Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Identifikation af værts veje, som er målrettet mod bakterielle Effector-proteiner ved hjælp af gær toksicitet og suppressor skærme

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60488
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

Summary

Bakterielle patogener udskiller proteiner i værten, der er målrettet mod afgørende biologiske processer. Identificering af værts vejene, der er målrettet mod bakterielle Effector proteiner, er nøglen til at tackle Molekylær patogenese. Her beskrives en metode ved hjælp af en modificeret gær suppressor og toksicitet skærm til at belyse vært veje, der er målrettet af giftige bakterielle Effector proteiner.

Abstract

Intracellulære bakterier udskiller virulensfaktorer kaldet Effector proteiner i værten cytosol, der virker til at undergrave Host proteiner og/eller deres tilknyttede biologiske veje til gavn for bakterien. Identifikation af formodede bakterielle Effector proteiner er blevet mere håndterbare på grund af fremskridt i bakteriel genom sekvensering og fremkomsten af algoritmer, der tillader i silico identifikation af gener kodning sekretion kandidater og/eller eukaryotic-lignende Domæner. Identifikationen af disse vigtige virulensfaktorer er dog kun et første skridt. Naturligvis er målet at bestemme den molekylære funktion af Effector proteiner og belyse, hvordan de interagerer med værten. I de seneste år, teknikker som gær to-hybrid skærm og storstilet immunopræcipitationer kombineret med massespektrometri har hjulpet i identifikationen af protein-protein interaktioner. Selv om identifikation af en værts bindende partner er det afgørende første skridt i retning af at belyse den molekylære funktion af et bakterielt Effector-protein, er værts proteinet sommetider fundet at have flere biologiske funktioner (f. eks. actin, clathrin, Tubulin) eller det bakterielle protein kan ikke fysisk binde Host proteiner, fratage forskeren af afgørende oplysninger om den præcise vært pathway bliver manipuleret. En modificeret gær toksicitet skærm kombineret med en suppressor skærm er blevet tilpasset til at identificere vært veje påvirket af bakterielle Effector proteiner. Toksicitets skærmen er afhængig af en toksisk virkning i gær forårsaget af Effector protein, der forstyrrer værts biologiske veje, som ofte manifesterer sig som en vækst defekt. Udtryk for en gær genomisk bibliotek bruges til at identificere vært faktorer, der undertrykker toksiciteten af bakterien Effector protein og dermed identificere proteiner i den vej, Effector protein mål. Denne protokol indeholder detaljerede anvisninger for både toksicitet og suppressor skærme. Disse teknikker kan udføres i ethvert laboratorium, der er i stand til molekylær kloning og dyrkning af gær og Escherichia coli.

Introduction

Den første rapport af procedurer svarende til dem, der præsenteres her karakteriseret Legionella pneumophila type IV Effector sidd, en deAMPylase, der ændrer Rab11. Sammenlignelige teknikker blev anvendt til karakterisering af flere L. pneumophila efftorer1,2,3. Analysen blev tilpasset til at karakterisere en Coxiella burnetii type IV Effector protein4, og for nylig nytten af denne teknik blev udvidet til karakterisering af Klamydia trachomatis inklusion membran proteiner5 .

Denne protokol kan opdeles i to hoveddele: 1) gær toksicitet skærm, hvor bakterien Effector protein af interesse udtrykkes i gær og kloner er screenet for en toksisk fænotype som det fremgår af en vækst defekt, og 2) gær suppressor skærmen , hvor den giftige fænotype er undertrykt ved udtryk af en gær genomisk bibliotek i den giftige stamme. Således toksicitet skærmen er en skærm for giftige fænotyper, der manifesterer sig som vækst defekter, når den bakterielle Effector af interesse er overudtrykt. Giftige kloner, med succes omdannet med og udtrykker den bakterielle Effector, er valgt og gemt til næste trin. Det andet store skridt består i at over udtrykke et delvist fordøjet gærgenomisk bibliotek i den giftige gærklon. Plasmider, der udgør gær genomisk bibliotek foreslået til brug i denne protokol bære 5 − 20 kb skær, normalt svarer til 3 − 13 gær åbne læse rammer (ORF) af en gennemsnitlig gen størrelse af ~ 1,5 KB på tværs af alle plasmider, der repræsenterer hele gær genom dækket ca. 10x. Denne del af analysen kaldes suppressor skærmen, da målet er at undertrykke toksiciteten af bakterien Effector protein. Potentielle suppressor plasmider isoleres fra gær, sekvenserede og undertrykkende Orf'er identificeret. Rationalet bag suppressor-skærmen er, at Effector-proteinet binder, interagerer med og/eller overvælder komponenterne i værts vejen, det er rettet mod, og at det at give disse værts proteiner tilbage i overskud kan redde den toksiske virkning på vejen og dermed vækst defekten. Således identificerede Orf'er, der undertrykker toksicitet ofte repræsenterer flere deltagere i en vært pathway. Ortogonale eksperimenter udføres derefter for at kontrollere, at bakterien Effector faktisk interagerer med den implicerede vej. Dette er især nødvendigt, hvis en bindende partner som clathrin eller actin er blevet identificeret, fordi disse proteiner er involveret i en lang række værts processer. Yderligere eksperimenter kan så belyse den fysiologiske funktion af Effector protein under infektion. Toksiciteten og suppressor skærmene er også kraftfulde værktøjer til at afskærme den fysiologiske funktion af bakterielle Effector proteiner, der ikke fysisk binder værts proteiner med tilhørsforhold, der er tilstrækkelige til at detektere ved immunopræcipitation, eller som interagerer med Host i enzymatiske hit-and-run interaktioner, der ikke kan påvises ved en gær-to hybrid skærm.

Selv om suppressor skærmen kan være en kraftfuld metode til at afsløre potentielle fysiologiske interaktioner mellem bakterielle Effector proteiner og værts veje, den bakterielle Effector protein skal fremkalde en vækst defekt i gær, ellers bruge det i suppressor skærm vil være til meget lidt brug. Desuden skal den toksiske fænotype resultere i mindst en 2 − 3 log10 underskud i vækst, eller det vil være vanskeligt at identificere suppressorer. Hvis et laboratorium er oprettet for cellekultur, screening Effector proteiner for toksicitet i fælles cellelinjer som HeLa kan ofte give indsigt i, om det er umagen værd at gå videre med gær toksicitet skærmen. Ectopic ekspression af Effector protein i HeLa celler undertiden resulterer i toksicitet, der korrelerer meget stærkt med toksicitet i gærstammen anvendes til disse skærme4. Observerbare kendetegn af stress i HeLa celler omfatter tab af stress fibre, celle løsrivelse fra pladen, og nuklear kondensation indikerer apoptose. Enhver visuel indikation af stress i Hela-celler gør det protein af interesse en god kandidat til inducerende en vækst defekt i gær, som replikerer meget hurtigere og er dermed mere lydhør over for forstyrrelse af essentielle veje.

Det skal bemærkes, at den suppressor skærm ikke altid identificerer vært bindende partnere som undertrykkere, men det kan stadig implicere kritiske komponenter i værts vejen (r) målrettet, giver et holistisk syn på de biologiske processer, der kapret af bakteriel Effector protein. På overfladen, dette synes ulogisk, fordi at give den bindende partner af Effector protein i overskydende forventes at redde væksten defekt. I bestræbelserne på at identificere veje rettet af C. trachomatis Effector protein CT229 (cpos), som binder til mindst 10 forskellige Rab GTPases under infektion5, ingen af Rab bindende partnere undertrykt TOKSICITETEN af CT229. Der blev imidlertid identificeret talrige suppressorer, som var involveret i clathrin-belagt vesikelprotein-handel (CCV), hvilket førte til yderligere arbejde, der viste, at CT229 specifikt undergraver Rab-afhængig CCV-handel. Tilsvarende, når man undersøger C. burnetii Effector protein Cbu0041 (Cira) flere Rho GTPases, der reddede gærvækst defekt blev identificeret, og det blev senere konstateret, at Cira fungerer som en GTPase aktivering protein (Gap) for rhoa4.

Nytten af gær suppressor skærm til belyse vært veje målrettet af bakteriel Effector proteiner kan ikke overvurderes, og andre forskere forsøger at karakterisere intracellulære bakteriel Effector proteiner kan i høj grad drage fordel af disse teknikker. Disse assays er af værdi, hvis immunopræcipitationer og/eller gær-to hybrid skærme har undladt at finde en bindende partner og kan belyse, hvilke veje er målrettet af bakterien Effector protein. Her tilvejebringes detaljerede protokoller for toksicitet og suppressor skærme til at identificere vært biologiske veje målrettet af intracellulære bakteriel Effector proteiner er tilvejebragt, samt nogle af de almindelige forhindringer opleves ved brug af disse assays og deres tilsvarende løsninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af medier og reagenser

Bemærk: pladerne skal tilberedes før analyse dagen og er gode i 1 måned. Medier og reagenser kan laves på ethvert punkt og er gode i 1 måned.

  1. Der fremstilles 1 liter glucoseopløsning (10% w/v) ved opløsning af 100 g-(+)-glucose i 800 mL destilleret vand i et 1 000 mL bægerglas. Justér lydstyrken til 1 L med destilleret vand. Filtrer gennem et 0,2 μm sterilt filter i en steril 1 L medie opbevarings flaske.
  2. Der forberedes 1 L af Galactoseopløsningen (10% w/v) ved at opløse 100 g-(+)-galactose i 800 mL destilleret vand i et 1 L bægerglas. Juster lydstyrken til 1 mL med destilleret vand, og Filtrer gennem et 0,2 μm sterilt filter i en steril 1.000 mL medie opbevarings flaske.
  3. Forbered 1 L gærekstrakt pepton dextrose (YPD) agar ved at opløse 10 g gærekstrakt, 20 g pepton, 20 g glucose og 20 g agar i 1.000 ml destilleret vand. Autoklave i 20 min og afkøles i 56 °C vandbad, indtil det afkøles. Hæld i 100 mm plader ved hjælp af ~ 20 mL af medierne per plade.
  4. Forbered 1 liter YPD bouillon ved at opløse 10 g gærekstrakt, 20 g pepton og 20 g glucose i 1.000 ml destilleret vand. Autoklave i 20 min.
  5. Forbered den syntetiske Dropout (SD) uracil (URA-) glukose agar. For 1 L, opløses 6,7 g gær nitrogen base uden aminosyrer, 1,9 g Dropout supplement uden uracil, og 15 g agar i 800 mL destilleret vand. Autoklave i 20 min og afkøles i et 56 °C vandbad, indtil temperaturen er ~ 50 − 60 °C. Ved hjælp af en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradueret cylinder tilsættes 200 mL af glucoseopløsningen tilberedt i trin 1,1. Bland godt ved forsigtigt at hvirvlende eller anbringe på røre pladen. Hæld i 100 mm plader ved hjælp af ~ 20 mL af medierne per plade.
  6. Forbered den syntetiske Dropout (SD) uracil (URA-) galactose agar. For 1 L, opløses 6,7 g gær nitrogen base uden aminosyrer, 1,9 g Dropout supplement uden uracil, og 15 g agar i 800 mL destilleret vand. Autoklave i 20 min og afkøles i et 56 °C vandbad, indtil temperaturen er ~ 50 − 60 °C. Ved hjælp af en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradueret cylinder tilsættes 200 mL af galactoseopløsningen tilberedt i trin 1,2. Bland godt ved forsigtigt at hvirvlende eller anbringe på røre pladen. Hæld i 100 mm plader ved hjælp af ~ 20 mL af medierne per plade.
  7. Forbered syntetisk Dropout (SD) uracil (URA-) glucosebouillon. For 1 L, opløses 6,7 g gær nitrogen base uden aminosyrer og 1,9 g Dropout supplement uden uracil i 800 mL destilleret vand. Autoklave i 20 min og afkøles i et 56 °C vandbad, indtil temperaturen er ~ 50 − 60 °C. Ved hjælp af en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradueret cylinder tilsættes 200 ml af glucoseopløsningen tilberedt i trin 1,1.
  8. Forbered den syntetiske Dropout (SD) uracil (URA-) leucin (leu-) glucoseagar. For 1 L, opløses 6,7 g af gær nitrogen base uden aminosyrer; 1,9 g Dropout supplement uden uracil, leucin, og tryptophan; 15 g agar; og 0,076 g tryptophan i 800 mL destilleret vand. Autoklave i 20 min og afkøles i et 56 °C vandbad, indtil temperaturen er ~ 50 − 60 °C. Ved hjælp af en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradueret cylinder tilsættes 200 mL af glucoseopløsningen tilberedt i trin 1,1. Hæld i 100 mm plader ved hjælp af ~ 20 mL af medierne per plade.
  9. Forbered syntetisk Dropout (SD) uracil (URA-) leucin (leu-) galactose agar. For 1 L, opløses 6,7 g gær nitrogen base uden aminosyrer; 1,9 g Dropout supplement uden uracil, leucin, og tryptophan; 15 g agar; og 0,076 g tryptophan i 800 mL destilleret vand. Autoklave i 20 min og afkøles i et 56 °C vandbad, indtil temperaturen er ~ 50 − 60 °C. Ved hjælp af en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradueret cylinder tilsættes 200 mL af galactoseopløsningen tilberedt i trin 1,2. Bland godt ved forsigtigt at hvirvlende eller anbringe på en røre plade. Hæld i 100 mm plader ved hjælp af ~ 20 mL af medierne per plade.
  10. Forbered syntetisk Dropout (SD) uracil (URA-) leucin (leu-) glucosebouillon. For 1 L, opløses 6,7 g gær nitrogen base uden aminosyrer; 1,9 g Dropout supplement uden uracil, leucin, tryptophan; og 0,076 g tryptophan i 800 mL destilleret vand. Autoklave i 20 min og køligt i et 56-60 °C vandbad, indtil temperaturen er ~ 50 °C. Ved hjælp af en 50 mL serologisk pipette eller en steril gradueret cylinder tilsættes 200 mL af glucoseopløsningen tilberedt i trin 1,1.
  11. Forbered polyethylen glykol (peg) opløsning. Tilsæt 50% w/v polyethylenglycol 3350 i destilleret vand. Steriliseres ved autoklave iser.
  12. 1 M lithiumacetat (LiAc) forberedes ved at opløse 10,2 g lithiumacetat-dehydrat i 200 mL destilleret vand. Steriliseres ved autoklave iser.
  13. Forbered sild sperm DNA. 10 mg/mL silde sæddna fortyndes til 2 mg/mL med destilleret vand. Opvarm ved 100 °C i 5 minutter og Anbring straks på is i 5 minutter.

2. kloning af genet af interesse i gær toksicitet plasmid pYesNTA-kan

Bemærk: i øjeblikket er der en række gær toksicitet vektorer tilgængelige både kommercielt og fagligt. Gærsuppressor skærmen kan bruges sammen med mange af disse vektorer forudsat plasmid udtrykker Effector protein af interesse bruger en Dropout valg anden end uracil og en antibiotika markør andre end blaR. Dette arbejde brugte en modificeret pyesnta vektor4,5, der omfatter en kanamycin resistens kassette for lettere screening for potentielle suppressorer. Klonings ordningen skal gøre det muligt for Effector-proteinet at være i ramme med gal-promotoren og hans-tag. Chlamydia trachomatis Inclusion MEMBRAN protein CT229 blev brugt som et princip bevis for disse assays.

  1. Brug PCR til at forstærke CT229 fra C. trachomatis GENOMISK DNA efter producentens anvisninger ved hjælp af CT229 + 1 KPN F (CCGGTACCAATGAGCTGTTCTAATGTTAATTCAGGT) og CT229 Xhoi R (CCCTCGAGTTTTTTACGACGGGATGCC) Primers. Brug følgende PCR-betingelser: (1) 98 °C i 30 s; (2) 98 °C i 10 s, 55 °C i 30 s, 72 °C i 2 min; (3) Gentag trin 2 for i alt 25x; (4) 72 °C i 10 min. og (5) 4 °C hold.
  2. Analysér 5 μL af PCR-produktet på en 1% agopstået gel (figur 1).
  3. De resterende 45 μL DNA ved hjælp af et PCR-rensningsudstyr, der følger producentens anvisninger, oprenses.
  4. Der fordøje 50 μL renset PCR-skær og pYesNTA-kan (figur 2) i 1 time ved 37 °c i et vandbad med kpni-HF og xhoi-HF.
    Bemærk: for pYesNTA-kan, fordøje 5 μg plasmid med 5 μL KpnI-HF, 5 μl XhoI-HF og 6 μL buffer i et samlet volumen på 60 μL. For indsatsen fordøje hele 50 μL af det rensede PCR-produkt ved hjælp af 2 μL KpnI-HF, 2 μL XhoI-HF og 6 μL buffer.
  5. Kør hele plasmid Digest på en 1% agopstået gel. Udfør rensning af det fordøjet plasmid ved hjælp af et gel ekstraktions udstyr efter producentens anvisninger.
  6. Rens den Ford øjede PCR-indsats ved hjælp af et PCR-rensningsudstyr efter producentens anvisninger.
  7. Klon indsatsen i pYesNTA-kan ved hjælp af 2 μL pYesNTA-kan (trin 2,5), 2 μL DNA-ligasebuffer, 1 μL T4-ubiquitinligase og 15 μL af indsatsen (trin 2,6). Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
  8. Tilsæt hele klonings reaktionen til 50 μL E. coli -kompetente celler, og Udfør Transformations reaktionen.
  9. Hele Transformations reaktionen på en LB-plade, der indeholder 100 μg/mL carbenicillin.
  10. 10 mL af LB indeholdende 100 μg/mL carbenicillin med tre individuelle kolonier. Inkuber natten over ved 37 °C med omrystning ved 150 rpm.
  11. Isoler plasmid ved hjælp af et plasmid miniprep-sæt efter producentens anvisninger.
  12. Rækkefølgen af de isolerede plasmid'er ved hjælp af gen-specifikke primere (trin 2,1).

3. test proteinet af interesse for toksicitet i gær

  1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 på YPD agar (trin 1,3) for at opnå isolerede kolonier. Inkuber ved 30 °C i 24 timer.
  2. Der inokuleres 10 mL YPD bouillon (trin 1,4) med en enkelt koloni fra agarpladen (trin 3,1). Inkuber ved 30 °C med omrystning ved 150 rpm natten over.
  3. 0,5 mL af overnight kulturen tilsættes til 10 mL YPD bouillon (trin 1,4) og Inkuber ved 30 °C med omrystning ved 150 rpm i 4 timer.
    1. Pellet 10 mL af kulturen ved 3.000 x g i 10 minutter ved 4 °c.
    2. Opslæmmes pellet i 1 mL sterilt vand, overførsel til mikrocentrifuge røret og pellet ved 3.000 x g i 1 min. ved stuetemperatur.
    3. Den opslæmmes pellet i 1 mL 1 mM lithiumacetat (LiAc) og pellet ved 3.000 x g i 1 min. ved stuetemperatur.
    4. Gentag LiAc-vask 2x.
    5. Fjern vasken. Resuspension af pellet i 2,4 mL 50% PEG 3350. Tilsæt 360 μl 1M LiAc, 500 μl 2 mg/ml silde SÆDDNA og 400 μl sterilt vand.
      Bemærk: Dette er tilstrækkeligt til 20 transformationer.
    6. Der tilsættes 180 μL af Transformations blandingen fra trin 3.3.5 til et mikrocentrifuge glas, som indeholder 5 μL pYesNTA-kan CT229 plasmid-DNA (100 − 500 ng) fra trin 2,12.
    7. Der inkubates i et vandbad ved 30 °C i 30 minutter.
    8. Der inkubates i et vandbad ved 42 °C i 30 minutter.
    9. Pellet ved 3.000 x g i 1 min. ved stuetemperatur.
    10. Fjern Transformations blandingen med pipetten. Resuspension af pellet i 100 μL sterilt vand. Plade omdannelsen på SD URA- agar med glucose (trin 1,5).
    11. Inkuber pladerne ved 30 °C i 48 h.
  4. Der inokuleres 5 mL SD URA- bouillon indeholdende glucose (trin 1,7) med en enkelt koloni fra pladen. Inkuber natten over ved 30 °C med omrystning ved 150 rpm. Medtag gær omdannet med vektor alene som en negativ kontrol.
    1. Tilsæt 180 μL sterilt vand til 5 brønde af en 96 brønd plade (a2 − A6).
    2. Vortex natten kultur til at blande.
    3. Tilsæt 180 μL gær til første brønd (a1). Serielt fortyndet 1:10 (seks prøver i alt inklusive ufortyndet).
    4. Ved hjælp af en multikanals pipette, spot 5 μL af hver fortynding på SD URA- glucose (trin 1,5) og ura- galactose (trin 1,6) agar plader. Inkuber ved 30 °C i 48 h.
  5. Vurder toksiciteten ved at sammenligne væksten af gæren udtrykker Effector protein af interesse dyrket på galactose-holdige medier til væksten af gær udtrykker vektoren alene.
  6. Bekræft ekspression af hans-tag fusion protein af Western blotting.

4. omdanne giftig gær med gær genomisk bibliotek

  1. Inokulere 100 mL SD URA- glucosebouillon (trin 1,7) med 1 ml af bestanden fra trin 3,4. Inkuber i 16 − 24 timer ved 30 °C med omrystning ved 150 rpm. Placer 900 mL SD URA- glucosebouillon ved 30 °c natten over for at forvarme mediet.
  2. Tilsæt hele 100 mL af overnight kulturen til den forvarmede 1 L kolbe. Inkuber i 4 − 5 timer ved 30 °C med omrystning ved 150 rpm.
    1. Pellet kulturen ved 6.000 x g i 10 minutter ved 4 °c.
    2. Kassér supernatanten. Resuspension af pellet i 250 mL sterilt vand. Pellet kulturen ved 6.000 x g i 5 min ved 4 °c.
    3. Kassér supernatanten. Resuspension af pellet i 250 mL af 1 mM LiAc. Pellet kulturen ved 6.000 x g i 5 min ved 4 °c.
    4. Fjern LiAc og resuspension pellet i 9,6 mL 50% PIND 3350. Tilsæt 1,44 mL 1M LiAc, 2 mL 2 mg/mL silde sæddna, 50 μg af pYep13 genomisk bibliotek (ATCC 37323). Justér lydstyrken til 15 mL med sterilt vand. Bland forsigtigt ved inversion.
    5. Der inkubates i et vandbad ved 30 °C i 30 minutter.
    6. Tilsæt 750 μL dimethylsulfoxid (DMSO) for at forbedre Transformations effektiviteten. Inkuber i et vandbad ved 42 °C i 30 min. Bland med blid inversion hver 10 min.
    7. Pellet gæren ved 3.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    8. Supernatanten kasseres, og pelleten opslæmmes i 10 mL sterilt vand. Pellet ved 3.000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
    9. Resuspension af pellet i 8 mL sterilt vand.
    10. For at bestemme Transformations effektiviteten fortyndes 1:10 og plade 100 μL af hver fortynding på SD URA- leu- glucose agar (trin 1,8).
    11. Plade 200 μL af prøven på SD URA- leu- galactose agar (trin 1,9) plader. Brug 50 plader i alt.
    12. Inkuber ved 30 °C i 48 − 96 timer, eller indtil kolonierne optræder.
      Bemærk: kolonier optræder generelt på glucose-agar-plader ved 48 − 72 timer og galactose-agar plader ved 72 − 96 timer.
  3. Patch kolonier (potentielle redningsaktioner) på SD URA- leu- galactose agar (trin 1,9) for at udvide og gøre bestanden. Inkubere ved 30 °C i 24 − 48h.
  4. 5 mL af SD URA- leu-glucose- bouillon (trin 1,10) ved hjælp af den del af plasteret, som Inkuber natten over ved 26 °C med omrystning ved 150 rpm.
    1. Tilsæt 180 μL af det sterile vand til 5 brønde af en 96 brønd plade (a2 − A6).
    2. Vortex natten kultur til at blande.
    3. Tilsæt 180 μL gær til første brønd (a1). Serielt fortyndet 1:10 (seks prøver i alt inklusive ufortyndet).
    4. Ved hjælp af en multikanals pipette, spot 5 μL af hver fortynding på SD URA- GLUCOSE og SD URA- galactose agar plader. Medtag giftig Effector alene som en kontrol.
    5. Inkuber ved 30 °C i 48 h.
  5. Sammenlign væksten af gæren, der udtrykker den giftige Effector alene til gær indeholdende de potentielle suppressorer. Kun gå videre med potentielle suppressorer, der har formindsket toksicitet i forhold til gær udtrykker Effector alene.

5. Identificer og bekræft suppressorer

  1. 5 mL SD URA- leu-glucose- bouillon (trin 1,10) med 100 μL gær fra trin 4,4 og Inkuber natten over ved 30 °c med omrystning ved 150 rpm.
    1. Pellet gæren ved 3.000 x g i 2 minutter ved stuetemperatur. Kassér forsigtigt supernatanten med en pipette.
    2. Isoler plasmid med et gær plasmid miniprep kit efter producentens anvisninger.
  2. Omdanne den isolerede plasmid til E. coli kompetente celler og plade hele OMDANNELSEN på lb agar med 100 μg/ml carbenicillin. Inkubere ved 37 °C i 24 timer.
  3. Der inokuleres 10 mL LB-bouillon indeholdende 100 μg/mL carbenicillin, med tre kolonier fra pladen og inkuberes ved 37 °C natten over med omrystning ved 150 rpm.
    1. Pellet kulturer ved 3.000 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Isoler plasmid ved hjælp af et miniprep-sæt efter producentens anvisninger.
  4. Retransformér den giftige gær med de isolerede plasmid'er fra trin 5.3.1 efter trinene i del 3 i protokollen.
    1. Der inokuleres 5 mL SD URA- leu- glucosebouillon med en koloni fra Transformations pladen. Inkuber natten over ved 30 °C med omrystning ved 150 rpm.
    2. Spot på URA- leu- glucose og galactose agar for at bekræfte suppression af toksicitet.
  5. Sekvens ved hjælp af pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) og pYep13 R (TGATGCCGGCCACGATGC) primere til at identificere gær ORFs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Før den egentlige gær suppressor skærm kan udføres, skal Effector protein af interesse testes for toksicitet i gær. Dette opnås ved at udtrykke det protein af interesse i gær under kontrol af en galactose-inducerbar promotor. Vækst på glucose (noninducerende betingelser) bør først sammenlignes for at sikre toksicitet er specifikt på grund af ekspression af det protein af interesse og er ikke en generel defekt. Som vist i figur 3manifesterer toksiciteten sig som mindre kolonier og/eller reduceret vækst. En 2 − 3 log fald i gær vækst er ideel til gær suppressor skærme.

Som vist i figur 4, kan toksiciteten og suppressor skærmen udføres i otte trin ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i afsnittet protokol. Genet af interesse er klonet ind i en egnet vektor1, og de resulterende konstruktioner omdannes til gær til at vurdere toksicitet. Denne undersøgelse bruges CT229 som det gen af interesse og pYesNTA-kan som vektor. Desuden blev ekspression af hans-mærkede fusionsprotein bekræftet af Western blotting. Ideelt set bør en 2 − 3 log reduktion i gær dyrket på galactose-holdige medier observeres. Hvis det protein af interesse er giftigt for gær (figur 3 og figur 4), kan suppressor skærmen udføres ved at omdanne den giftige stamme med gær genomisk bibliotek pYep13. Transformanter er belagt på glucose agar til at bestemme transformation effektivitet og galactose agar til at identificere potentielle suppressorer. Ved hjælp af denne protokol blev der opnået en mindste Transformations effektivitet på 5 x 105 med i alt 10 − 250 kolonier på galactose agar. Patching disse kolonier på SD URA- leu- galactose agar (figur 4) hjulpet i identifikationen af sande suppressorer, fordi mange falske positiver ikke vil vokse, når lappet. Her blev 50 kolonier lappet og otte kloner at undertrykt Effector toksicitet blev opnået (figur 4). Spotting suppressorer på SD URA- leu- galactose agar blev gjort for at bekræfte undertrykkelse af toksicitet. Som det fremgår af figur 4, har PSup1 og psup 2 undertrykt Effector proteinets toksicitet, hvorimod pSup3 ikke gjorde det. Derfor blev pSup3 kasseret. Plasmids blev efterfølgende isoleret fra suppressorer og omdannet til E. coli for at øge plasmid udbyttet. Plasmid kan derefter omdannes til den giftige gær for at bekræfte, at det isolerede plasmid definitivt undertrykker Effector toksicitet (figur 4). Mens de fleste af de isolerede plasmider bør redde toksicitet, lejlighedsvis en plasmid, som ikke undertrykker toksicitet, når retransformeres til den giftige gær stamme opnås. Disse plasmider kasseres, og kun dem, der undertrykker toksicitet efter retransformation bør sorteres.

Den isolerede plasmid vil indeholde flere gær ORFs4. For at identificere, hvilket er den sande suppressor, hver ORF kan individuelt klonede og udtrykkes i den giftige gær stamme som tidligere beskrevet1,2,3,4.

Figure 1
Figur 1: PCR amplifikation af målgenet. CT229 fra Chlamydia trachomatis blev L2 blev PCR forstærket fra genomisk DNA. PCR-produkter blev analyseret på en 1% agopstået gel farvet med ethidium bromid. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: pYesNTA-kan plasmid kort. Målgenet af interesse blev klonet ind i Multiple kloning site (MCS) af pYesNTA-kan. kanamycin blev brugt til udvælgelse i E. coli og uracil Dropout blev brugt til udvælgelse i S. cerevisiae. Ekspression af hans-mærkede fusionsprotein blev verificeret af Western blotting. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentative gær toksicitet resultater. Effector proteiner af interesse blev klonet ind i pYesNTA-kan. sekvens-verificerede plasmider blev omdannet til S. cerevisiae og transformanter blev serielt fortyndet og spottet på URA- glucose og galactose agar til vurdering af toksicitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: oversigt over gæren suppressor skærmen. Målgenet af interesse blev klonet ind i pYesNTA-kan og plasmider blev omdannet til S. cerevisiae. Transformanter blev serielt fortyndet og spottet på URA- glucose og galactose agar for at vurdere toksicitet. For at identificere den vej, der er målrettet mod det giftige Effector protein, blev gærstammen, der udtrykker det giftige protein, omdannet med et gær-genomisk bibliotek. Kolonier blev lappet på URA- leu- galactose agar og spottet for at vurdere toksicitet. Plasmids blev isoleret fra dem, der undertrykker toksiciteten af Effector protein. Plasmider blev reomdannet til den giftige gærstamme for at bekræfte, at det isolerede plasmid er en suppressor. Plasmider fra suppressorer blev sekvenserede for at identificere gær ORFs til stede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol skitserer trin-for-trin procedurer for at identificere vært biologiske veje målrettet af bakterielle Effector proteiner ved hjælp af en modificeret gær toksicitet og suppressor skærm. Den gærstamme, der anvendes, S. cerevisiae W303, er auxotrofe for både uracil og leucin. Uracil auxotrophy af stammen bruges til at vælge gær bærer proteinet af interesse på pYesNTA-kan vektor, mens leucin auxotrophy bruges til at vælge for gær genomisk bibliotek vektor pYep13. Gær genomisk bibliotek plasmider bære 3 − 13 orf'er, så hver ORF skal individuelt klonet ind i P415-ADH vektor6 eller en lignende vektor og retransformeres til den giftige gær til at identificere, som er den sande suppressor. Det er typisk at identificere flere suppressorer, der repræsenterer en værts biologisk vej. Suppressorer kan undertiden være direkte bindende partnere af det bakterielle protein af interesse, men ikke altid.

Generering gær kloner transporterer bakterielle protein af interesse på pYesNTA-kan er det første store skridt og stor omhu bør træffes for at bevare integriteten af disse kloner så hurtigt som muligt, fordi der er stærkt negativt valg for gær transporterer giftige proteiner, selv uden forsætlig galactose induktion, og de kan miste plasmid. Lejlighedsvis er der plasmid tab, selv når gæren holdes under udvælgelse på Dropout medier. En metode er tidligere blevet rapporteret at mindske forekomsten af plasmid tab ved linearizing vektoren og integrere det inden for gær genom1.

En stor ulempe ved disse teknikker er, at suppressor skærmen kun giver meningsfulde data, hvis overekspression af bakterien Effector protein udløser en observerbare og konsekvent vækst defekt i gær. Den primære vanskelighed ved denne metode er, når der ikke identificeres nogen suppressorer. Det er svært at afgøre, om en undladelse af at identificere suppressorer skyldes biologiske årsager eller tekniske problemer. Fra et biologisk perspektiv, kan der være flere årsager: det protein af interesse kunne være så giftigt, at proteiner fra genombiblioteket ikke er i stand til i væsentlig grad at undertrykke toksicitet, den målrettede pathway kan være ude af stand til redning, eller talrige Co-udtrykte faktorer kan være nødvendige for at overvinde den toksiske virkning. Nærmer den biologiske forklaring er udfordrende, da der er mange udefineret variabler til dissekere. Fordi der er en etableret protokol, udforske tekniske forklaringer er en langt mere Tractable tilgang. Fra et teknisk synspunkt, en undladelse af at identificere suppressorer er sandsynligvis resultatet af lav transformation effektivitet af gær genomisk bibliotek. Denne protokol bruger ATCC S. cerevisiae AB320 delvist fordøjet genomisk bibliotek i pYEp13. Andre biblioteker kan være tilstrækkelige såvel som andre vektorer, men denne protokol bruger specifikt ATCC-biblioteket, og der er ingen undersøgelser i øjeblikket offentliggjort, der rapporterer alternative bibliotek eller vektor kilder. Det anbefales kraftigt, at dækningen af gærgenomet skal være mindst 10x, eller underrepræsentation kan hæmme identifikationen af suppressorer. Nedsat Transformations effektivitet kan bringe disse tal under 1x. Således kan dele af gærgenomet ikke være repræsenteret i suppressor-skærmen. Lav transformation effektivitet kan skyldes mange spørgsmål, herunder dårlige reagenser eller dårlig bibliotek forberedelse. Denne metode overholder i høj grad DMSO/LiAc-Transformations metoden, der først blev lagt frem af Hill et al.7. Det anbefales, at nye DMSO, 50% PEG, og frisk sild sperm DNA købes og forberedes til transformationer og anvendes udelukkende til disse analyser for at mindske kontaminering eller forringelse af kvaliteten af reagenserne. DMSO er meget hygroskopisk og absorberer vand fra atmosfæren let. Derfor anbefales det at gøre mange individuelle brug aliquoter for at undgå gentagen åbning af en container låg og udsættelse for atmosfæren. Sild i høj kvalitet kan opbevares ved-20 °C og er stadig egnet til brug i flere år, selv om der skal tilberedes et frisk præparat fra bestanden for hver transformation. Når kogt og afkølet, sild sperm DNA bør ikke genkoges eller genbruges, så det er bedst at kun fjerne, hvad der er behov for, og undgå at gøre mere end det er nødvendigt for den nuværende transformation. Opmærksomhed på detaljer kan i høj grad forbedre omdannelsen effektivitet af gær og forbedre chancerne for at identificere en suppressor.

I betragtning af at gæren pYep13 vektor bærer 3 − 13 forskellige gær Orf'er, at reducere antallet af falsk-positive plasmider er afgørende for at identificere suppressorer. Gær kan tage op og havne flere kopier af lignende vektorer, mens den generelle visdom forbundet med plasmid uforenelighed traditionelt dikterer, at E. coli kun vedligeholder en type plasmid med samme oprindelse replikation (Ori) på et tidspunkt, selv om dette ikke altid er tilfældet. Dette kan blive et stort problem, når man forsøger at identificere suppressor-kandidater. Hvis der identificeres suppressor gærkloner, vil plasmiderne blive ekstraheret og omdannet til E. coli til formering og efterfølgende sekvensering til identifikation. Når kandidaten suppressor plasmid er blevet isoleret og omdannet til E. coli, anbefales det kraftigt, at der plukkes mindst fem E. coli -kolonier til sekvensering, da det er muligt, at individuelle kloner kan bære forskellige plasmid'er. Da e. coli bør kun være i stand til at udbrede en plasmid ad gangen, hvis gær isolation giver flere plasmider, forskellige E. coli kloner på pladen bør bære kun én af dem ad gangen. Derfor picking fem kolonier baseret på normal transformation effektivitet i E. coli bør vise, om klonerne bærer de samme eller forskellige plasmider. Hvis flere plasmider opstår efter sekvensering af plasmider fra E. coli, så hver enkelt skal omdannes til den giftige gær klon og vurderes for redning af vækst defekt. Desuden, selv om kun en enkelt suppressor plasmid er identificeret, for stringens og reproducerbarhed retransformation af plasmid i den giftige klon fremmes.

Den gær suppressor assay er et meget stort eksperiment og passende tid og materialer bør planlægges i overensstemmelse hermed. Denne protokol indeholder mange detaljer, der skal overholdes strengt, og det anbefales, at forskeren gennemfører disse assays omhyggeligt læse og se protokollen i fuld før du starter en analyse. Dette er en flersidet procedure, herunder både bakterier og gær, der skal dyrkes ved forskellige temperaturer. Isolering af plasmider fra gær kan undertiden være svært på grund af deres hårde cellevæg og brugen af DMSO hjælper med at opnå højere Transformations effektivitet.

En af de største fordele ved gær toksicitet og suppressor skærm er, at bakterien Effector ikke behøver at fysisk binde til værten substrater for enhver mærkbar mængde tid til at opdage den formodede vej målrettet. Kun en lille håndfuld undersøgelser har rapporteret ved hjælp af denne eller en lignende teknik1 – 5. Men, der er rapporter om teknikker, der identificerer vært veje og mange teknikker til at screene for bindende partnere af bakteriel Effector proteiner. Kramer et al. rapporterede en ny systembiologi tilgang til at identificere veje rettet af bakteriel Effector proteiner8. Teknikken brugte en haploide sletning stamme samling af S. cerevisiae til skærmen for mutanter følsom over for Shigella Effector Osp4. Ved hjælp af denne teknik, Osp4 var knyttet til regulering af MAPK signalering og dæmpning af medfødte immunitet i værtsceller. Array-baseret, High-gennemløb, automatiseret gær-to hybrid skærme kan nu hurtigt identificere formodede bakterielle Effector bindende partnere ved screening mange på samme tid mod millioner af Host proteiner9. Tilsvarende, højt gennemløb immunopræcipitationer kombineret med massespektrometri bliver brugt til at masse identificere formodede bindende partnere i hele familier af bakterielle Effector proteiner10. Mens mange af disse undersøgelser kan fremskynde tidsplanen for Effector protein karakterisering, de sjældent giver indsigt i, hvad fysiologiske processer bliver manipuleret, og hvad det holistiske resultat af disse interaktioner er. Således teknikker såsom gær toksicitet og suppressor skærm er afgørende for at belyse cellulære processer, der manipuleres af disse Effector proteiner. På et tidspunkt skal observationer, som identificerer bindende partnere eller veje, som er målrettet mod bakterielle Effector proteiner, vende tilbage til modeller med cellulære infektioner for at afgøre, om disse in vitro-fund er sande i fysiologisk relevante scenarier. Genetisk manipulation af forpligte intracellulære patogener som C. trachomatis har været en stor forhindring indtil for nylig11 – 15 og generation af site-specifikke mutanter til at studere Effector proteiner ikke var muligt. I de sidste par år selv, en revolution i at generere Chlamydia mutanter, der supplerer dem, og overudtrykker målproteiner har fundet sted. Disse nylige fremskridt har i høj grad forbedret værdien af de oplysninger, der stammer fra undersøgelser ved hjælp af toksicitet og suppressor skærme, da det nu er muligt at gå fra gær direkte til infektion for at sonde validiteten af resultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker Shelby Andersen, Abby McCullough og Laurel Woods for deres hjælp med disse teknikker. Denne undersøgelse blev finansieret af Startup funds fra University of Iowa Department of Microbiology og Immunology til Mary M. Weber.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Fisher Scientific BP2641500
Galactose MilliporeSigma G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit ThermoFisher Scientific K0691
GeneJet PCR purification kit ThermoFisher Scientific K0701
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo K0503
Glucose MilliporeSigma G8270-1KG
Herring Sperm DNA Promega D1811
KpnI-HF New England Biolabs R3142S
Lithium acetate dihydrate MilliporeSigma L6883-250G
Peptone Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530
Poly(ethylene glycol) 3350 MilliporeSigma 1546547-1G
pYep13 ATCC 37323
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
Tryptophan MilliporeSigma 470031-1G
XhoI-HF New England Biolabs R0146S
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500
Yeast miniprep kit Zymo D2001
Yeast nitrogen base without amino acids MilliporeSigma Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1501-20G without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1771-20G without uracil, leucine, tryptophan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Tags

Genetik bakteriel Effector protein gær suppressor Effector protein funktion gærskærme Klamydia trachomatis type III udskillet Effector protein pathway identifikation
Identifikation af værts veje, som er målrettet mod bakterielle Effector-proteiner ved hjælp af gær toksicitet og suppressor skærme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faris, R., Weber, M. M.… More

Faris, R., Weber, M. M. Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens. J. Vis. Exp. (152), e60488, doi:10.3791/60488 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter