Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

Kontrollere strømningshastigheter på Mikrotubulinettverket-basert 3D aktive væsker ved hjelp av temperatur

Published: November 26, 2019 doi: 10.3791/60484
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2
1Department of Physics, Worcester Polytechnic Institute, 2Department of Physics, Brandeis University

Summary

Målet med denne protokollen er å bruke temperatur for å kontrollere strømningshastigheter av tredimensjonale aktive væsker. Fordelen med denne metoden gir ikke bare mulighet for regulering av strømningshastigheter i situ, men gir også dynamisk kontroll, som periodisk tuning strømningshastigheter opp og ned.

Abstract

Vi presenterer en metode for bruk av temperatur for å justere strømnings hastighetene til kinesin, mikrotubulinettverket tredimensjonale (3D) aktive væsker. Denne metoden gjør det mulig å stille inn hastighetene i situ uten å måtte produsere nye prøver for å nå forskjellige ønskede hastigheter. Videre muliggjør denne metoden dynamisk kontroll av hastighet. Sykling temperaturen fører væskene til å flyte raskt og sakte, med jevne mellomrom. Denne kontrollerbarhet er basert på Arrhenius karakteristisk for den kinesin-mikrotubulinettverket reaksjonen, som viser et kontrollert strømnings hastighetsområde på 4 – 8 μm/s. Den presenterte metoden vil åpne døren til utformingen av mikrovæskebasert enheter der strømningshastigheter i kanalen er lokalt tunable uten behov for en ventil.

Introduction

Aktiv materie er differensiert fra konvensjonell passiv materie på grunn av sin evne til å konvertere kjemisk energi til mekanisk arbeid. Et materiale som besitter slik evne kan bestå av levende eller ikke-levende enheter som bakterier, insekter, Colloids, korn, og cytoskjelettkomponenter filamenter1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Disse materielle enhetene samhandle med sine naboer. I større skala, de selv-organisere enten turbulente-lignende virvlene (aktiv turbulens) eller materiale renn11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. En forståelse av egen organisering av aktiv materie har ført til ulike anvendelser innen molekylær transport, optiske enheter og parallell beregning21,22,23. Å bringe søknader til neste nivå krever kontroll utover selv-organisasjon. For eksempel, utviklet Palacci et al. en hematitt-innkapslet kolloid som selvgående bare når de utsettes for manuelt kontrollert blått lys, noe som førte til fremveksten av levende krystaller24. Morin et al. etablerte kontroll av rullende Kvinke Colloids ved hjelp av en tunable ekstern elektrisk felt, noe som resulterer i kolloidalt flokker i en veddeløpsbane-lignende kanal25. Disse tidligere verkene demonstrerer rollen som lokal kontroll i applikasjoner og fremme kunnskapsbasen av aktiv materie.

I denne artikkelen fokuserer vi på kontrollerbarhet av kinesin-drevne, mikrotubulinettverket (MT)-baserte 3D aktive væsker. Væskene består av tre hovedkomponenter: MTs, kinesin molekylære motorer og depletants. Depletants induserer en trykk kraft for å pakke inn MTs, som senere blir Brokoblet av motor klynger. Disse motorene går langs MTstoward pluss enden. Når et par av bro MTsis antiparallel, den tilsvarende motorene går i motsatt retning. Men motorene er bundet i en klynge og er ikke i stand til å gå fra hverandre, slik at de samarbeider skyve hverandre par av MTs (interfilament glidende, figur 1a). Disse glidende dynamikk akkumuleres, forårsaker bunter av MTsto forlenge til nå sine knekking ustabilitet punkt og Break (extensile bunter, figur 1B)26. Den ødelagte bunter er glødet av nedbryting kraft, som senere strekker seg igjen, og dynamikken gjenta. Under prosessen med gjentatt dynamikk, bunt bevegelsene røre den nærliggende væsken, inducing flyter som kan visualisere ved doping med mikron-skala Bevegelsesuskarphet (figur 1C). Sanchez et al. og Henkin et al. har karakterisert den gjennomsnittlige hastighet på bevegelsesuskarphet, finne at hastighetene ble tunable ved å variere konsentrasjonen av adenosin trifosfat (ATP), depletants, motor klynger, og MTS19,27. Men slike justeringsevne eksisterte bare før aktiv væske syntese. Etter syntese var justeringsevne tapt, og væskene selv-organisert på sin egen måte. For å kontrollere aktiv væske aktivitet etter syntese, Ross.et al. rapporterte en metode ved hjelp av lys aktivert dimerization av motor proteiner, slik at væske aktivitet skal stilles på og av ved hjelp av lys28. Mens lys kontroll er praktisk i form av lokalt aktivere væsker, krever metoden omstrukturere strukturene av motor proteiner, sammen med å endre de optiske banene i et mikroskop. Her gir vi en lett-å-bruke metode for lokalt kontrollerende væske strømmer uten mikroskop modifisering samtidig holde motoren strukturen intakt.

Vår metode for lokalt tuning aktiv væske strømning er basert på Arrhenius loven fordi kinesin-Mt reaksjonen har blitt rapportert å øke med temperatur29,30,31,32. Våre tidligere studier viste at temperaturen avhengighet av gjennomsnittlig hastighet på en aktiv væske strømning fulgt Arrhenius ligningen: v = A exp (-EA/RT), hvor en er en pre-eksponentiell faktor, R er gassen konstant, EA er aktiviseringen energi, og T er system temperaturen33. Derfor er væske aktivitet følsom for temperatur miljøet, og system temperaturen må være konsistent for å stabilisere motorytelsen, og følgelig er væske strømningshastigheten34. I denne artikkelen viser vi bruken av motorens temperatur avhengighet for å kontinuerlig tune strømnings hastighetene til aktive væsker ved å justere system temperaturen. Vi viser også utarbeidelsen av en aktiv væske prøve, etterfulgt av montering av prøven på et mikroskop scene der temperaturen styres via dataprogramvare. Ved å øke temperaturen fra 16 ° c til 36 ° c økes gjennomsnittlig strømningshastighet fra 4 til 8 μm/s. i tillegg er justeringsevne reversibel: gjentatte ganger økende og synkende temperaturen sekvensielt akselererer og bremser flyten. Den viste metoden gjelder for et bredt spekter av systemer der de viktigste reaksjonene adlyder Arrhenius lov, for eksempel Mt gliding analysen29,30,31,32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av MTs

FORSIKTIG: i dette trinnet renser vi tubulins fra storfe hjernevev. Storfe hjerne kan forårsake variant Creutzfeldt-Jakob sykdom (vCJD)35. Derfor bør hjernen avfall og relaterte løsninger, flasker og pipette tips samles i en Biowaste pose og kastes som biologisk farlige avfall i henhold til reglene i institusjonen.

  1. Rens tubulins fra storfe hjernen (modifisert fra Castoldi et al.36).
    1. Transport ca 1,5 kg av friske storfe hjerner fra et lokalt slakteri til et universitet kaldt rom. Under transport, Oppbevar hjernen i fosfat buffer (20 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 7,2) på is.
      Merk: for å maksimere den endelige avkastningen av tubulin, er den første mengden funksjonell tubulin i det friske hjernevevet nøkkelen. Friskere hjerner inneholder mer funksjonell tubulin. For å få de ferskeste hjerner fra slakteri, anbefaler vi å spørre slakteren å gi hjernen fra de nylig slaktet kyr. Hjerner bør ikke være eldre enn 3 h når du starter prosedyren, fordi redusere tiden mellom slakting og prosedyre Start vil gi bedre avkastning.
    2. Homogenisere og avklare hjernen.
      1. Rengjør hjernen ved å bruke skalpeller til å skjære blodkar og bindevev i mindre biter og fjerne dem fra hjernen for hånd.
        Merk: den rengjort hjernen skal være rosa.
      2. Dypp det rene hjernevevet i 1 liter depolymerisering buffer (DB: 50 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic yre, 1 mM CaCl2, pH 6,6) per kilo hjerne.
      3. Homogenisere hjernen med en kjøkken blender.
      4. Sentrifuger den homogenisert hjerne løsningen ved 10 000 x g og 4 ° c i 150 min.
    3. Polymeres MTs (første polymerisering).
      1. Samle og bland supernatanten med like volumer av følgende løsninger ved 37 ° c: glyserol, høy molaritet rør buffer (HMPB: 1 M rør, 10 mM MgCl2, 20 mm etylen glykol-BIS (β-aminoehyl Eter)-N, N, n ', N'-Tetraacetic acid [EGTA], pH 6,9)
      2. Tilsett 1,5 mM ATP og 0,5 mM guanosin trifosfat (GTP) i blandingen.
      3. Ruge blandingen ved 37 ° c i 1 time.
    4. Depolymerize MTs (første MT-depolymerisering).
      1. Pellet MT ved sentrifugering ved 151 000 x g og 37 ° c i 30 min.
      2. Kast supernatanten og resuspend hver MT pellet i 10 mL av 4 ° c DB.
      3. Ruge på isen i 30 minutter.
      4. Agitere blandingen hver 5 min med en pipette spissen for å unngå MT sedimentering.
        Merk: blandingen skal bli klar i 30 min, noe som indikerer fullføring av MT depolymerisering.
    5. Polymeres MTs (andre MT-polymerisering).
      1. Klargjør løsningen ved sentrifugering ved 70 000 x g og 4 ° c i 30 min.
      2. Samle og bland supernatanten med like volumer på 37 ° c glyserol og HMPB.
      3. Tilsett 1,5 mM ATP og 0,5 mM GTP til blandingen.
      4. Ruge blandingen ved 37 ° c i 30 min.
    6. Gjenta trinn 1.1.4, erstatte HMPB med Brinkley gjenoppbygging buffer (BRB) 80 (80 mM rør, 1 mM MgCl2, 1 mm EGTA, pH 6,8), etterfulgt av å avklare den ryddet blandingen av sentrifugering ved 79 000 x g og 4 ° c i 30 min.
    7. Samle supernatanten. Mål 280 NM absorbansen med en spektrometer. Bestem tubulin konsentrasjon ved hjelp av Beer-Lambert lov (utryddelse koeffisient av tubulin: 1,15 (mg/ml)-1cm-1)37,38.
    8. Oppbevar proteinet ved-80 ° c.
  2. Resirkuler tubulins (modifisert fra Castoldi et al.36).
    Merk: for å forbedre tubulin renhet, er renset tubulin polymerisert og depolymeriseres igjen.
    1. Polymeres MTs ved å blande renset tubulin (trinn 1.1.7) med 500 μM-dithiotreitol (DTT) og 20 μM GTP, etterfulgt av 30 min av inkubasjons ved 37 ° c.
    2. Pellet på MTs.
      1. Legg 1 mL glyserol pute (80 mM rør, 1 mM MgCl2, 1 mm EGTA, 60% v/v glyserol, pH 6,8) i bunnen av et sentrifugerør.
      2. Legg polymerisert MTs oppå puten.
      3. Sentrifuger ved 172 000 x g for 90 min ved 37 ° c.
    3. Depolymerize på MTs.
      1. Fjern supernatanten og puten.
      2. Resuspend hver MT pellets i 150 μL av 4 ° c MT buffer (M2B: 80 mM rør, 2 mM MgCl2, 1 mm EGTA, pH 6,8).
      3. Ruge blandingen på isen i 30 min.
      4. Agitere blandingen med en pipette spissen hver 5 min. Blandingen skal slå klart.
    4. Klargjør blandingen ved sentrifugering ved 172 000 x g og 4 ° c i 30 min.
    5. Samle supernatanten. Mål protein konsentrasjonen. Store ved-80 ° c.
  3. Merk tubulin med fluorescerende fargestoff39.
    1. Polymeres på MTs. Bland renset tubulin (trinn 1.1.7) med 500 μM DTT og 16,7 μM GTP, og ruge blandingen ved 37 ° c i 30 min.
    2. Pellet på MTs.
      1. Plass 1 mL 37 ° c høy pH-pute (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mm EGTA, 60% v/v glyserol, pH 8,6) til et sentrifugerør.
      2. Legg polymerisert MTs på puten.
      3. Sentrifuger ved 327 000 x g for 50 min ved 37 ° c.
    3. Merk tubulin.
      1. Resuspend hver MT pellets med 700 μL av 37 ° c merking buffer (0,1 M NaHEPES, 1 mM MgCl2, 1 mm EGTA, 40% v/v glyserol, pH 8,6).
      2. Bland suspensjonen med en 10-20 molar overkant av langt-rødt fluorescerende farge funksjonalisert med en succinimidyl Ester.
      3. Ruge blandingen ved 37 ° c i 30 minutter i mørket for å la MTs reagere med Ester av fluorescerende fargestoff.
      4. Stopp merkingen reaksjonen ved mette Ester av suspendere fargestoff med 50 mM K-glutamat, incubating i 5 min ved 37 ° c.
    4. Pellet merket MTs: Gjenta trinn 1.3.2, erstatte høy pH pute med lav pH pute (80 mM rør, 2 mM MgCl2, 1 mm EGTA, 60% v/v glyserol, pH 6,8).
    5. Depolymerize MTs.
      1. Kast supernatanten og puten.
      2. Resuspend pellet i 700 μL av 4 ° c M2B.
      3. Ruge suspensjonen på isen.
      4. Agitere hver 5 min med en pipette spissen til løsningen er klar.
    6. Klargjør den fjernede løsningen ved sentrifugering ved 184 000 x g og 4 ° c i 35 min.
    7. Forbedre renheten til den merkede tubulin løsningen ved å gjenta trinn 1.2.1 – 1.2.4.
    8. Mål konsentrasjonen av proteiner og fluorescerende fargestoff. Bruk disse målingene til å bestemme tubulin konsentrasjon og fraksjoner av merket tubulin, definert som forholdet mellom konsentrasjoner av fluorescerende fargestoff til tubulin.
    9. Oppbevar den merkede tubulin oppløsningen ved-80 ° c.
  4. Polymeres MTs (adoptert fra Sanchez et al.19):
    1. Bland den resirkulerte tubulin (trinn 1.2.5) med merket tubulin (trinn 1.3.9) i et forhold som gir en 3% merket tubulin brøk.
    2. Bland 8 mg/mL tubulin blanding med 1 mM DTT og 0,6 mM guanosin-5 ' [(α, β)-methyleno] trifosfat (GMPCPP), etterfulgt av 30 min av inkubasjons ved 37 ° c.
    3. Etter inkubasjons anneal du MTs ved romtemperatur i mørket i 6 timer.
    4. Alikvot og oppbevares ved-80 ° c.

2. syntetisere kinesin klynger

Merk: bakterier eksisterer overalt og kan vokse i Media og forurense forberedelsesprosessen. For å hindre forurensning, må handlinger som involverer kontakt med celle kulturene (f.eks. pipettering) utføres nær en flamme. Verktøy som flasker, Pipetter, pipette tips, Media og plater må autoklaveres før bruk.

  1. Express kinesin motorer i Escherichia coli40.
    1. Forvandle cellene.
      1. Pipetter 1 μL av K401-BCCP-H6 plasmider i 10 μL av kompetente celler.
      2. Ruge på isen i 5 min.
      3. Varme-sjokk ved 42,5 ° c for 45 s.
      4. Ruge cellene på isen i 2 min for å tillate utvinning.
      5. Bland cellene med 300 μL av antibiotika-fri 2XYT (5 g/L NaCl, 10 g/L gjærekstrakt, 16 g/L tryptone).
      6. Ruge cellene ved 37 ° c i 1 time.
        Merk: med mindre annet er spesifisert, er det ikke nødvendig å overvåke celleveksten under inkubasjons.
    2. Vaksinere plate Media.
      1. Spre celle kulturen på en 2XYT tallerken (10 g/L NaCl, 5 g/L gjærekstrakt, 10 g/L-tryptone, 15 g/L agar, 100 μg/mL Ampicillin, 25 μg/mL kloramfenikol).
      2. Ruge platen opp ned ved 37 ° c over natten.
    3. Vaksinere flytende medier.
      1. Fra natten plate, høste en isolert koloni med en pipette spissen.
      2. Løs ut tuppen i en kolbe som inneholder 50 mL 2XYT.
      3. Ruge og rist kultur mediene ved 37 ° c og 200 RPM for 12 – 16 timer.
    4. Utvid cellene.
      1. Bland 2,5 mL celle kulturen i 500 mL 2XYT.
      2. Ruge og rist 500 mL kultur ved 37 ° c og 250 RPM for 3 – 6 timer.
    5. Indusere protein uttrykk.
      1. Under inkubasjons, overvåke cellevekst ved å måle absorbansen ved 600 NM, med 2XYT som referanse. Mål absorbansen hver 60 min, til den når OD600 = 0,3. Deretter måles absorbansen hver 30 min til den når 0,5 – 0,6.
      2. La cellene vokse til absorbansen når OD600 = 0,5 – 0,6
      3. Tilsett 24 μg/mL biotin og 1 mM isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTH) til celle kulturen.
        Merk: IPTH brukes til å indusere protein uttrykk av kinesin motorer, som er merket med biotin kar bok syl carrier protein (BCCP) og seks histidines (H6). Den H6 koden brukes i rensing prosessen (trinn 2,2), mens BCCP binder seg til den ekstra biotin molekyler å biotinylate den uttrykte kinesin motorer.
      4. Ruge og rist celle kulturen ved 20 ° c og 250 RPM for 12 – 20 timer.
    6. Høste cellene ved sentrifugering ved 5 000 x g og 4 ° c i 10 min. kast supernatanten. Oppbevar celle pellets ved-80 ° c.
  2. Rens kinesin motor protein (modifisert fra Spriestersbach et al.41):
    1. Suspendere celle pellet (trinn 2.1.6) med et likt volum av lyseringsbuffer (50 mM rør, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 10 mm 2-Mercaptoethanol (βME), 20 mm Imidazole, pH 7,2), etterfulgt av å legge en tablett av protease inhibitor, 2 mg phenylmethyl sulfonyl FLUOR (PMSF), og 2 mg lysozyme.
    2. Lyse cellene ved blits frysing i flytende nitrogen (LN) 3x og tine celle blandingen.
      Merk: etter lysering skal blandingen bli tyktflytende.
    3. Klargjør lysert celle blanding ved å sentrifugering ved 230 000 x g og 4 ° c i 30 min.
    4. Samle supernatanten og flyt den gjennom en tyngdekraft kolonne, etterfulgt av vaske kolonnen med 10 mL av lyseringsbuffer.
      Merk: proteiner med en H6-kode, for eksempel kinesin K401-BCCP-H6, skal forbli i kolonnen.
    5. Eluatet det kodede proteinet med 5 mL eluering buffer (50 mM rør, 4 mM MgCl2, 50 μM ATP, 500 mm Imidazole, pH 7,2). Samle gjennomstrømning sekvensielt i 1 mL fraksjoner. For å bestemme proteinet som inneholder fraksjoner, bland 3 μL av hver brøk med 100 μL av triphenylmethane fargestoff. Den protein som inneholder fraksjoner skal bli blå. Kombiner disse fraksjonene og fortynne med 5x med lyseringsbuffer.
    6. Konsentrer protein løsningen.
      1. Last løsningen i et sentrifugal filter rør.
      2. Sentrifuger på 3 000 x g i 10 min ved 4 ° c.
      3. Rist røret forsiktig og sentrifuger igjen til løsnings volumet er < 3 mL.
    7. Mål protein konsentrasjonen med en spektrometer (utryddelse koeffisient: 0,549 (mg/ml)-1cm-1)42,43. Fortynne proteinet til 1 mg/mL mens du legger 35% w/v sukrose.
    8. Store ved-80 ° c.
  3. Mål kinesin konsentrasjoner med en elektroforese gel (modifisert fra Taylor et al.44).
    Merk: for å måle kinesin konsentrasjon med en elektroforese gel, er tubulin en ideell konsentrasjons stige på grunn av sin høye renhet og sin målbare konsentrasjon via en spektrometer (figur 2a)36.
    1. Klargjør tubulin prøver med konsentrasjoner på 0,25, 0,5, 0,75, 1,00 og 1,25 mg/mL. Bland 15 μL av hver tubulin prøve og kinesin prøve (trinn 2.2.8) separat med 5 μL av prøve buffer (200 mM Tris-HCl, 8% natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS), 400 mM DTT, 0,2% bromophenol blå, 40% glyserol, pH 6,8) og ruge ved 90 ° c i 3 min.
    2. Forbered elektroforese.
      1. Lås en elektroforese gel i gel-boksen.
      2. Fyll boksen med kjører buffer (50 mM MOPPER, 50 mM Tris base, 0,1% SDS, 1 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA), pH 7,7).
        Merk: Kontroller at buffernivået er over den øverste åpningen av gelen.
    3. Legg 10 μL av protein standard stige, tubulin prøver og kinesin prøve i separate brønner og påfør 200 V over gelen i 45 min.
    4. Gel flekker.
      1. Ruge og rock gelen med kokt (ca. 95 ° c) flekk oppløsning A (0,5 g/L triphenylmethane fargestoff, 10% v/v eddiksyre, 25% isopropanol) i 5 min, og skyll deretter gelen med deionisert (DI) vann.
      2. Gjenta med flekk oppløsninger B (0,05 g/L triphenylmethane fargestoff, 10% v/v eddiksyre, 10% isopropanol), C (0,02 g/L triphenylmethane fargestoff, 10% v/v eddiksyre) og D (10% v/v eddiksyre), sekvensielt. Ruge og rock gelen i DI vann over natten.
    5. Skann gelen. Konverter gel bildet til et gråtonebilde, etterfulgt av en svart og hvit inversjon og kontrast ekstrautstyr for å avdekke lyse protein band i svart bakgrunn.
    6. Mål lysstyrken for hvert bånd ved å summere pikselverdiene. Påfør den lineære passformen C = AB + b, der b er lysstyrken til et tubulin bånd, C er den tilsvarende konsentrasjonen, og a og b er passende parametre. Bestem konsentrasjonen av kinesin Ck ved å bruke lysstyrken på kinesin bånd Bk for å beregne den lineære ligningen: Ck = ABk + B.
  4. Cluster de kinesin motorene.
    1. Bland 1,5 μM kinesin (trinn 2.2.8) med 120 μM DTT-og 120 nM-streptavidin. Ruge på isen i 30 minutter.
    2. Store ved-80 ° c.

3. Forbered polyakrylamid-belagte glass sklier og coverslips (modifisert fra Lau et al.45)

  1. Legg nye glass lysbilder og glass coverslips i tilsvarende beholdere. Senk lysbildene og coverslips i 1% v/v vaskemiddel i DI vann og kok deretter vannet i en mikrobølgeovn.
  2. Sonikere lysbildene og coverslips i 5 min og skyll med DI vann for å fjerne vaskemiddel.
  3. Senk og sonikere lysbildene og coverslips i etanol i 5 min. skyll med DI vann.
  4. Senk og sonikere lysbildene og coverslips i 100 mM kalium natriumhydroksid (KOH) i 5 min. skyll med DI vann.
  5. Ruge lysbildene og coverslips i en silan løsning (1% eddiksyre og 0,5% 3-(trimethoxysilyl) propyl akrylat i etanol) i 15 min og skyll med DI vann.
  6. Ruge lysbildene og coverslips i akrylamid oppløsning (2% w/w akrylamid, 0,7 mg/mL ammonium persulfate, og 0,0035% v/v tetrametyletylendiamin i DI vann) for ≥ 3 t.
  7. Oppbevar lysbildene og coverslips i akrylamid-oppløsningen.

4. Forbered kinesin-drevne, MT-baserte aktive væsker

  1. Forbered aktive væsker (modifisert fra Sanchez et al.19).
    Merk: følgende trinn viser prosessen med å forberede 100 μL av en aktiv væske ved hjelp av eksempel aksjer. Det endelige volumet er skalerbart, og konsentrasjonene av eksempel lagrene kan justeres så lenge den endelige konsentrasjonen av hver komponent opprettholdes.
    1. Bland 16,7 μL av 8 mg/mL MTs (trinn 1.4.4) med 6,7 μL av 1,8 μM kinesin motor klynger (trinn 2.4.2) og 1,1 μL av 500 mM DTT i høy-salt M2B (M2B + 3,9 mM MgCl2).
    2. Bunt MTs ved å legge til 11,4 μL av 7% w/w polyetylen-glykol (PEG).
    3. Aktiver kinesin motorer ved å tilsette 2,8 μL av 50 mM ATP.
    4. Opprettholde ATP-konsentrasjonene ved å tilsette 2,8 μL av lager pyruvat kinase/melkesyre dehydrogenase (PK/LDH) og 13,3 μL av 200 mM phosphenol pyruvat (PEP).
    5. Reduser photobleaching effekt ved å tilsette 10 μL 20 mM Trolox, 1,1 μL av 3,5 mg/mL catalase, 1,1 μL av 20 mg/mL glukose oksidase og 1,1 μL av 300 mg/mL glukose.
    6. Spor bevegelsene til væsken ved å tilsette 1,6 μL av 0,025% v/v Tracer partikler.
    7. Tilsett høy-salt M2B for å oppnå et samlet volum på 100 μL.
      Merk: blande ordrene i trinn 4.1.1 – 4.1.6 er utskiftbare. Når ATP, MTs og motorene er blandet, begynner motorene imidlertid å forbruke ATP mens de tråkker langs MTs. Prøven er aktivert med en begrenset levetid på grunn av begrenset brensel (ATP og PEP), slik at eksperimentet skal startes raskt. Den endelige aktive væsken skal inneholde 1,3 mg/mL MT, 120 nM kinesin motor klynger, 5,5 mM DTT, 0,8% w/w PEG, 1,4 mM ATP, 2,8% v/v PK/LDH, 27 mM PEP, 2 mM Trolox, 0,038 mg/mL catalase, 0,22 mg/mL glukose oksidase, 3,3 mg/mL glukose, og 0,0004% v/v kolloid i høy-salt M2B.
  2. Forbered en prøve i en strømningskanal (modifisert fra Chandrakar et al.46):
    1. Skyll et polyakrylamid glass og dekkglass (trinn 3,7) med DI vann. Tørk glassene med trykkluft. Plasser på en ren, flat overflate.
    2. Klipp to strimler av voks filmer med en 3 mm bredde og samme lengde som glass dekkglass (20 mm). Sett inn stripene mellom lysbildet og dekkglass som kanal avstandsstykker.
    3. Fest glasset til voks filmen ved å plassere glass voks komplekset på en 80 ° c kokeplate for å smelte voksen. Under smelting, trykk dekkglass forsiktig med en pipette spissen til jevnt holde voks filmen til glassflater. Etter vedheft, avkjøles glass kompleks til romtemperatur.
    4. Last de aktive væskene (trinn 4,1) til strømnings kanalen. Forsegle kanalen med UV-lim.

5. Kontroller prøvetemperatur

  1. Bygg en temperaturkontroll oppsett (modifisert fra design i Lowensohn et al. og Wu et al.47,48,49).
    1. Forbered en aluminiums kjøle blokk.
      1. Mill en aluminiumsplate med dimensjoner på ca 30 mm × 30 mm × 5 mm.
      2. Bor en intern kanal gjennom platen (Figur 3A) og Monter slange beslag på kanal endene.
      3. Hook hver passer til et vannrør.
      4. Koble ett rør til en fisk tank pumpen i en vannreservoar mens utvide det andre røret til reservoaret.
        Merk: pumpen vil sirkulere reservoar vann gjennom aluminium interne kanaler for å opprettholde blokken temperaturen ved ca romtemperatur.
    2. Wire en termoelektrisk kjøler (TEC) og en termosensor til en temperatur kontroller. Koble kontrolleren til en datamaskin ved hjelp av en USB-port (Figur 3B).
    3. Koble temperatur kontrolleren til en likestrømforsyning (DC). Slå på kontrolleren ved å koble strømforsyningen til en stikkontakt.
    4. Utfør den første satt opp av TEC etter kontrolleren produsentens guide. Test det TEC produksjon. Det anbefales å kontrollere temperatur kontrolleren via programvare fra produsenten, slik at termosensor data opptak og enklere manipulering av temperatur kontrolleren.
    5. Identifiser oppvarming og kjøling sidene av TEC.
    6. Fest TEC ' s avkjølings side på kjøle blokken (trinn 5.1.1) ved hjelp av termisk pasta.
    7. Fest en safir disk til TEC ' s varme side ved hjelp av termisk pasta.
    8. Oppsettet er fullført. Safir overflaten og termosensor kan kontakte en prøve for å avkjøle og varme prøven basert på temperatur og mål temperatur.
      Merk: det anbefales at TEC og kjøle blokken har et justert sentralt hull for bildebehandling av prøvene med lyse felt mikroskopi (Figur 3C).
  2. Bruk temperaturkontroll oppsettet for å kontrollere prøvetemperatur33.
    1. Monter prøven til oppsettet.
      1. Plasser den aktive væsken prøven (trinn 4.2.4) på safir overflaten med Skyv side kontakter overflaten.
      2. Fest glassplaten med papir tape.
      3. Fest termosensor til dekkglass overflate ved hjelp av kobber tape.
    2. Monter oppsettet på et mikroskop-stadium med den dekkglass siden vendt mot målene. For eksempel, på et invertert mikroskop, den dekkglass side skal vende ned. Sikre oppsettet med papir tape og mikroskopet scenen nålen klemmer hvis aktuelt.
      Merk: den presenterte temperatur scenen skal fungere med felles mikroskop som er enten invertert eller oppreist. For å sikre at temperatur fasen ikke flyttes under eksperimentet, er det best å feste temperatur trinnet til mikroskop scenen med tape.
    3. Kontroller prøvetemperaturen.
      1. Slå på temperatur kontrolleren og fisken tank pumpen.
      2. Følg produsentens veiledning for å angi mål temperaturen og aktivere temperaturkontroll. Kontrolleren vil justere oppvarmings-eller kjøleeffekt basert på mål temperaturen og prøvetemperaturen, som vurdert av termosensor.
    4. Ta opp prøve temperaturer.
      1. Følg produsentens veiledning for å registrere termosensor temperaturdata under eksperimentet.
        Merk: prøvetemperaturen skal nå styres av kontrolleren og registreres av datamaskinen (Figur 3D).

6. karakterisere den aktive væsken aktivitet (modifisert fra metoder av Henkin et al. og Wu et al.20,27)

Merk: de forrige avsnittene brukes til å klargjøre aktive væskeprøver (avsnitt 1 – 4) og kontrollere temperaturen (del 5). For å demonstrere bruk av temperatur for å kontrollere aktiv væske aktivitet, observere væsken atferd, analysere sine aktiviteter, og karakterisere deres respons på temperatur.

  1. Overvåk Bevegelsesuskarphet.
    1. Bilde prøven med et konstant intervall Δt bruker grønt fluorescerende PROTEIN (GFP) fluorescens å fange bevegelsen av Tracer partikler.
      Merk: Δ skal ikke velges slik at sporings bevegelsen kan spores. Store Δt -verdier, for eksempel 100 s, resulterer i å miste sporings baner, mens korte Δt -verdier, for eksempel 0,1 s, hindrer sporings algoritmen i å oppdage sporings bevegelsen mellom rammer. En fungerende Δt bør tillate at sporings forskyvningen mellom rammene skal være innenfor ~ 9 piksler. For bilde Bevegelsesuskarphet som beveger seg på 10 μm/s ved hjelp av et 4X objektiv, er Δt anbefalt å være 1 – 5 s.
    2. Lagre bildene som TIFF-filer, navngi filene basert på bilde nummer, og lagre dem i en egen mappe. Disse prosessene er nødvendige for å sikre at de oppnådde bildene blir riktig analysert med MATLAB-skriptet som følger med (trinn 6.2.2).
  2. Track Bevegelsesuskarphet vedta sporing programvare utviklet av Ouellette et al.50,51):
    1. Last ned sporingsprogramvaren fra Environmental kompleksitet Laboratory, Stanford University (https://web.stanford.edu/~nto/software.shtml). Kontroller at hver MATLAB-fil er i samme mappe.
    2. Spor Bevegelsesuskarphet ved hjelp av en egendefinert MATLAB-skript: particle_tracking. m. Skriptet leser Tracer bilder (trinn 6,1) og sporer Tracer bevegelse ved hjelp av programvaren av Ouellette et al.50,51. Det utganger to filer: 1) Background. tif, som representerer bildet bakgrunnen, og 2) Tracking. mat, som inneholder partikkel baner og hastigheter i hver ramme (Figur 4A).
  3. Analysere sporings gjennomsnittet hastigheter ved hjelp av en egendefinert MATLAB skript: Analysis. m. Skriptet leser sporingsfilen (Tracking. mat) og utganger gjennomsnittlig hastighet på Bevegelsesuskarphet kontra tid, sammen med en tid-gjennomsnitt gjennomsnittlig hastighet med spesifiserte snitt Vinduer (Figur 4B)33.
  4. Registrere tid-gjennomsnitt gjennomsnittlig hastighet.
  5. Mål den gjennomsnittlige Gjennomsnittshastigheten ved å gjenta eksperimentet (trinn 4, 5,2 og 6.1 – 6.4) ved 10 – 40 ° c. Bruk de innspilte gjennomsnitts hastighetene til å plotte gjennomsnittlig hastighet kontra temperatur (Figur 4C)33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved å klargjøre de kinesin, MT-baserte aktive væskene, kreves både kinesin og MTs. MTs ble polymerisert fra merket tubulins (trinn 1,3 og 1,4) som ble renset fra storfe hjerner (trinn 1,1, figur 2A), etterfulgt av resirkulering for å forbedre renhet (trinn 1,2, figur 2B). Kinesin motor proteiner ble uttrykt i og renset fra E. coli (trinn 2,1 og 2,2, figur 2B)41,52. Konsentrasjonen av den preparerte kinesin aksjen ble målt med en SDS gel ved å sammenligne hoved bandet lysstyrken med at av resirkulert tubulins med kjente konsentrasjoner (trinn 2,3, figur 2B innfelt). Lysstyrkeverdiene til tubulin-båndene (B) var lineært tilpasset deres tilsvarende konsentrasjon (C) ved bruk av ligningen C = AB + ε, noe som gir en = 3,1 × 10-2 mg/ml og ε = 8,7 × 10-4 mg/ml (figur 2C). Den monterte ligningen ble brukt til å bestemme konsentrasjonen av et kinesin bånd ved å påføre den målte lysstyrken, Bk = 1 060, noe som gir en kinesin konsentrasjon på Ck = 0,95 mg/ml. MT og kinesin prøver med kjente konsentrasjoner ble brukt til å utarbeide aktive væskeprøver. De aktive væskene ble syntetisert, lastet inn i en polyakrylamid-belagt strømningscelle, og cellen ble forseglet med UV-lim (§ 3 og 4)46.

For å demonstrere kontroll over aktiv væske aktivitet med temperaturen, ble den aktive væsken prøven montert på hjemmelaget temperatur scenen (trinn 5,2, Figur 3A-C). Prøvetemperaturen ble overvåket og kontrollert av kontrolleren i henhold til en proporsjonal-Integral-derivat (PID) algoritme53. Prøver som er kontrollert ved 10 ° c, 20 ° c, 30 ° c og 40 ° c, viste seg å svinge i temperatur innen 0,1 – 0,3 ° c i 4 timer, og viser stabiliteten og påliteligheten til dette temperaturkontroll oppsettet (Figur 3D).

For å observere prøven ble oppsettet montert på et epifluorescence mikroskop. Prøven ble dopet med Alexa 488-merket bevegelsesuskarphet, som ble avbildet med fluorescens mikroskopi via en GFP kanal (trinn 6,1). Bevegelsesuskarphet ble avbildet hver Δt = 2 s. De sekvensielle bildene som er tillatt for sporing av Tracer baner ri, hvor jeg representerer Tracer index (trinn 6,2, Figur 4A). Den baner avdekket en gjennomsnittlig hastighet v(t) ≡ < | ri(t)- ri(t-Δt) |/Δt>i (trinn 6,3). Gjennomsnittshastigheten målt ved 20 – 36 ° c viste seg å være nesten tids uavhengig ved t = 0 – 2 timer, mens gjennomsnittlig hastighet på 10 ° c og 40 er raskt forfalt (Figur 4B). Forfallet ved 10 ° c ble forårsaket av MT depolymerisering under 16 ° c. Forfallet på 40 ° c skyldtes kinesin-klynger som ikke fungerer over 36 ° c. Ifølge våre tidligere studier mister disse kinesin motor klynger evnen til å kjøre par med MTs etter preinkubering ved > 36 ° c33. Å karakterisere gjennomsnittet hastigheter for hver temperatur mens reflekterer forfallet indusert av disse faktorene, gjennomsnittlig hastighet var gjennomsnitt mellom t = 1-2 h (trinn 6,3 og 6,4)33. Gjennomsnittlig Gjennomsnittshastighet på Gjennomsnittstid ble målt mellom 10 ° c – 40 ° c (trinn 6,5, Figur 4c). Under 16 ° c og over 36 ° c er Gjennomsnittshastigheten forfalt raskt på grunn av MT-depolymerisering og funksjonsfeil kinesin klynger33, mens økende temperaturer fra 16 ° c til 36 ° c akselererte Gjennomsnittshastigheten fra 4 til 8 μm/s, som viser muligheten for å stille inn gjennomsnittlig hastighet på en aktiv væskestrøm ved hjelp av temperatur. For ytterligere å demonstrere kapasiteten til temperatur kontrollen, ble system temperaturene vekslet mellom 20 ° c og 30 ° c hver 30 min. Gjennomsnitts hastighetene til de aktive væskene akselererer ikke bare og avta tilsvarende, men de reagerte også på temperaturendringen innen 10 s (figur 5). En slik reversibel og rask respons av den aktive væsken demonstrerer workability ved bruk av temperatur for å dynamisk kontrollere væske aktiviteter.

Figure 1
Figur 1: innføring av kinesin, MT-baserte 3D aktive væsker. (A) skjematisk av interfilament glidende. Parene av antiparallel MTs ble buntet av depletants og drevet fra hverandre av motor klynger. (B) motor klynger drev kollektivt par av MTS, som fører til at Mt pakker utvides. (C) extensile bunter UTGJORDE en Mt-basert aktiv gel (grønn) som rørte den omgivende væsken å indusere en flyt. For å spore flyten, ble væsken dopet med Bevegelsesuskarphet (rød). Dette tallet ble tilpasset fra Bate et al.33. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: bilder av SDS gels fra tubulin og kinesin renselser. (A) bilde av en SDS gel av renset tubulin. (B) bilde av en SDS gel av resirkulert tubulins og renset kinesin. Banene fra venstre til høyre var protein standarder, blank, 1,25 – 0,25 mg/mL resirkulert tubulins, blank og kinesin lager. (C) konsentrasjonen av renset kinesin ble bestemt ved å sammenligne bandets lysstyrke med sekvensielle bånd av tubulins med målte konsentrasjoner (røde og blå stiplede rektangler i innfelt). Lysstyrken til hvert bånd ble målt ved å summere pikselverdiene i et beskåret bånd bilde. For å redusere bakgrunnsstøyen, før beskjæring av gel bildet ble overført til gråtoner, svart-hvitt invertert, og deretter kontrast-forbedret for å avdekke en svart bakgrunn (innfelt). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: oppsett av temperaturkontroll. (A) skjematisk av aluminiums blokken for temperaturkontroll oppsettet. Blokken inneholder en intern kanal for vann å strømme gjennom den og bære bort TEC-generert varme. Den sentrale hullet gjør at prøven skal være opplyst av lyse feltet mikroskopi på den ene siden og avbildet med et mål på den andre siden. (B) skjematisk av temperaturkontroll oppsettet. Silicon Thermal pasta er anvendt imellom det aluminium avkjøling hindre og det TEC og imellom det TEC og det safir skiven. (C) bilde av en prøve som er montert på det temperaturstyrte stadiet. Vannrør er koblet til en pumpe nedsenket i et vannreservoar. (D) opptaksprøve temperaturer kontra tid for mål temperaturer på henholdsvis 10 ° c, 20 ° c, 30 ° c og 40 ° c. Prøve temperaturene ble opprettholdt ved temperaturer med en svingninger på 0,1 – 0,3 ° c. B og D ble tilpasset fra Bate et al.33. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: innstilling av aktiv væske strømmer via temperatur. (A) Imaging-Bevegelsesuskarphet (hvite prikker) som er tillatt for sporing av flyt baner sekvensielt (miscellaneously fargede kurver). Bevegelsesuskarphet ble overvåket hver 5 s (Δt = 5 s) ved romtemperatur (~ 20 ° c). (B) Tracer gjennomsnittlig hastighet kontra tid ved 10 ° c, 20 ° c, 30 ° c, 36 ° c, og 40 ° c, henholdsvis. (C) Tracer betyr hastighet vs. temperatur. Hvert punkt representerer gjennomsnittlig Tracer gjennomsnittlig hastighet i løpet av første og andre timer. Under 16 ° c MTs-depolymeriseres og over 36 ° c, kinesin klynger. Derfor er arbeidstemperaturen mellom 16 – 36 ° c, der gjennomsnittlig hastighet varierer fra 4 – 8 μm/s. Feilfeltene representerer standardavviket for gjennomsnittlig Gjennomsnittshastighet for tid. B og C er tilpasset fra Bate et al.33. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: veksler mellom strømningshastigheten til aktive væsker ved periodisk å veksle system temperaturen. Bytte av temperaturen mellom 20 ° c og 30 ° c hver 30 min akselerert og decelerated strømningshastighet gjentatte ganger, som viser lokal kontroll av aktive væske aktiviteter med temperaturen. Dette tallet ble tilpasset fra Bate et al.33. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kontrollerende aktiv materie in situ åpner døren til regissert selvorganisering av aktiv materie4,5,24,28,54. I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for bruk av temperatur for å kontrollere kinesin-drevne, MT-baserte aktive væsker in situ, basert på Arrhenius karakteristisk for systemet29,30,31. Fordi systemet er protein BAS ert, er det viktig å opprettholde protein funksjonaliteten gjennom hele eksperimentet for å kunne bruke protokollen. De viktigste proteinene i systemet er MTs og kinesin klynger. Den tidligere depolymerize under 16 ° c og sistnevnte funksjonsfeil over 36 ° c33. Opprettholdelse av system temperaturen mellom 16 – 36 ° c er derfor avgjørende for aktive væsker for å utvikle jevn dynamikk og for å muliggjøre deres respons på temperatur reverserbart (Figur 4 og figur 5). Imidlertid, temperaturen er kontrollert basert på en PID algoritmen, hvilke gjete å overshoot målet temperatur53. For å redusere denne overshooting anbefaler vi at du angir flere mellomliggende mål temperaturer før du angir den endelige mål temperaturen. For eksempel, for å varme opp prøven fra romtemperatur (ca. 20 ° c) til 35 ° c, i stedet for å sette mål temperaturen direkte ved 35 ° c, anbefaler vi en mellomliggende mål temperatur på 30 ° c for å redusere sjansen for at temperaturen øker over 36 ° c, noe som ville irreversibelt skade proteinene33. På samme måte, når du kjøler prøven fra romtemperatur til ~ 16 ° c, anbefales det å stille inn en mellomliggende mål temperatur på 18 ° c, fordi før den når en stabil tilstand, kan PID avkjøle prøven under 16 ° c, depolymerizing MTs33.

Den presenterte temperaturkontroll metoden er avhengig av kjøling og oppvarming ved hjelp av en TEC. Bruken av TEC sikrer at prøven når mål temperaturen i løpet av sekunder, mens en konvensjonell temperaturkontroll oppsett ved hjelp av en temperatur-kontrollerte vannbad tar minutter å nå ønsket temperatur (figur 5)55. Den TEC genererer null netto varme som er utsvevende av en aluminium interne vann sirkulasjon system. Imidlertid lar vannet mold å vokse, noe som til slutt vil tette kanalen56. En tett kanal hemmer vannstrømmen, og varmen vil akkumuleres i aluminium blokken, til slutt smelter vannrørene. De smeltet rørene føre vann til søl over mikroskopet og kameraet, skade elektroniske instrumenter. Derfor, for å vedta den presenterte temperaturkontroll oppsett, anbefaler vi å legge 0,1% hydrogen peroxide til vannet for å hemme mold vekst57,58,59. Vi forventer at dette trinnet vil sikre at aluminium interne kanalen forblir tette-fri og hindre vannskader til nærliggende elektroniske enheter.

Manipulere temperaturen, belegg strømningscelle overflater med polyakrylamid, og syntetisere aktive væsker er tre kritiske skritt for å realisere dette in situ-kontrollerte aktive væsken. Denne kontrollerbarhet er imidlertid begrenset til temperaturområdet der de involverte proteinene kan fungere normalt. I det aktive væske systemet er de primære proteinene MTs og kinesin klynger, som fungerer normalt mellom 16 – 36 ° c33. Innenfor dette temperaturområdet varierer aktive væsker de gjennomsnittlige strømnings hastighetene fra 4 – 8 μm/s (Figur 4C). Mean hastigheter utenfor dette området er utenfor grensen av kontroll metoden presentert. I kontrast, Ross et al. rapportert et alternativ som gjør det mulig for aktive Fluid aktiviteter som skal slås på og av ved hjelp av lys28. Lysstyringen gir også mulighet for aktivering av aktive væsker i 50 μm-skala optisk definert grense. Men et slikt alternativ krever endring av kinesin struktur sammen med tuning en optisk bane i et mikroskop. Til sammenligning er fordelene ved å vedta metoden som presenteres i denne artikkelen 1) de aktive væskene trenger ikke å bli redesignet, 2) mikroskop trenger ikke å endres, 3) temperaturkontroll oppsettet er rimelig og enkelt å bruke, og 4) metoden er overførbar til andre temperatur-avhengige systemer som gliding analysen29,30,31,32 eller mer generelt enzym-baserte systemer60. Vi forventer også at den presenterte metoden vil åpne døren for å designe mikrovæskebasert systemer der kanalen renn er kontrollert lokalt uten ventiler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Plasmider K401-BCCP-H6 var en gave fra Dr. Zvonimir Dogic. Denne forskningen ble støttet av Dr. kun-ta Wu ' s oppstart fondet i Worcester Polytechnic Institute. Vi takker Dr. Zvonimir Dogic for protokollene å rense og merke tubulin og å syntetisere aktive væsker. Vi er takknemlige for Dr. Marc Ridilla for sin ekspertise på protein uttrykk og rensing. Vi takker Dr. William Benjamin Roger for å hjelpe oss med å bygge den temperaturstyrte scenen. Vi erkjenner Brandeis MRSEC (NSF-MRSEC-1420382) for bruk av biologiske materialer Facility (BMF). Vi erkjenner Royal Society of Chemistry for å tilpasse tallene fra Bate et al. på Soft Matter33.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid Sigma-Aldrich 238813 Trolox
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific AC216550050
3.2mm I.D. Tygon Tubing R-3603 HACH 2074038 Water tubes
31.75 mm diameter uncoated, sapphire window Edmund Optics 43-637 Sapphire disc
3M 1181 Copper Tape - 1/2 IN Width X 18 YD Length - 2.6 MIL Total Thickness - 27551 R.S. HUGHES 054007-27551 Copper tape
Acetic Acid Sigma-Aldrich A6283
Acrylamide Solution (40%/Electrophoresis), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1402-1
Adenosine 5'-triphosphate dipotassium salt hydrate Sigma-Aldrich A8937 ATP
Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) Thermo Fisher Scientific A20006 Far-red fluorescent dye. Alexa 647 can be pre suspended in dimethylsulfoxide (DMSO) before mixing with microtubules (1.3.3.2.)
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit Sigma-Aldrich UFC801024 Centrifugal filter tube. Cutoff molecular weight: 10 kDa
Ammonium Persulfate, 100g, MP Biomedicals Fisher Scientific ICN802829 APS
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP1760 Ampicillin
Antivibration Table Nikon 63-7590S
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
Bacto Agar Soldifying Agent, BD Diagnostics VWR 90000-760 Agar
Biotin Alfa Aesar A14207
Bucket-plastic white - 2 gallon Bon 84-715 Water bucket
Calcium Chloride Sigma-Aldrich 746495 CaCl2
Catalase from bovine liver Sigma-Aldrich C40
CFI Plan Apo Lambda 4x Obj Nikon MRD00045 4x air objective
C-FLLL-FOV GFP HC HC HISN ero Shift Nikon 96372 GFP filter cube
CH-109-1.4-1.5 TE Technology CH-109-1.4-1.5 Thermoelectric Cooler (TEC)
Chloramphenicol, 98%, ACROS Organics Fisher Scientific C0378
Cooling block N/A N/A Custom milled aluminum
Coomassie Brilliant Blue R-250 #1610400 Bio-Rad 1610400 Triphenylmethane dye
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
Dimethyl Sulfoxide (Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific D128 DMSO
DL-1,4-Dithiothreitol, 99%, for biochemistry, ACROS Organics Fisher Scientific AC165680050 DTT
DOWSIL 340 Heat Sink Compound Dow 1446622 Thermal paste
ETHYL ALCOHOL, 200 PROOF ACS/USP/NF GRADE 5 GALLON POLY CUBE Pharmco by Greenfield Global 111000200CB05 Ethanol
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E3889 EGTA
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich 798681 EDTA
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Tryptone Fisher Scientific BP1421 Tryptone
Fisher BioReagents Microbiology Media Additives: Yeast Extract Fisher Scientific BP1422 Yeast extract
Fluoresbrite YG Microspheres, Calibration Grade 3.00 µm Polysciences 18861 Tracer particles
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma-Aldrich G2133
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
GpCpp Jena Bioscience NU-405L Guanosine-5’[(α,β)-methyleno]triphosphate (GMPCPP)
GS Power's 18 Gauge (True American Wire Ga), 100 feet, 99.9% Stranded Oxygen Free Copper OFC, Red/Black 2 Conductor Bonded Zip Cord Power/Speaker Electrical Cable for Car, Audio, Home Theater Amazon B07428NBCW Copper wire
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate Sigma-Aldrich G8877 GTP
Hellmanex III Sigma-Aldrich Z805939 Detergent
HEPES Sodium Salt (White Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP410 NaHEPES
High performance blender machine AIMORES AS-UP1250 Blender
His GraviTrap GE Healthcare 11003399 Gravity Column
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
IPTG Sigma-Aldrich I6758 Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
Isopropyl Alcohol 99% Pharmco by Greenfield Global 231000099 Isopropanol
JA-10 rotor Beckman Coulter 369687
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Sigma-Aldrich G1501 K-Glutamate
Lysozyme from chicken egg white Sigma-Aldrich L6876
Magnesium chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670 MgCl2•6H2O
MES sodium salt Sigma-Aldrich M5057 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt
MOPS Sigma-Aldrich M1254 3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid
MP-3022 TE Technology MP-3022 Thermocouple
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 99%, ACROS Organics Fisher Scientific AC138450500 TEMED
Nanodrop 2000c UV-VIS Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific E112352 Spectrometer
Nikon Ti2-E Nikon Inverted Microscope Nikon MEA54000
Norland Optical Adhesive 81 Norland Products NOA81 UV glue
Novex Sharp Pre-stained Protein Standard Thermo Fisher Scientific LC5800 Protein standard ladder
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.5 mm, 10-well Thermo Fisher Scientific NP0335BOX SDS gel
Optima L-90K Ultracentrifuge Beckman Coulter 365672
Parafilm PM996 Wrap, 4" Wide; 125 Ft/Roll Cole-Parmer EW-06720-40 Wax film
Pe 300 ultra Illumination System Single Band, 3mm Light Guide control Pod power supply Nikon PE-300-UT-L-SB-40 Cool LED Illuminator
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich 78830 PMSF
Phosphoenolpyruvic acid monopotassium salt, 99% BeanTown Chemical 129745 PEP
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23200
Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets Thermo Fisher Scientific A32953
PIPES Sigma-Aldrich P6757 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
Poly(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 81300 PEG. Average molecular weight 20,000 Da
Potassium Hydroxide (Pellets/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific P250-500 KOH
PowerEase 300W Power Supply (115 VAC) ThermoFisher Scientific PS0300 DC power supply of the gel box
PS-12-8.4A TE Technology PS-12-8.4A DC power supply of the temperature controller
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle Sigma-Aldrich P-0294 PK/LDH
Quiet One Lifegard Fountain Pump, 296-Gallon Per Hour Amazon B005JWA612 Fish tank pump
Rosetta 2(DE3)pLysS Competent Cells - Novagen Millipore Sigma 71403 Competent cells
Sharp Microwave ZSMC0912BS Sharp 900W Countertop Microwave Oven, 0.9 Cubic Foot, Stainless Steel Amazon B01MT6JZMR Microwave for boiling the water
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical Fisher Scientific S271-500 NaCl
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich L3771 SDS
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S8282 NaH2PO4
Streptavidin Protein Thermo Fisher Scientific 21122
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
TC-720 TE Technology TC-720 Temperature controller
Tris Base, Molecular Biology Grade - CAS 77-86-1 - Calbiochem Sigma-Aldrich 648310 Tris-HCL
Type 45 Ti rotor Beckman Coulter 339160
Type 70 Ti rotor Beckman Coulter 337922
Type 70.1 Ti rotor Beckman Coulter 342184
VWR General-Purpose Laboratory Labeling Tape VWR 89097-916 Paper tapes
VWR Micro Cover Glasses, Square, No. 1 1/2 VWR 48366-227 Glass coverslips
VWR Plain and Frosted Micro Slides, Premium VWR 75799-268 Glass slides
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher Scientific EI0001 Gel box
ZYLA 5.5 USB3.0 Camera Nikon ZYLA5.5-USB3 Monochrome CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wioland, H., Lushi, E., Goldstein, R. E. Directed Collective Motion of Bacteria under Channel Confinement. New Journal of Physics. 18 (7), 075002 (2016).
  2. Wioland, H., Woodhouse, F. G., Dunkel, J., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. Confinement Stabilizes a Bacterial Suspension into a Spiral Vortex. Physical Review Letters. 110 (26), 268102 (2013).
  3. Buhl, J., et al. From Disorder to Order in Marching Locusts. Science. 312 (5778), 1402-1406 (2006).
  4. Aubret, A., Youssef, M., Sacanna, S., Palacci, J. Targeted Assembly and Synchronization of Self-Spinning Microgears. Nature Physics. 14, 1114 (2018).
  5. Driscoll, M., et al. Unstable Fronts and Motile Structures Formed by Microrollers. Nature Physics. 13 (4), 375 (2017).
  6. Bricard, A., et al. Emergent Vortices in Populations of Colloidal Rollers. Nature Communications. 6, 7470 (2015).
  7. Kumar, N., Soni, H., Ramaswamy, S., Sood, A. K. Flocking at a Distance in Active Granular Matter. Nature Communications. 5, 4688 (2014).
  8. Farhadi, L., Fermino Do Rosario, C., Debold, E. P., Baskaran, A., Ross, J. L. Active Self-Organization of Actin-Microtubule Composite Self-Propelled Rods. Frontiers in Physics. 6 (75), 1 (2018).
  9. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar Patterns of Driven Filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  10. Keber, F. C., et al. Topology and Dynamics of Active Nematic Vesicles. Science. 345 (6201), 1135-1139 (2014).
  11. Doostmohammadi, A., Ignés-Mullol, J., Yeomans, J. M., Sagués, F. Active Nematics. Nature Communications. 9 (1), 3246 (2018).
  12. Wensink, H. H., et al. Meso-Scale Turbulence in Living Fluids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14308-14313 (2012).
  13. Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Coherent Motion of Dense Active Matter. The European Physical Journal Special Topics. 227 (17), 2401-2411 (2019).
  14. Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. Taming active turbulence with patterned soft interfaces. Nature Communications. 8 (1), 564 (2017).
  15. Maryshev, I., Goryachev, A. B., Marenduzzo, D., Morozov, A. Dry active turbulence in microtubule-motor mixtures. arXiv preprint. , arXiv:1806.09697 (2018).
  16. Nishiguchi, D., Aranson, I. S., Snezhko, A., Sokolov, A. Engineering bacterial vortex lattice via direct laser lithography. Nature Communications. 9 (1), 4486 (2018).
  17. Shendruk, T. N., Thijssen, K., Yeomans, J. M., Doostmohammadi, A. Twist-induced crossover from two-dimensional to three-dimensional turbulence in active nematics. Physical Review E. 98 (1), 010601 (2018).
  18. Urzay, J., Doostmohammadi, A., Yeomans, J. M. Multi-scale statistics of turbulence motorized by active matter. Journal of Fluid Mechanics. 822, 762-773 (2017).
  19. Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. Spontaneous Motion in Hierarchically Assembled Active Matter. Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).
  20. Wu, K. T., et al. Transition from Turbulent to Coherent Flows in Confined Three-Dimensional Active Fluids. Science. 355 (6331), (2017).
  21. Hess, H., et al. Molecular shuttles operating undercover: A new photolithographic approach for the fabrication of structured surfaces supporting directed motility. Nano Letters. 3 (12), 1651-1655 (2003).
  22. Aoyama, S., Shimoike, M., Hiratsuka, Y. Self-organized optical device driven by motor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16408-16413 (2013).
  23. Nicolau, D. V., et al. Parallel computation with molecular-motor-propelled agents in nanofabricated networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (10), 2591-2596 (2016).
  24. Palacci, J., Sacanna, S., Steinberg, A. P., Pine, D. J., Chaikin, P. M. Living Crystals of Light-Activated Colloidal Surfers. Science. 339 (6122), 936-940 (2013).
  25. Morin, A., Bartolo, D. Flowing Active Liquids in a Pipe: Hysteretic Response of Polar Flocks to External Fields. Physical Review X. 8 (2), 021037 (2018).
  26. Lakkaraju, S. K., Hwang, W. Critical Buckling Length versus Persistence Length: What Governs Biofilament Conformation. Physical Review Letters. 102 (11), 118102 (2009).
  27. Henkin, G., DeCamp, S. J., Chen, D. T. N., Sanchez, T., Dogic, Z. Tunable Dynamics of Microtubule-Based Active Isotropic Gels. Philosophical transactions. Series A, Mathematical, physical, and engineering sciences. 372 (2029), 20140142 (2014).
  28. Ross, T. D., et al. Controlling Organization and Forces in Active Matter through Optically-Defined Boundaries. arXiv:1812.09418. , cond-mat.soft (2018).
  29. Böhm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466 (1), 59-62 (2000).
  30. Anson, M. Temperature dependence and arrhenius activation energy of F-actin velocity generated in vitro by skeletal myosin. Journal of Molecular Biology. 224 (4), 1029-1038 (1992).
  31. Hong, W., Takshak, A., Osunbayo, O., Kunwar, A., Vershinin, M. The Effect of Temperature on Microtubule-Based Transport by Cytoplasmic Dynein and Kinesin-1 Motors. Biophysical Journal. 111 (6), 1287-1294 (2016).
  32. Kawaguchi, K., Ishiwata, S. I. Thermal activation of single kinesin molecules with temperature pulse microscopy. Cell Motility. 49 (1), 41-47 (2001).
  33. Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Collective Dynamics of Microtubule-Based 3D Active Fluids from Single Microtubules. Soft Matter. 15 (25), 5006-5016 (2019).
  34. Tucker, R., et al. Temperature Compensation for Hybrid Devices: Kinesin's Km is Temperature Independent. Small. 5 (11), 1279-1282 (2009).
  35. Collee, J. G., Bradley, R., Liberski, P. P. Variant CJD (vCJD) and bovine spongiform encephalopathy (BSE): 10 and 20 years on: part 2. Folia Neuropathologica. 44 (2), 102 (2006).
  36. Castoldi, M., Popov, A. V. Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer. Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).
  37. Swinehart, D. The Beer-Lambert law. Journal of Chemical Education. 39 (7), 333 (1962).
  38. Ashford, A. J., Andersen, S. S., Hyman, A. A. Preparation of tubulin from bovine brain. Cell biology: A laboratory handbook. 2, 205-212 (1998).
  39. Hyman, A., et al. Methods in Enzymology. 196, Academic Press. 478-485 (1999).
  40. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  41. Spriestersbach, A., Kubicek, J., Schäfer, F., Block, H., Maertens, B. Methods in enzymology. Lorsch, J. R. 559, Academic Press. Ch. 1 1-15 (2015).
  42. Subramanian, R., Gelles, J. Two Distinct Modes of Processive Kinesin Movement in Mixtures of ATP and AMP-PNP. The Journal of General Physiology. 130 (5), 445-455 (2007).
  43. Gasteiger, E., et al. The proteomics protocols handbook. , Springer. 571-607 (2005).
  44. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).
  45. Lau, A. W. C., Prasad, A., Dogic, Z. Condensation of isolated semi-flexible filaments driven by depletion interactions. Europhysics Letters. 87 (4), 48006 (2009).
  46. Chandrakar, P., et al. Microtubule-Based Active Fluids with Improved Lifetime, Temporal Stability and Miscibility with Passive Soft Materials. arXiv:1811.05026. , cond-mat.soft (2018).
  47. Lowensohn, J., Oyarzún, B., Paliza, G. N., Mognetti, B. M., Rogers, W. B. Linker-mediated phase behavior of DNA-coated colloids. arXiv:1902.08883. , cond-mat.soft (2019).
  48. Wu, K. T., et al. Polygamous Particles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18731-18736 (2012).
  49. Wu, K. T., et al. Kinetics of DNA-Coated Sticky Particles. Physical Review E. 88 (2), 022304 (2013).
  50. Ouellette, N. T., Xu, H., Bodenschatz, E. A quantitative study of three-dimensional Lagrangian particle tracking algorithms. Experiments in Fluids. 40 (2), 301-313 (2005).
  51. Kelley, D. H., Ouellette, N. T. Using particle tracking to measure flow instabilities in an undergraduate laboratory experiment. American Journal of Physics. 79 (3), 267-273 (2011).
  52. Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. Subunit Interactions in Dimeric Kinesin Heavy Chain Derivatives That Lack the Kinesin Rod. Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).
  53. Aström, K. J., Murray, R. M. Feedback systems: an introduction for scientists and engineers. , Princeton University Press. (2011).
  54. Soni, V., et al. The free surface of a colloidal chiral fluid: waves and instabilities from odd stress and Hall viscosity. arXiv:1812.09990. , physics.flu-dyn (2018).
  55. Harvey, M. Precision Temperature-Controlled Water Bath. Review of Scientific Instruments. 39 (1), 13-18 (1968).
  56. Beuchat, L. R. Influence of Water Activity on Growth, Metabolic Activities and Survival of Yeasts and Molds. Journal of Food Protection. 46 (2), 135-141 (1983).
  57. Block, S. S. Disinnfection, sterilization, annd preservation. , Lippincott Williams, Wilkins. (2001).
  58. Schumb, W. C., Satterfield, C. N., Wentworth, R. L. Hydrogen peroxide. , University Microfilms. (1955).
  59. Simmons, G. F., Smilanick, J. L., John, S., Margosan, D. A. Reduction of Microbial Populations on Prunes by Vapor-Phase Hydrogen Peroxide. Journal of Food Protection. 60 (2), 188-191 (1997).
  60. Shimoboji, T., Larenas, E., Fowler, T., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Temperature-induced switching of enzyme activity with smart polymer-enzyme conjugates. Bioconjugate chemistry. 14 (3), 517-525 (2003).

Tags

Engineering biofysikk kinesin mikrotubulinettverket aktive væsker selv-organisasjon temperatur Arrhenius lov
Kontrollere strømningshastigheter på Mikrotubulinettverket-basert 3D aktive væsker ved hjelp av temperatur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney,… More

Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. T. Controlling Flow Speeds of Microtubule-Based 3D Active Fluids Using Temperature. J. Vis. Exp. (153), e60484, doi:10.3791/60484 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter