ, таких как бактерии, насекомые, коллоиды, зерна и цитоскелетные нити1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Эти материальные сущности взаимодействуют со своими соседями. В более широком масштабе они самоорганизуются либо в турбулентные вихри (активная турбулентность), либо материальные потоки11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Понимание самоорганизации активной материи привело к различным применениям в молекулярных челноках, оптических приборах и параллельных вычислениях21,22,23. Для того, чтобы довести приложения до следующего уровня, требуется контроль, выходящие за рамки самоорганизации. Например, Palacci et al. разработали гематит-инкапсулированный коллоид, самоходный только при воздействии управляемого вручную синего света, что привело к появлению живых кристаллов24. Морин и др. установили контроль прокатки коллоиды Квинке с помощью настраиваемого внешнего электрического поля, в результате чего коллоидные стекаются в ипподроме, как канал25. Эти предыдущие работы демонстрируют роль местного контроля в приложениях и продвигают базу знаний активной материи.

В этой статье мы сосредоточимся на управляемости 3D-активных жидкостей на основе кинезина, микротубулы (МТ). Эти жидкости состоят из трех основных компонентов: МТ, молекулярных двигателей кинезина и истощения. Истощение индуцирует силу истощения в связке МТ, которые позже преодолены моторными кластерами. Эти двигатели ходить по MTstoward плюс конец. Когда пара мостовых MTsis антипараллельный, соответствующие двигатели ходить в противоположных направлениях. Тем не менее, двигатели связаны в кластере и не в состоянии ходить друг от друга, поэтому они совместно скольжения друг от друга пары MTs (интерфиламета скольжения, рисунок 1A). Эти скользящие динамики накапливаются, вызывая пучки MTsto продлить до достижения их пряжки точки нестабильности и перерыв (расширяющиеся расслоения, Рисунок 1B)26. Сломанные пучки запечатываются силой истощения, которая впоследствии расширяется снова, и динамика повторяется. В процессе повторяющейся динамики движения расслоения перемешивают близлежащую жидкость, вызывая потоки, которые могут быть визуализированы допингом с микрон-шкалой трассеров(рисунок 1C). Sanchez et al. и Henkin et al. охарактеризовали средние скорости трассировок, обнаружив, что скорости были tunable путем изменения концентраций аденозинтрифосфата (АТФ), истощения, моторных кластеров, и MTs19,27. Однако такая настройка существовала только до активного синтеза жидкости. После синтеза, настройка была потеряна, и жидкости самоорганизованы по-своему. Для контроля активности активной жидкости после синтеза, Ross.et al. сообщил метод с использованием светоактивированной димеризации моторных белков, что позволяет жидкости активность налажена и выключается с помощью света28. В то время как контроль света удобен с точки зрения локальной активации жидкостей, метод требует реорганизации структур моторных белков, наряду с изменением оптических путей в микроскопе. Здесь мы предоставляем простой в использовании метод локального контроля потоков жидкости без изменения микроскопа, сохраняя при этом структуру двигателя нетронутой.

Наш метод локальной настройки активного потока жидкости основан на законе Arrhenius, потому что реакция кинезин-МТ, как сообщается, увеличивается с температурой29,30,31,32. Наши предыдущие исследования показали, что температурная зависимость от средней скорости активного потока жидкости следовала уравнению Arrhenius: v a exp(-Ea/RT),где A является предварительно экспоненциальным фактором, R является газовой постоянной, Eявляется энергия активации, а T - температура системы33. Таким образом, активность жидкости чувствительна к температурной среде, и температура системы должна быть последовательной, чтобы стабилизировать производительность двигателя, и, следовательно, скорость потока жидкости34. В этой статье мы демонстрируем использование температурной зависимости двигателя для непрерывной настройки скорости потока активных жидкостей путем регулировки температуры системы. Мы также демонстрируем подготовку образца активной жидкости, а затем монтаж образца на стадии микроскопа, температура которого контролируется с помощью компьютерного программного обеспечения. Повышение температуры с 16 градусов по Цельсию до 36 градусов по Цельсию ускоряет средние скорости потока от 4 до 8 мкм/с. Кроме того, настройка обратима: постоянное повышение и снижение температуры последовательно ускоряет и замедляет поток. Продемонстрированный метод применим к широкому кругу систем, где основные реакции подчиняются закону Arrhenius, таким как MT скольжения анализ29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка МТ

ПРЕДЕКТО: На этом этапе мы очищаем тубулины от ткани мозга крупного рогатого скота. Мозг крупного рогатого скота может вызвать вариант болезни Крейтцфельдта-Якоба (vCJD)35. Таким образом, отходы мозга и связанные с ними решения, бутылки и пипетки советы должны быть собраны в биоотходный мешок и утилизировать в качестве биоопасных отходов в соответствии с правилами учреждения.

