המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש בטמפרטורה כדי לשלוט על מהירויות הזרימה של נוזלים פעילים תלת ממדיים. היתרון של שיטה זו לא רק מאפשר להסדיר מהירויות זרימה באתרו, אלא גם מאפשר בקרה דינמית, כגון מהירויות זרימה מעת לעת כוונון מעלה ומתחת.
אנו מציגים שיטה לשימוש בטמפרטורה כדי לכוונן את מהירויות הזרימה של הנוזלים הפעילים, תלת-ממדיים המבוססים על מיקרו-מימדי (3D). שיטה זו מאפשרת כוונון המהירויות באתרו ללא צורך לייצר דגימות חדשות כדי להגיע למהירויות רצויות שונות. כמו-כן, שיטה זו מאפשרת שליטה דינמית במהירות. רכיבה על הטמפרטורה מובילה את הנוזלים לזרום מהר ואיטי, מדי פעם. הישור הזאת מבוססת על המאפיין ארניוס של התגובה המיקרוכימית, הממחיש טווח מהירות מבוקר של זרימה של 4 – 8 μm/s. השיטה המוצגת תפתח את הדלת לעיצוב של התקנים microflu, היכן שקצבי הזרימה בערוץ מסוגלים להיות מקומיים ללא צורך בשסתום.
חומר פעיל מובחנים מחומר פסיבי קונבנציונאלי בשל יכולתה להמיר אנרגיה כימית לעבודה מכנית. חומר שבעל יכולת כזו יכול להיות מורכב מגופים חיים או שאינם חיים, כגון חיידקים, חרקים, colloids, דגנים, וחוטי ציטולדים1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. הישויות החומריות האלה. מאינטראקציה עם השכנים שלהם בקנה מידה גדול יותר, הם מסדרים את עצמם לתוך או מערבולות כמו הסוערת (מערבולת פעילה) או חומר זורם11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. הבנה של ארגון עצמי של חומר פעיל הובילה ליישומים שונים במעבורות מולקולריות, במכשירים אופטיים ובחישוב מקבילי21,22,23. כדי להביא את היישומים לרמה הבאה יש צורך בשליטה מעבר לארגון העצמי. לדוגמה, פאלאצ’י ואח ‘ פיתח קולואיד ממטיט שהיה ממונע עצמית רק כאשר הוא נחשף לאור כחול בשליטה ידנית, מה שהוביל להופעת קריסטלים חיים24. מורין ואח ‘ הקימה את השליטה בגלגול הcolloids של קוויק באמצעות שדה חשמלי חיצוני, והתוצאה היא שנוהרים לכאן בערוץ מסלול המרוצים, כמו25. עבודות קודמות אלה מדגימות את התפקיד של השליטה המקומית ביישומים ומקדמות את בסיס הידע של החומר הפעיל.
במאמר זה, אנו מתמקדים ישור של kinesin מונחה, מיקרוטוכדורית (MT) מבוססי נוזלים פעילים תלת-ממד. הנוזלים מורכבים משלושה מרכיבים עיקריים: MTs, מנועים מולקולריים ומתכלים. מרוקן לגרום כוח מחסור לצרור MTs, אשר מאוחר יותר מגשר על ידי אשכולות מנוע. המנועים האלה הולכים. לאורך הקצה החיובי כאשר זוג מגשר מ, המנועים המקבילים מסתובבים בכיוונים מנוגדים. עם זאת, המנועים מאוגדים באשכול ואינם יכולים להתפרק, ולכן הם בשיתוף זוגות בנפרד של MTs (הזזה בין פילמנט, איור 1א). אלה הדינמיקה הזזה להצטבר, גרימת צרורות של MTsto להאריך עד להגיע אי-יציבות הקריסה שלהם נקודה ושבור (extensile צרורות, איור 1B)26. הצרורות השבורים מופרים על ידי כוח המחסור, המשתרע לאחר מכן, והדינמיקה חוזרת. במהלך תהליך הדינמיקה החוזרת, תנועות הצרור מעוררות את הנוזל הסמוך, גורם לזרמים שניתן לדמיין באמצעות מטים מיקרון בקנה מידה (איור 1ג). סאנצ’ס ואח ‘ והנקין אל. אפיינו את מהירויות המשמעות של המשדרים, מציאת כי המהירויות היו שונות על ידי שינוי ריכוזי אדנוזין טריפוספט (ATP), מרוקן, אשכולות מנוע, ו MTs19,27. עם זאת, היכולת הזאת קיימת רק לפני סינתזה נוזל פעיל. לאחר הסינתזה, היכולת הייתה לאבד והנוזלים המאורגנים בדרכם. כדי לשלוט על פעילות הנוזל הפעיל לאחר סינתזה, Ross.et al. דיווחו על שיטה באמצעות הפעלת האור המופעל של חלבונים מוטוריים, המאפשר פעילות נוזלים להיות מכוון ולכבות באמצעות אור28. בעוד שבקרת האור נוחה במונחים של הפעלת הנוזלים באופן מקומי, השיטה מחייבת לעצב מראש את המבנים של החלבונים המוטוריים, יחד עם שינוי הנתיבים האופטיים במיקרוסקופ. כאן, אנו מספקים שיטה קלה לשימוש עבור שליטה מקומית זורם נוזלים ללא שינוי מיקרוסקופ תוך שמירה על מבנה המנוע ללא פגע.
השיטה שלנו לכוונון מקומי זרימה נוזל פעיל מבוסס על חוק arrhenius כי התגובה kinesin-MT כבר דווח להגדיל עם טמפרטורה29,30,31,32. מחקרים קודמים שלנו הראו כי התלות בטמפרטורה של מהירות ממוצע של זרימת נוזל פעיל עקב משוואת Arrhenius: v = exp (-EA/RT), כאשר הוא גורם טרום מעריכי , R הוא קבוע הגז , Ea היא אנרגיית ההפעלה, ו T היא טמפרטורת המערכת33. לכן, פעילות הנוזלים רגישה לסביבת הטמפרטורה, וטמפרטורת המערכת צריכה להיות עקבית כדי לייצב את הביצועים המוטוריים, וכתוצאה מכך מהירות זרימת הנוזלים34. במאמר זה, אנו מדגימים את השימוש בתלות הטמפרטורה של המנוע כדי לכוונן ברציפות את מהירויות הזרימה של נוזלים פעילים על-ידי התאמת טמפרטורת המערכת. אנו גם להדגים את ההכנה של דגימת נוזל פעיל, ואחריו לעלות את המדגם על הבמה מיקרוסקופ אשר הטמפרטורה נשלטת באמצעות תוכנת מחשב. הגדלת הטמפרטורה מ -16 ° c עד 36 ° c מאיץ את מהירויות הזרימה הממוצע בין 4 ל-8 μm/s. בנוסף, יכולת התנועה הפיכה: הגדלה והקטנה של הטמפרטורה ברצף מאיצה ומאטה את הזרימה. השיטה שהוראתה מתאימה למגוון רחב של מערכות בהן התגובות העיקריות מצייתות לחוק ארניוס, כגון שיטת הר הדאייה29,30,31,32.
שליטה על החומר הפעיל באתרו פותח את הדלת כדי לביים ארגון עצמי של חומר פעיל4,5,24,28,54. במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול עבור שימוש בטמפרטורה כדי לשלוט kinesin מונחה, MT מבוססי נוזלים פעילים באתרו, מבוסס על המאפיין …
The authors have nothing to disclose.
פלאממיד K401-בH6-במק הייתה מתנה מדוקטור זוונמיר דוכולינ. מחקר זה נתמך על ידי קרן ההפעלה של ד ר קון-טה וו במכון הפוליטכני של ווסטר. אנו מודים לד ר זוונמיר דויד עבור הפרוטוקולים לטיהור ולטובולין תוויות ולסנתז נוזלים פעילים. אנו אסירי תודה לד ר מארק ריגילה על המומחיות שלו בביטוי חלבונים וטיהור. אנו מודים לד ר ויליאם בנימין רוג’ר על שעזר לנו בבניית הבמה הנשלטת על-ידי טמפרטורה. אנו מכירים את ברנדייס MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) לשימוש במתקן החומרים הביולוגיים (BMF). אנו מכירים את האגודה המלכותית לכימיה על התאמת הנתונים מ Bate ואח ‘. על חומר רך33.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid | Sigma-Aldrich | 238813 | Trolox |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC216550050 | |
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 | HACH | 2074038 | Water tubes |
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window | Edmund Optics | 43-637 | Sapphire disc |
3M 1181 Copper Tape – 1/2 IN Width X 18 YD Length – 2.6 MIL Total Thickness – 27551 | R.S. HUGHES | 054007-27551 | Copper tape |
Acetic Acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1402-1 | |
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8937 | ATP |
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.) |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | UFC801024 | Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa |
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals | Fisher Scientific | ICN802829 | APS |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1760 | Ampicillin |
Antivibration Table | Nikon | 63-7590S | |
Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics | VWR | 90000-760 | Agar |
Biotin | Alfa Aesar | A14207 | |
Bucket-plastic white – 2 gallon | Bon | 84-715 | Water bucket |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 746495 | CaCl2 |
Catalase from bovine liver | Sigma-Aldrich | C40 | |
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj | Nikon | MRD00045 | 4x air objective |
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift | Nikon | 96372 | GFP filter cube |
CH-109-1.4-1.5 | TE Technology | CH-109-1.4-1.5 | Thermoelectric Cooler (TEC) |
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics | Fisher Scientific | C0378 | |
Cooling block | N/A | N/A | Custom milled aluminum |
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 | Bio-Rad | 1610400 | Triphenylmethane dye |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | D128 | DMSO |
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC165680050 | DTT |
DOWSIL 340 Heat Sink Compound | Dow | 1446622 | Thermal paste |
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE | Pharmco by Greenfield Global | 111000200CB05 | Ethanol |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E3889 | EGTA |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 798681 | EDTA |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone | Fisher Scientific | BP1421 | Tryptone |
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422 | Yeast extract |
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm | Polysciences | 18861 | Tracer particles |
Glucose Oxidase from Aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
GpCpp | Jena Bioscience | NU-405L | Guanosine-5′[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP) |
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater | Amazon | B07428NBCW | Copper wire |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
Hellmanex III | Sigma-Aldrich | Z805939 | Detergent |
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP410 | NaHEPES |
High performance blender machine | AIMORES | AS-UP1250 | Blender |
His GraviTrap | GE Healthcare | 11003399 | Gravity Column |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside |
Isopropyl Alcohol 99% | Pharmco by Greenfield Global | 231000099 | Isopropanol |
JA-10 rotor | Beckman Coulter | 369687 | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | G1501 | K-Glutamate |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich | L6876 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | MgCl2•6H2O |
MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M5057 | 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt |
MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid |
MP-3022 | TE Technology | MP-3022 | Thermocouple |
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics | Fisher Scientific | AC138450500 | TEMED |
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | E112352 | Spectrometer |
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope | Nikon | MEA54000 | |
Norland Optical Adhesive 81 | Norland Products | NOA81 | UV glue |
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard | Thermo Fisher Scientific | LC5800 | Protein standard ladder |
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | SDS gel |
Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 365672 | |
Parafilm PM996 Wrap , 4" Wide; 125 Ft/Roll | Cole-Parmer | EW-06720-40 | Wax film |
Pe 300 ultra Illumination System Single Band , 3mm Light Guide control Pod power supply |
Nikon | PE-300-UT-L-SB-40 | Cool LED Illuminator |
Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | 78830 | PMSF |
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% | BeanTown Chemical | 129745 | PEP |
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23200 | |
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets | Thermo Fisher Scientific | A32953 | |
PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 81300 | PEG. Average molecular weight 20,000 Da |
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | P250-500 | KOH |
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) | ThermoFisher Scientific | PS0300 | DC power supply of the gel box |
PS-12-8.4A | TE Technology | PS-12-8.4A | DC power supply of the temperature controller |
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma-Aldrich | P-0294 | PK/LDH |
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour | Amazon | B005JWA612 | Fish tank pump |
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells – Novagen | Millipore Sigma | 71403 | Competent cells |
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel | Amazon | B01MT6JZMR | Microwave for boiling the water |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Fisher Scientific | S271-500 | NaCl |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | SDS |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S8282 | NaH2PO4 |
Streptavidin Protein | Thermo Fisher Scientific | 21122 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
TC-720 | TE Technology | TC-720 | Temperature controller |
Tris Base, Molecular Biology Grade – CAS 77-86-1 – Calbiochem | Sigma-Aldrich | 648310 | Tris-HCL |
Type 45 Ti rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
Type 70 Ti rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Type 70.1 Ti rotor | Beckman Coulter | 342184 | |
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-916 | Paper tapes |
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 | VWR | 48366-227 | Glass coverslips |
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium | VWR | 75799-268 | Glass slides |
XCell SureLock Mini-Cell | ThermoFisher Scientific | EI0001 | Gel box |
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera | Nikon | ZYLA5.5-USB3 | Monochrome CCD camera |