  1. Очистите тубулины от бычьего мозга (изменено из Castoldi et al.36).
    1. Транспорт примерно 1,5 кг свежих мозгов крупного рогатого скота из местной скотобойни в университетской холодной комнате. Во время транспортировки храните мозги в фосфатном буфере (20 мМ2PO4,150 мМ NaCl, рН 7.2) на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимизировать окончательный выход тубулина, начальное количество функционального тубулина в свежей ткани мозга является ключевым. Свежие мозги содержат более функциональный тубулин. Чтобы получить самые свежие мозги с скотобойни, мы рекомендуем попросить мясника предоставить мозги от самых недавно забитых коров. Мозгдолжен не должен быть старше 3 ч при начале процедуры, так как сокращение времени между убоями и началом процедуры приведет к лучшим урожаям.
    2. Гомогенизировать и прояснить мозг.
      1. Очистите мозг с помощью скальпелей, чтобы разрезать кровеносные сосуды и соединительную ткань на более мелкие кусочки и удалить их из мозга вручную.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные мозги должны быть розовыми.
      2. Погрузите очищенную ткань мозга в 1 л буфера деполимеризации (DB: 50 мМ 2-(N-морфино) этанесульфоновой кислоты, 1 мМ CaCl2, рН 6,6) на килограмм мозга.
      3. Гомогенизировать мозг с помощью кухонного блендера.
      4. Центрифугиговый гомогенизированный раствор мозга при 10 000 х г и 4 кв. м в течение 150 мин.
    3. Полимеризация МТ (первая полимеризация).
      1. Соберите и смешайте супернатант с равными объемами следующих растворов при 37 градусах Цельсия: глицерол, буфер ВЫСОКОй молярности PIPES (HMPB: 1 M PIPES, 10 мМ MgCl2,20 мМ этиленгликоль-бис (З-аминоэхил эфир)-N, N, N,N', N',N'-тетраацетика кислота
      2. Добавьте в смесь 1,5 мМ АТФ и 0,5 мм гуанозина трифосфата (GTP).
      3. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
    4. Деполимеризация МТ (первая деполимеризация МТ).
      1. Пеллет МТ по центрифугированию на 151 000 х г и 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
      2. Откажитесь от супернатанта и отрепримет каждый мэтр в 10 мл 4 КС DB.
      3. Инкубировать на льду 30 мин.
      4. Агитировать смесь каждые 5 минут с кончиком пипетки, чтобы избежать mt осадки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь должна стать ясной в 30 мин, что указывает на завершение мт деполимеризации.
    5. Полимеризация МТ (вторая мт полимеризация).
      1. Уточните раствор, центрифугиваем на уровне 70 000 х г и 4 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
      2. Соберите и смешайте супернатант с равными объемами в 37 глицерол и HMPB.
      3. Добавьте в смесь 1,5 мМ АТС и 0,5 мм GTP.
      4. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    6. Повторите шаг 1.1.4, заменив HMPB буфером перезагрузки Бринкли (BRB) 80 (80 мм) PIPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, pH 6.8), затем уточнив очищенную смесь путем центрифугирования на 79 000 х г и 4 кв.
    7. Соберите супернатанта. Измерьте абсорбцию 280 нм с помощью спектрометра. Определить концентрацию тубулина с использованием закона Пиво-Ламберт (коэффициент вымирания тубулина: 1,15 (мг/мл)-1см-1)37,38.
    8. Храните белок при -80 градусах По Цельсию.
  2. Переработка тубулинов (модифицированных из Castoldi et al.36).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения чистоты тубулина, очищенный тубулин полимеризуется и снова деполимеризуется.
    1. Полимеризуйте МТ путем смешивания очищенного тубулина (шаг 1.1.7) с 500 мкм дитиотрийтол (DTT) и 20 ММ GTP, а затем 30 мин инкубации при 37 градусах Цельсия.
    2. Пелле МТ.
      1. Загрузите 1 мл глоцероловой подушки (80 мм труб, 1 мМ МГКл2,1 мМ EGTA, 60% v/v glycerol, pH 6.8) в нижней части центрифужной трубки.
      2. Положите полимеризованные МТ на верхней части подушки.
      3. Центрифуга при 172 000 х г в течение 90 мин при 37 градусах По цельсию.
    3. Деполимеризуется МТ.
      1. Снимите супернатант и подушку.
      2. Отдохните каждый мт-гранулвой в 150 qL 4 C MT буфера (M2B: 80 мм PIPES, 2 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, рН 6.8).
      3. Инкубировать смесь на льду в течение 30 мин.
      4. Агитировать смесь с пипеткой отзыв каждые 5 минут. Смесь должна быть ясной.
    4. Уточните смесь путем центрифуга на 172000 х г и 4 кв кв 30 мин.
    5. Соберите супернатанта. Измерьте концентрацию белка. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
  3. Пометьте тубулин флуоресцентным красителем39.
    1. Полимеризуйте MTs. Смешайте очищенный тубулин (шаг 1.1.7) с 500 МКм DTT и 16.7 мкм GTP, и инкубировать смесь при 37 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
    2. Пелле МТ.
      1. Поместите 1 мл из 37 градусов по Цельсию высокой рН подушки (0,1 М NaHEPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 60% v/v глицерол, рН 8.6) в центрифуге трубки.
      2. Положите полимеризованные МТ на подушку.
      3. Центрифуга при 327 000 х г в течение 50 мин при 37 градусах По цельсию.
    3. Этикетка тубулин.
      1. Отрептируйте каждый мт-гранулы с 700 qL из 37 C маркировки буфера (0,1 М NaHEPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ EGTA, 40% v/v глицерол, рН 8,6).
      2. Смешайте подвеску с 10-20 молярным избытком дальневосточного флуоресцентного красителя, функционализированного с секвинимидиль-эфиром.
      3. Инкубировать смесь при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут в темноте, чтобы позволить MTs реагировать с эфиром флуоресцентного красителя.
      4. Остановите реакцию маркировки, насыщая эфир подтяжного красителя 50 мМ К-глютаматом, инкубируя в течение 5 мин при 37 градусах Цельсия.
    4. Пеллетка с маркировкой MTs: Повторите шаг 1.3.2, замена подушки с высоким рН с низкой рН-подушкой (трубы 80 мМ, 2 мМ MgCl2,1 мМ EGTA, 60% v/v глицерол, рН 6.8).
    5. Деполимеризу MTs.
      1. Отбросьте супернатант и подушку.
      2. Приостановите гранулы в 700 qL 4 C M2B.
      3. Инкубировать подвеску на льду.
      4. Агитировать каждые 5 минут с кончиком пипетки, пока решение не ясно.
    6. Уточните очищенный раствор путем центрифуга на 184000 x g и 4 c для 35 мин.
    7. Повысить чистоту помеченного тубулина раствором, повторив шаги 1.2.1-1.2.4.
    8. Измерьте концентрацию белков и флуоресцентного красителя. Используйте эти измерения для определения концентрации тубулина и фракций маркированного тубулина, определяемого как соотношение концентраций флуоресцентного красителя к тубулину.
    9. Храните маркированный раствор тубулина при -80 градусах По Цельсию.
  4. Полимеризация MTs (принята от Санчес ат.д. 19):
    1. Смешайте переработанный тубулин (шаг 1.2.5) с помеченным тубулином (шаг 1.3.9) в соотношении, которое дает 3% помеченную фракцию тубулина.
    2. Смешайте смесь тубулина 8 мг/мл с 1 мм DTT и 0,6 мм гуанозина-5'(я)-метилено-трифосфат (GMPCPP), а затем 30 мин инкубации при 37 градусах Цельсия.
    3. После инкубации, anneal MTs при комнатной температуре в темноте в течение 6 ч.
    4. Aliquot и хранить при -80 градусах по Цельсию.

2. Синтезировать кластеры кинезина

ПРИМЕЧАНИЕ: Бактерии существуют повсеместно и могут расти в средствах массовой информации и загрязнять процесс подготовки. Для предотвращения загрязнения, действия, связанные с контактом с клеточной культуры (например, пипетка) должны быть выполнены вблизи пламени. Такие инструменты, как колбы, пипетки, пипетки советы, средства массовой информации, и пластины должны быть autoclaved перед использованием.

  1. Экспресс кинезинные двигатели в Escherichia coli40.
    1. Преобразуйте клетки.
      1. Пипетка 1 кЛ плазмида K401-BCCP-H6 в 10 зл компетентных клеток.
      2. Инкубировать на льду в течение 5 мин.
      3. Тепло-шок при температуре 42,5 градуса по Цельсию на 45 с.
      4. Инкубировать клетки на льду в течение 2 мин, чтобы позволить восстановление.
      5. Смешайте клетки с 300 л без антибиотиков 2XYT (5 г/л NaCl, 10 г/л дрожжевого экстракта, 16 г/л триптона).
      6. Инкубировать клетки при 37 градусах по Цельсию на 1 ч.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Если не указано, мониторинг роста клеток не требуется во время инкубации.
    2. Прививать пластины средств.
      1. Распространение клеточной культуры на 2XYT пластины (10 г/L NaCl, 5 г / л дрожжевой экстракт, 10 г / л триптон, 15 г / l агар, 100 мкг /мЛ ампициллин, 25 мкг/мЛ хлорамфеникол).
      2. Инкубировать тарелку вверх дном при 37 градусах Цельсия на ночь.
    3. Прививать жидкие носители.
      1. Из ночной тарелки собираем одну изолированную колонию с наконечником пипетки.
      2. Вывешить наконечник в колбу, содержащую 50 мл 2XYT.
      3. Инкубировать и встряхнуть культуры средств массовой информации при 37 градусах Цельсия и 200 об/мин в течение 12-16 ч.
    4. Расширьте ячейки.
      1. Смешайте 2,5 мл клеточной культуры в 500 мл 2XYT.
      2. Инкубировать и встряхнуть 500 мл культуры при 37 градусах Цельсия и 250 об/мин в течение 3-6 ч.
    5. Индуцировать экспрессию белка.
      1. Во время инкубации, контролировать рост клеток путем измерения абсорбции на 600 нм, используя 2XYT в качестве эталона. Измерьте абсорбцию каждые 60 минут, пока он не достигнет OD600 и 0.3. Затем измерьте абсорбцию каждые 30 минут, пока он не достигнет 0,5-0,6.
      2. Позвольте клеткам расти до тех пор, пока абсорбция не достигнетOD 600 и 0,5-0,6
      3. Добавьте 24 мкг/мл биотина и 1 мМ изопропила -D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) к клеточной культуре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: IPTG используется для индуцирования белковой экспрессии кинезиновых двигателей, которые помечены биотин карбоксил несущим белком (BCCP) и шестью гистидинами (H6). Тег H6 используется в процессе очистки (шаг 2.2), в то время как BCCP связывается с добавленными молекулами биотина для биотинилата выраженных кинезинных двигателей.
      4. Инкубировать и встряхнуть клеточной культуры при 20 градусах Цельсия и 250 об/мин в течение 12-20 ч.
    6. Урожай клеток центрифуги при 5000 х г и 4 кв 10 мин. Отбросьте супернатант. Храните пеллеты для клеток при -80 градусах Цельсия.
  2. Очистите кинезин моторный белок (изменен от Spriestersbach et al.41):
    1. Приостановить пеллеты ячейки (шаг 2.1.6) с равным объемом буфера лисиса (50 мМ PIPES, 4 мМ MgCl2, 50 ММ АТФ, 10 мМ 2-меркаптоэтанол (ММ), 20 мМ имидазол, рН 7,2), затем добавление одной таблетки ингибитора протеазы, 2 мг фенилметилсульсила фтора (PMSF), и 2 мг лизозима.
    2. Лизет клетки путем флэш-замораживания в жидком азоте (LN) 3x и оттаивания клеточной смеси.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После лизирования смесь должна стать вязкой.
    3. Уточните лизинированную клеточную смесь путем центрифугации на 230000 х г и 4 кв 30 мин.
    4. Соберите супернатант и протечь его через гравитационную колонку, а затем промыть колонну с 10 мл буфера лисиса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белки с тегом H6, такие как кинезин K401-BCCP-H6, должны оставаться в столбце.
    5. Унижай текучее белок с 5 мл элюционного буфера (50 мм ТРУБ, 4 мМ ММ MgCl2,50 мкм АТФ, 500 мм имидазол, рН 7.2). Соберите поток через последовательно в 1 мл фракций. Чтобы определить белково-содержащие фракции, смешайте 3 злицы каждой фракции с 100 злителем трифенилметанового красителя. Белково-содержащие фракции должны посинеть. Смешайте эти фракции и разбавьте в 5 раз с буфером излишний.
    6. Сосредоточьтесь на белковом растворе.
      1. Загрузите раствор в центробежную фильтровальную трубку.
      2. Центрифуга при 3000 х г в течение 10 мин при 4 градусах По цельсию.
      3. Встряхните трубку осторожно и центрифуга снова, пока объем раствора не будет lt;3 mL.
    7. Измерьте концентрацию белка с помощью спектрометра (коэффициент вымирания: 0,549 (мг/мл)-1см-1)42,43. Разбавить белок до 1 мг/мл, добавляя 35% сахарозы w/v.
    8. Хранить при -80 градусах по Цельсию.
  3. Измерьте концентрации кинезина с помощью геля электрофорезис (изменено от Taylor et al.44).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения концентрации кинезина с электрофорезом гель, тубулин является идеальной лестницей концентрации из-за его высокой чистоты и его измеримой концентрации через спектрометр (Рисунок 2А)36.
    1. Подготовка проб тубулина с концентрациями 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 и 1,25 мг/мл л. Смешайте 15 л каждого образца тубулина и кинезин (шаг 2,2,8) отдельно с 5 qL образца буфера (200 мм Tris-HCl, 8% сульфат атрия dodecyl (SDS), 400 мМ DTT, 0,2% бромофенол синий, 40% глицерол, pH 6.8) и incubate на 90.
    2. Приготовьте электрофорез.
      1. Запереть гель электрофореза в коробку для геля.
      2. Заполните коробку бегущим буфером (50 мМ MOPS, 50 мм Tris базы, 0,1% SDS, 1 мМ этилэндениаминатетацетической кислоты (EDTA), рН 7,7).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что уровень буфера находится выше верхнего отверстия геля.
    3. Загрузите 10 qL стандартной лестницы протеина, образца tubulin, и образца кинезина в отдельные колодцы и нанесите 200 V через гель на 45 мин.
    4. Гель окрашивание.
      1. Инкубировать и накачивать гель вареным (приблизительно 95 градусов по Цельсию) пятновом раствором А (0,5 г/л трифенилметана красителя, 10% v/v уксусной кислоты, 25% изопропанола) в течение 5 мин, затем промыть гель деионированной (DI) водой.
      2. Повторите с пятном растворы B (0.05 г/L трифенилметана красителя, 10% v/v уксусной кислоты, 10% изопропанол), C (0.02 г/l трифенилметана красителя, 10% v/v уксусной кислоты), последовательно. Инкубировать и рок гель в воде DI на ночь.
    5. Сканирование геля. Преобразуйте изображение геля в серое изображение, за которым следует черно-белая инверсия и контрастное повышение, чтобы выявить яркие белковые полосы на черном фоне.
    6. Измерьте яркость каждой полосы, подводя значения пикселей. Примените линейную подгонку C и aB q b, где B является яркость полосы тубулина, C является соответствующей концентрацией, и a и b являются подходящими параметрами. Определите концентрацию кинезина Ck с помощью яркости кинезина полосы Bk для расчета линейного уравнения: Ck q aBk q b.
  4. Кластер кинезин двигателей.
    1. Смешайте 1,5 мкм кинезин (шаг 2.2.8) с 120 МКм DTT и 120 нм стрептавидин. Инкубировать на льду 30 мин.
    2. Хранить при -80 градусах по Цельсию.

3. Подготовка полиакриламидов покрытием стеклянные слайды и крышки (изменено из Лау и др.45)

  1. Загрузите новые стеклянные горки и стеклянные крышки в соответствующие контейнеры. Погрузите горки и крышки в 1% v/v моющее средство в воде DI, а затем кипятите воду в микроволновой печи.
  2. Сножай горки и крышки в течение 5 мин, а затем промыть с DI воды для удаления моющего средства.
  3. Погрузите и снопевите горки и крышки в этаноле в течение 5 мин. Промыть с водой DI.
  4. Погрузите и смягчить горки и крышки в гидроксидкали калия 100 мм (KOH) в течение 5 мин. Промыть с водой DI.
  5. Инкубировать горки и крышки в силановый раствор (1% уксусной кислоты и 0,5% 3-(триметоксизил) пропил метакрилат в этаноле) в течение 15 мин, а затем промыть водой DI.
  6. Инкубировать слайды и крышки в растворе акриламида (2% w/w акриламид, 0,7 мг/мл амгармония persulfate, и 0.0035% v/v tetramethylethylenediamine в воде DI) для 3 h.
  7. Храните слайды и крышки в растворе акриламида.

4. Подготовка кинезин-управляемых, Mt основе активных жидкостей

  1. Подготовка активных жидкостей (изменено из Санчес и др.19).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги демонстрируют процесс подготовки 100 зл активной жидкости с использованием примера запасов. Окончательный объем масштабируется, и концентрации запасов примера могут быть скорректированы до тех пор, пока сохраняется окончательная концентрация каждого компонента.
    1. Смешайте 16,7 л из 8 мг/мл МТ (шаг 1,4,4) с 6,7 л из 1,8 км кинезина моторных кластеров (шаг 2,4,2), и 1,1 л 500 мМ DTT в высокосолевой M2B (M2B 3,9 мМ МГК2).
    2. Комплект MTs, добавив 11,4 л 7% г/w полиэтиленгликоль (PEG).
    3. Активируйте кинезинные двигатели, добавляя 2,8 л 50 мМ АТП.
    4. Поддерживайте концентрацию АТФ, добавляя 2,8 л запасов пирувате киназы/лактата дигидрогеназы (PK/LDH) и 13,3 л 200 мм фосфенол пирувате (PEP).
    5. Уменьшите эффект фотоотбелевания, добавив 10 кл. 20 мМ Trolox, 1,1 л 3,5 мг/мл каталазы, 1,1 л 20 мг/мл оксидаза глюкозы, и 1,1 л глюкозы 300 мг/мл глюкозы.
    6. Отслеживайте движение жидкости, добавляя 1,6 л 0,025% v/v частиц трассировщика.
    7. Добавьте высокосолевой M2B, чтобы достичь общего объема в 100 л.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заказы на смешивание в шагах 4.1.1-4.1.6 взаимозаменяемы. Однако, как только ATP, MTs, и двигатели смешиваются, двигатели начинают потреблять AtP при наступлении вдоль MTs. Образец активируется с ограниченным сроком службы из-за ограниченного вида топлива (АТФ и Pep), поэтому эксперимент следует начинать быстро. Конечная активная жидкость должна содержать 1,3 мг/мл МТ, 120 нм кинезиновых моторных кластеров, 5,5 мм ДТТ, 0,8% ж/ч ПЭГ, 1,4 мМ АТП, 2,8% v/v PK/LDH, 27 мМ ПЭП, 2 мМ Тролокс, 0,038 мг/мл каталазы, 0,22 мг/мЛ глюкозы оксидаза, 3,3 мг/мл глюкозы, и 0,0004% v/v colloid в высокой соли M2.
  2. Подготовьте образец в канале потока (изменено из Чандракара и др.46):
    1. Промыть полиакриламид покрытием стекла слайд и coverslip (шаг 3.7) с DI воды. Высушите стаканы под давлением. Место на чистой, плоской поверхности.
    2. Вырезать две полоски восковых пленок с шириной 3 мм и такой же длины, как стеклянный покрывало (20 мм). Вставьте полоски между слайдом и крышкой в качестве прокладки каналов.
    3. Придерживайтесь стекла к восковой пленке, поместив стеклянный воск овый комплекс на горячей пластине 80 градусов по Цельсию, чтобы расплавить воск. Во время плавления, нажмите coverslip мягко с пипеткой наконечник равномерно придерживаться восковой пленки на стеклянные поверхности. После сливки охладите стеклянный комплекс до комнатной температуры.
    4. Загрузите активные жидкости (шаг 4.1) в канал потока. Запечатать канал с УЛЬТРАВ-клей.

5. Контрольтемпературная температура образца

  1. Создайте установку контроля температуры (изменено из конструкций в Lowensohn и др. и Wu et al.47,48,49).
    1. Подготовьте алюминиевый охлаждающий блок.
      1. Мельница алюминиевая пластина с габаритами примерно 30 мм и 30 мм и 5 мм.
      2. Просверлите внутренний канал через пластину(рисунок 3A)и установите шланг фитинги на концах канала.
      3. Крюк каждой установки на воду трубки.
      4. Соедините одну трубку с насосом аквариума в водохранилище, расширяя другую трубку к резервуару.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Насос будет циркулировать воды резервуара через алюминиевые внутренние каналы для поддержания температуры блока при приблизительно комнатной температуре.
    2. Провод термоэлектрический охладитель (TEC) и термосенсор к регулятору температуры. Подключите контроллер к компьютеру с помощью USB-порта(рисунок 3B).
    3. Провода контроллера температуры к прямому току (DC) блок питания. Включите контроллер, подключив блок питания к электрической розетке.
    4. Выполните начальную настройку ТИК в соответствии с руководством производителя контроллера. Проверьте выход TEC. Рекомендуется контролировать температурный контроллер с помощью предоставленного производителем программного обеспечения, что позволяет термосенсорной записи данных и более легкого манипулирования контроллером температуры.
    5. Определите стороны нагрева и охлаждения ТИК.
    6. Прикрепите охлаждающую сторону ТИК к охлаждающей блоку (шаг 5.1.1) с помощью тепловой пасты.
    7. Прикрепите сапфировый диск к нагревательной стороне ТИК с помощью тепловой пасты.
    8. Настройка завершена. Поверхность сапфира и термосенсор могут контактировать с образцом, чтобы охладить и нагреть образец в зависимости от его температуры и целевой температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы TEC и охлаждающий блок имеют выровненное центральное отверстие для визуализации образцов с помощью ярко-поляной микроскопии(рисунок 3C).
  2. Используйте установку контроля температуры для управления температурой образца33.
    1. Установите образец к установке.
      1. Поместите образец активной жидкости (шаг 4.2.4) на поверхность сапфира, при этом сторона слайда прикасается к поверхности.
      2. Закрепите стеклянную горку бумажной лентой.
      3. Прикрепите термосенсор к поверхности крышки с помощью медной ленты.
    2. Установите установку на стадии микроскопа с стороны coverslip, обращенной к целям. Например, на перевернутом микроскопе сторона обкрытия должна лицом вниз. Закрепите установку с бумажной лентой и микроскопом этапи иглы зажимы, если это применимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный этап температуры должен работать с общими микроскопами, которые либо перевернуты, либо вертикально. Для того, чтобы в ходе эксперимента не было перенесено температурное время, лучше всего обеспечить температурную стадию к этапу микроскопа лентой.
    3. Контролируйте температуру образца.
      1. Включите контроллер температуры и насос аквариума.
      2. Следуйте руководству производителя, чтобы установить целевую температуру и включить контроль температуры. Контроллер будет регулировать нагревательную или охлаждающую мощность в зависимости от целевой температуры и температуры образца, оцениваемых термосенсором.
    4. Запись температуры образца.
      1. Следуйте руководству производителя для записи данных о температуре термосенса во время эксперимента.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Температура образца теперь должна контролироваться контроллером и записываться компьютером(рисунок 3D).

6. Характеризуй активную активность жидкости (измененную по методам Henkin et al. и Wu et al.20,27)

ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие разделы используются для подготовки образцов активной жидкости (разделы 1-4) и контроля их температуры (раздел 5). Чтобы продемонстрировать использование температуры для контроля активности активной жидкости, наблюдать за поведением жидкости, анализировать их деятельность и характеризовать их реакцию на температуру.

  1. Монитор трассировщиков.
    1. Изображение образца с постоянным интерваломt с использованием зеленого флуоресцентного белка (GFP) флуоресценции, чтобы захватить движение частиц трассировщика.
      ПРИМЕЧАНИЕ:t должны быть выбраны, чтобы позволить отслеживание движения трассировщика. Большиезначения, такие как 100 с, приводят к потере траекторий трассировщика, в то время как короткиезначения, такие как 0,1 с, не позволяют алгоритму отслеживания обнаруживать движение трассировщика между кадрами. Рабочийт должен позволить смещению трассировщика между кадрами в пределах 9 пикселей. Для следов изображений, движущихся со счетом 10 мкм/с с использованием 4x-цели,рекомендуется составить 1-5 с.
    2. Сохранить изображения в виде файлов TIFF, назовить файлы на основе номера кадра и хранить их в отдельной папке. Эти процессы необходимы для того, чтобы полученные изображения были правильно проанализированы с помощью предоставленного скрипта MATLAB (шаг 6.2.2).
  2. Трек трассаторы принятия отслеживания программного обеспечения, разработанного Ouellette и др.50,51):
    1. Скачать программное обеспечение для отслеживания из лаборатории экологической сложности Стэнфордского университета (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Убедитесь, что каждый файл MATLAB находится в одной папке.
    2. Отслеживайте трассы с помощью пользовательского скрипта MATLAB: particle_tracking.m. Скрипт читает изображения трассировщика (шаг 6.1) и отслеживает движение трассировщика с помощью программного обеспечения Ouellette et al.50,51. Он выводит два файла: 1) фон.tif, представляющий фон изображения, и 2) Tracking.mat, содержащий траектории частиц и скорости в каждом кадре (Рисунок 4A).
  3. Проанализируйте средние скорости трассировщика с помощью пользовательского скрипта MATLAB: analysis.m. Скрипт читает файл отслеживания (Tracking.mat) и выводит среднюю скорость трассеров по сравнению со временем, наряду со средней скоростью времени с указанными окнами усреднения (Рисунок 4B)33.
  4. Запись средней скорости, усредненные по времени.
  5. Измерьте среднее время, повторяя эксперимент (шаги 4, 5,2 и 6,1-6,4) при 10-40 градусах Цельсия. Используйте записанные средние скорости, чтобы построить средняя скорость против температуры (Рисунок 4C)33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Подготовка кинезин-управляемых, Mt основе активных жидкостей требует как кинезин и MTs. МТ были полимеризованы из маркированных тубулинов (шаги 1,3 и 1,4), которые были очищены от бычьего мозга (шаг 1.1, Рисунок 2A),а затем переработки для повышения чистоты (шаг 1.2, Рисунок 2B). Кинезин моторные белки были выражены и очищены от кишечной палочки (шаги 2.1 и 2.2, Рисунок 2B)41,52. Концентрация подготовленного запаса кинезина была измерена с помощью геля SDS путем сравнения яркости основной полосы с яркостью переработанных тубулинов с известными концентрациями (шаг 2.3, Рисунок 2B всет). Значения яркости полос тубулина(B) были линейно приспособлены к их соответствующей концентрации(C) используя уравнение C и aB, уступая 3.1 й 10-2 мг/мл и 8.7 й 10-4 мг/мл(Рисунок 2C). Приспособленное уравнение использовалось для определения концентрации кинезина, применяя измеренную яркость полосы, Bk 1,060, принося концентрацию кинезина Ck 0,95 мг/мл. Для подготовки образцов активной жидкости использовались образцы МТ и кинезина с известными концентрациями. Активные жидкости были синтезированы, загружены в полиакриламид покрытием потока ячейки, и клетка была запечатана с ультрафиолетовым клеем (разделы 3 и 4)46.

Чтобы продемонстрировать контроль активности активной жидкости с температурой, образец активной жидкости был установлен на домашней температурной стадии (шаг 5.2, рисунок 3A-C). Температура образца контролировалась и контролировалась контроллером в соответствии с пропорциональным интегральным производным (PID) алгоритмом53. Образцы, контролируемые при температуре 10 градусов по Цельсию, 20 градусов по Цельсию, и 40 градусов по Цельсию, как представляется, колеблются при температуре в пределах 0,1-0,3 градуса по Цельсию в течение 4 ч, демонстрируя стабильность и надежность этой установки контроля температуры(рисунок 3D).

Чтобы наблюдать за образцом, установка была установлена на эпифлюоресцентный микроскоп. Образец был допинг с Alexa 488-метки трассировки, которые были изображены с флуоресценции микроскопии через канал GFP (шаг 6.1). Трассоры были изображены каждыйй т 2 с. Последовательные изображения позволили для отслеживания трассирующих траекторий ri, где я представляю индекс трассировщика (шаг 6.2, Рисунок 4A). Траектории показали, средняя скорость v(т) гi(t) - гi(t-t) /tt Средние скорости, измеренные на уровне 20-36 градусов по Цельсию, оказались почти не зависят от времени при т 0-2 ч, в то время как при 10 градусах По Цельсию средняя скорость быстро разлагалась(рисунок 4В). Распад при 10 градусах Цельсия был вызван деполимеризацией МТ ниже 16 градусов по Цельсию. Распад при 40 градусах Цельсия был вызван неисправностью кинезиновых кластеров выше 36 градусов по Цельсию. Согласно нашим предыдущим исследованиям эти кинезинмоторные кластеры теряют способность управлять парами MTs после преинкубации на йgt;36 C33. Чтобы охарактеризовать средние скорости для каждой температуры, отражая распад, вызванный этими факторами, средние скорости были усреднены между т 1-2 ч (шаги 6,3 и 6,4)33. Средние средние скорости, средние по времени, измерялись между 10 градусами по Цельсию (шаг 6,5, рисунок 4С). Ниже 16 градусов по Цельсию и выше 36 градусов по Цельсию средние скорости быстро разлагались из-за деполимеризации МТ и неисправных скоплений кинезина33,в то время как повышение температуры от 16 градусов по Цельсию ускорило средние скорости от 4 до 8 мкм/с, демонстрируя возможность настройки средней скорости потока активной жидкости с использованием температуры. Для дальнейшего демонстрации возможностей контроля температуры, температура системы чередовалась между 20 и 30 градусов по Цельсию каждые 30 минут. Средние скорости активных жидкостей не только ускоряются и замедляются соответственно, но и реагируют на изменение температуры в течение 10 с(рисунок 5). Такая обратимая и быстрая реакция активной жидкости демонстрирует работоспособность использования температуры для динамического контроля за активностью жидкости.

Figure 1
Рисунок 1: Введение кинезина управляемых, Mt основе 3D активных жидкостей. (A) Схема межфильтра скольжения. Пары антипараллельных МТ были в комплекте с истощением и разъезжались моторными кластерами. (B) Моторные кластеры коллективно поехали пары MTs, ведущих MT расслоения продлить. (C) Расширяющиеся пучки представляют собой активный гель на основе МТ (зеленый), который перемешивал окружающую жидкость, чтобы вызвать поток. Чтобы отследить поток, жидкость была допинг с трассировками (красный). Эта цифра была адаптирована из Бейт и др.33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Изображения гелей SDS из тубулина и кинезина очистки. (A) Изображение геля SDS очищенного тубулина. (B) Изображение Гель SDS переработанных тубулинов и очищенного кинезина. Полосы слева направо были белковые стандарты, пустые, 1,25-0,25 мг/мл переработанных тубулинов, пустые и кинезинные бульоны. (C) Концентрация очищенного кинезина была определена путем сравнения яркости полосы с последовательными полосами тубулинов с измеренными концентрациями (красные и синие пунктирные прямоугольники во врезке). Яркость каждой полосы измерялась путем суммы значений пикселей в обрезанном изображении полосы. Чтобы уменьшить фоновый шум, перед обрезкой изображение геля было перенесено в серую, черно-белую перевернутую, а затем контрастно-увеличенную, чтобы показать черный фон (врез). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Установка контроля температуры. (A) Схема алюминиевого блока для установки контроля температуры. Блок содержит внутренний канал для воды, чтобы течь через него и унести TEC генерируемых тепла. Центральное отверстие позволяет освещать образец яркой полевой микроскопией с одной стороны и сизображением с целью с другой стороны. (B) Схема установки контроля температуры. Силиконовая термальная паста применяется между алюминиевым охлаждающим блоком и TEC и между TEC и сапфировым диском. (C) Изображение образца, установленного на контролируемой температурой стадии. Водопроводные трубы соединены с насосом, погруженным в водохранилище. (D) Записанная температура образца по сравнению с временем для целевых температур 10 градусов по Цельсию, 20 градусов по Цельсию, 30 градусов по Цельсию и 40 градусов по Цельсию, соответственно. Температура образца поддерживалась при температурах с колебаниями 0,1-0,3 градуса по Цельсию. B и D были адаптированы из Bate et al.33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Тюнинг активной жидкости течет через температуру. (A) Imaging трассировки (белые точки) позволило для отслеживания траектории потока последовательно (разноцветные кривые). Трассоры отслеживались каждые 5 с(т т й 5 с) при комнатной температуре (20 градусов по Цельсию). (B) Tracer средняя скорость по сравнению со временем в 10 градусов по Цельсию, 20 кв, 30 кв, 36 градусов по Цельсию, и 40 градусов по Цельсию, соответственно. (C) Tracer средняя скорость против температуры. Каждая точка представляет среднюю скорость трассировщика в течение первого и второго часов. Ниже 16 градусов по Цельсию MTs деполимеризации, и выше 36 градусов по Цельсию, кинезин кластеров неисправны. Таким образом, рабочая температура составляет от 16 до 36 градусов по Цельсию, где средняя скорость варьировалась от 4-8 мкм/с. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение средних скоростей, усредненные по времени. B и C были адаптированы из Bate et al.33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Чередование скорости потока активных жидкостей путем периодического изменения температуры системы. Переключение температуры между 20 и 30 градусов по Цельсию каждые 30 минут ускоренные и замедлило скорость потока неоднократно, демонстрируя местный контроль активной деятельности жидкости с температурой. Эта цифра была адаптирована из Бейт и др.33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Контроль активного вещества на месте открывает дверь для направленной самоорганизации активного вещества4,5,24,28,54. В этой статье мы представляем протокол для использования температуры для управления кинезин-управляемых, Mt основе активных жидкостей на месте, на основе Arrhenius характерные для системы29,30,31. Поскольку система основана на белке, поддержание функциональности белка на протяжении всего эксперимента является ключом к успешному применению протокола. Основными белками в системе являются МТ и кинезинные кластеры. Бывший деполимеризировать ниже 16 градусов по Цельсию, а второй неисправности выше 36 C33. Поддержание температуры системы между 16-36 градусами По Цельсию, таким образом, жизненно важно для активных жидкостей развивать устойчивую динамику и способствовать их реакции на температуру обратимо(рисунок 4 и рисунок 5). Тем не менее, температура контролируется на основе алгоритма PID, который имеет тенденцию к превышению целевой температуры53. Чтобы уменьшить этот перебор, мы рекомендуем установить несколько промежуточных целевых температур перед установлением конечной целевой температуры. Например, чтобы нагреть образец от комнатной температуры (примерно 20 градусов по Цельсию) до 35 градусов по Цельсию, вместо того, чтобы устанавливать целевую температуру непосредственно на уровне 35 градусов по Цельсию, мы рекомендуем промежуточную целевую температуру в 30 градусов Цельсия, чтобы уменьшить вероятность того, что температура повысится выше 36 градусов по Цельсию, что необратимо повредит белкам33. Аналогичным образом, при охлаждении образца от комнатной температуры до 16 градусов по Цельсию, рекомендуется установить промежуточную целевую температуру 18 градусов по Цельсию, потому что до достижения устойчивого состояния, PID может охладить образец ниже 16 градусов по Цельсию, деполимеризации МТ33.

Представленный метод контроля температуры опирается на охлаждение и отопление с помощью ТЭКа. Использование TEC гарантирует, что образец достигает целевой температуры в течение нескольких секунд, в то время как обычные настройки контроля температуры с использованием температуры контролируемой водяной бани занимает несколько минут, чтобы достичь желаемой температуры (Рисунок 5)55. ТЭК генерирует ненулевое чистое тепло, которое рассеивается алюминиевой внутренней системой циркуляции воды. Тем не менее, вода позволяет плесени расти, что в конечном итоге засорить канал56. Засоренный канал подавляет поток воды, и тепло будет накапливаться в алюминиевом блоке, в конечном итоге таяние водопроводных труб. Расплавленные трубки приводят к разливу воды через микроскоп и камеру, повреждая электронные приборы. Поэтому, чтобы принять представленную установку контроля температуры, мы рекомендуем добавить 0,1% перекиси водорода в воду, чтобы ингибировать рост плесени57,58,59. Мы ожидаем, что этот шаг обеспечит, чтобы алюминиевый внутренний канал остается засорять бесплатно и предотвратить повреждение воды близлежащих электронных устройств.

Манипулирование температурой, покрытие поверхностей клеток потока полиакриламидом и синтез активных жидкостей являются тремя важнейшими шагами к реализации этого в активной жидкости, контролируемой на месте. Тем не менее, эта управляемость ограничивается диапазоном температур, где участвующие белки могут нормально функционировать. В системе активной жидкости основными белками являются кластеры МТ и кинезин, которые нормально функционируют между 16-36 градусов по Цельсию33. В пределах этого диапазона температур активные жидкости изменяют их средние скорости потока от 4-8 мкм/с(рисунок 4C). Средние скорости за пределами этого диапазона находятся за пределами представленного метода управления. В отличие от этого, Росс и др. сообщили об альтернативе, которая позволяет для активной деятельности жидкости, которая будет включена и выключена с помощью света28. Контроль света также позволяет активировать активные жидкости в области оптически определяемой границы в 50 мкм. Однако такая альтернатива требует изменения структуры кинезина наряду с настройкой оптического пути в микроскопе. Для сравнения, преимущества принятия метода, представленного в этой статье 1) активные жидкости не должны быть переработаны, 2) микроскопы не должны быть изменены, 3) установка контроля температуры является недорогим и простым в использовании, и 4) метод передается другим температурно-зависимым системам, таким как планерированиеassay 29,30,32 илиболее ферментныхсистем. Мы также ожидаем, что представленный метод откроет двери для проектирования микрофлюидных систем, где потоки каналов контролируются локально без клапанов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Пласмид K401-BCCP-H6 был подарок от доктора Звонимира Догича. Это исследование было поддержано стартап-фондом доктора Кун-Та Ву в Вустерском политехническом институте. Мы благодарим доктора Звонимира Догича за протоколы по очистке и маркировке тубулина и синтезу активных жидкостей. Мы благодарны доктору Марку Ридилье за его опыт в области экспрессии и очищения белков. Мы благодарим доктора Уильяма Бенджамина Роджера за помощь в строительстве контролируемой температурой стадии. Мы признаем Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) для использования в Фонде биологических материалов (BMF). Мы признаем, Королевское общество химии для адаптации цифры из Бейт и др. на мягкая материя33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102 (2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114 (2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375 (2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470 (2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688 (2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1 (2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246 (2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564 (2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486 (2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601 (2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037 (2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102 (2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142 (2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102 (2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333 (1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006 (2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304 (2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Tags

Инженерия выпуск 153 биофизика кинезин микротрубу активные жидкости самоорганизация температура закон Arrhenius
Контроль скорости потока microtubule основе 3D активных жидкостей с использованием температуры
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney,… More

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter