זיהוי של מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור באמצעות רעילות שמרים מסכי מדכא

Summary

פתוגנים חיידקיים מפרישות חלבונים לתוך המחשב המארח המטרה תהליכים ביולוגיים קריטיים. זיהוי מסלולים המארחים ממוקד על ידי חלבונים החיידק אפקטור הוא המפתח לטיפול פתוגנזה מולקולרית. כאן, שיטה באמצעות מדכא שמרים שונה ומסך רעילות כדי להבהיר מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור רעיל מתואר.

Abstract

חיידקים תאיים להפריש גורמים התקפה אלימה הנקרא אפקטור חלבונים לתוך ציטוסול מארח כי לפעול לחתור מארחים חלבונים ו/או מסלולים ביולוגיים הקשורים שלהם לטובת החיידק. זיהוי של חלבונים בקטריאלי החיידק אפקטור הפכה יותר לניהול בשל ההתקדמות ברצף הגנום החיידקי ואת הופעתו של אלגוריתמים המאפשרים זיהוי סיליקו של גנים קידוד הפרשת מועמדים ו/או eukaryotic כמו תחומים. עם זאת, זיהוי של גורמים והתקפה אלימה אלה הוא רק צעד התחלתי. באופן טבעי, המטרה היא לקבוע את התפקוד המולקולרי של החלבונים של אפקטור ולהבהיר כיצד הם מתקשרים עם המארח. בשנים האחרונות, טכניקות כמו מסך שני שמרים היברידית בקנה מידה גדול immunoprecipitations בשילוב עם ספקטרומטר המסה סייעו בזיהוי של אינטראקציות חלבונים חלבון. למרות שזיהוי של שותף כריכה מארח הוא הצעד הראשון המכריע לקראת הבעת המצאת הפונקציה המולקולרית של חלבון אפקטור חיידקי, לפעמים חלבון מארח נמצא יש פונקציות ביולוגיות מרובות (למשל, actin, clathrin טובולין), או חלבון חיידקי לא יכול פיזית לאגד חלבונים מארחים, לשלול את החוקר של מידע חיוני על מסלול מארח מדויק להיות מניפולציות. הרעלת שמרים שונה מסך בשילוב עם מסך משתיק קול הותאם כדי לזהות מסלולים מארחים המושפעים על ידי חלבונים החיידק אפקטור. מסך רעילות מסתמך על השפעה רעילה של שמרים הנגרמת על ידי חלבון אפקטור מפריעה המסלולים הביולוגיים המארחים, אשר לעתים קרובות מתבטא כפגם גדילה. ביטוי של הספרייה גנומית שמרים משמש כדי לזהות גורמים מארחים לדכא את רעילות של חלבון אפקטור חיידקי, ובכך לזהות חלבונים במסלול כי החלבון מטרות מטרה. פרוטוקול זה כולל הוראות מפורטות עבור מסכי רעילות ומדכא. ניתן לבצע טכניקות אלה בכל מעבדה המסוגלת לשכפול מולקולרי וטיפוח של שמרים ומסלול קולי.

Introduction

הדו ח הראשון של ההליכים הדומים לאלה שהוצגו כאן אפיינו את הלגיונרים האלה מסוג העירוי הרביעי, שהוא deAMPylase שמשנה Rab1¹. טכניקות דומות שימשו לאפיון של מספר L. משאבה מנועי ^1,2,3. השיטה הותאמה כדי לאפיין את הסוג Coxiella בורנתיבי הרביעי^חלבון,ולאחרונה את השירות של טכניקה זו הורחבה לאפיון של כלמידיה trachomatis ממברנה חלבונים⁵ .

פרוטוקול זה ניתן לפרוץ לשני חלקים עיקריים: 1) את המסך רעילות שמרים, שבה חלבון החומר החיידקי של עניין מתבטא שמרים שיבוטים מוקרן לפנוטיפ רעיל כפי שמעידים על ידי פגם גדילה, ו 2) מסך מדכא שמרים , שבו הפנוטיפ הרעיל מדוכאים על ידי ביטוי של ספרייה גנומית שמרים במתח הרעיל. כך, את המסך רעילות היא מסך עבור פנוטיפים רעילים המניפסט כמו ליקויים בגדילה כאשר החיידק החיידקי של העניין הוא ביטוי יתר. שיבוטים רעילים, השתנה בהצלחה עם וביטוי האפקטור חיידקי, נבחרו ונשמר לשלב הבא. הצעד העיקרי השני כרוך יתר על הביטוי בספרייה גנומית חלקית שמרים מתעכל בשכפול שמרים רעילים. פלמידים ממציא את הספרייה גנומית שמרים הציע לשימוש בפרוטוקול זה לשאת 5-20 kb מוסיף, בדרך כלל מתאים 3-13 שמרים לקרוא מסגרות לקריאה (ORF) של גודל הגן הממוצע של ~ 1.5 kb על פני כל פלמידים, המייצגים גנום שמרים כולו מכוסה כ-10x. חלק זה של השיטת נקרא מסך מדכא, כמו המטרה היא לדכא את רעילות של חלבון אפקטור חיידקי. הפלמיונים הפוטנציאליים של מדכא מבודדים משמרים, ברצף ומזוהים הדיכוי ORFs. הרציונל הנמצא בבסיס מסך מדכא הוא כי חלבון האפקטור נקשר, אינטראקציה עם, ו/או להתמקד ברכיבים של מסלול מארח זה מטרות, וכי מתן אלה חלבונים מארחים בחזרה עודף יכול להציל את ההשפעה הרעילה על השביל ולכן, פגם הגדילה. כך, מזוהה ORFs כי לדכא רעילות לעתים קרובות מייצגים משתתפים רבים של מסלול מארח. ניסויים אורתוגונאליות מבוצעים לאחר מכן כדי לוודא כי האפקטור חיידקי אכן אינטראקציה עם השביל מעורבים. הדבר הכרחי במיוחד אם התגלתה שותפה מחייבת כגון clathrin או אקטין, משום שחלבונים אלה מעורבים בהמון תהליכים מארחים. ניסויים נוספים יכולים להבהיר את התפקוד הפיזיולוגי של חלבון האפקטור במהלך הזיהום. רעילות מסכי מדכא הם גם כלים רבי עוצמה לפענוח התפקוד הפיזיולוגי של חלבונים אפקטור חיידקי כי לא לאגד פיזית מארח חלבונים עם מספיק כדי לזהות על ידי immunoprecipitation או כי אינטראקציה עם ארח באינטראקציות פגע וברח אנזימטיות שאינן מזוהות על-ידי מסך היברידי משני שמרים.

למרות מסך מדכא יכול להיות שיטה רבת עוצמה כדי לחשוף אינטראקציות פיזיולוגיות פוטנציאליות בין חלבונים אפקטור חיידקים ומסלולים מארחים, חלבון אפקטור חיידקי חייב לגרום לפגם גדילה שמרים, אחרת באמצעות זה ב מסך משתיק קול יהיה שימוש קטן. יתר על כן, הפנוטיפ הרעיל חייב לגרום לפחות 2-3 יומן רישום₁₀ הגרעון בצמיחה או יהיה קשה לזהות דכאי. אם המעבדה מוגדרת לתרבות התאים, הקרנת חלבונים לרעילות בקווי תאים משותפים כגון הלה יכולה לעתים קרובות להעניק תובנה לגבי המאמץ להמשיך במסך הרעילות לשמרים. ביטוי חוץ רחמי של חלבון אפקטור בתאי הלה לפעמים גורמת לרעילות כי מתאים מאוד רעילות בזן שמרים המשמש מסכים אלה⁴. סימני ההיכר של הלחץ בתאי הלה כוללים אובדן סיבי לחץ, ניתוק תאים מהצלחת, ועיבוי גרעיני המציין אפופטוזיס. כל אינדיקציה חזותית של מתח בתאי הלה להפוך את החלבון של עניין מועמד טוב לגרימת פגם גדילה בשמרים, אשר לשכפל הרבה יותר במהירות, ולכן מגיבים יותר להפרעות חיוניות של מסלולים חיוניים.

יצוין כי מסך מדכא לא תמיד לזהות שותפים איגוד מארח כמו דכאי, אבל זה עדיין יכול לסבך רכיבים קריטיים של מסלול מארח (s) ממוקדות, מניב השקפה הוליסטית של התהליכים הביולוגיים נחטף על ידי ה חלבון אפקטור חיידקי. על פני השטח, זה נראה מנוגד לאינטואיציה, משום שמתן שותף מחייב בחלבון האפקטור המיותר צפוי להציל את הפגם בגדילה. במאמצים לזהות מסלולים המיועדים על ידי C. trachomatis אפקטור חלבון CT229 (cpos), אשר נקשר לפחות 10 שונים רב GTPases במהלך זיהום⁵, אף אחד מהשותפים מחייב ראב לדכא את רעילות של CT229. עם זאת, מדכאי רבים המעורבים בסחר בסמים (CCV) מצופים, אשר הובילו לעבודה נוספת הממחיש כי CT229 במפורש פוגעת בסחר בנשק CCV. באופן דומה, בעת חקירת ה -C. burנתיבי אפקטור חלבון Cbu0041 (cira) כמה Rho GTPases כי הצילה את הפגם בגידול שמרים זוהו, ומאוחר יותר נמצא כי cira פונקציות כמו Gtpases הפעלת חלבון (גאפ) עבור rhoa⁴.

השימושיות של מסך מדכא שמרים להסבר מסלולים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריות אפקטור לא יכול להיות יתר על המידה, וחוקרים אחרים מנסה לאפיין חלבונים תאיים אפקטור חיידקים יכול להפיק תועלת רבה מ טכניקות אלה. אלה מספרים הם בעלי ערך אם immunoprecipitations ו/או שמרים-שני מסכי היברידית לא הצליחו למצוא שותף מחייב והוא יכול להבהיר איזה מסלולים מיועדים על ידי חלבון אפקטור חיידקי. כאן, פרוטוקולים מפורטים עבור מסכי רעילות ומדכא כדי לזהות מסלולים ביולוגיים מארחים ממוקד על ידי חלבונים בקטריאלי תאיים אפקטור מסופקים, כמו גם כמה מכשולים נפוצים מנוסים בעת שימוש אלה בחני וה פתרונות תואמים.

Protocol

1. הכנת מדיה וריאגנטים הערה: לוחיות הרישוי צריכות להיות מוכנות לפני היום, וטובות לחודש אחד. מדיה וריאגנטים ניתן לעשות בכל שלב וטוב לחודש 1. להכין 1 L של תמיסת גלוקוז (10% w/v) על ידי המסת 100 g של D-(+)-גלוקוז ב 800 מ ל של מים מזוקקים בגביע 1, 000 mL. כוונן את אמצעי האחסון ל-1 ל’ עם מים מזוקק?…

Representative Results

לפני מסך מדכא שמרים בפועל ניתן לבצע, חלבון הריבית של אפקטור העניין חייב להיבדק עבור רעילות בשמרים. זה מושגת על ידי ביטוי חלבון העניין של שמרים תחת שליטתה של מקדם גלקטוז-inducible. הצמיחה על גלוקוז (תנאים שאינם מחייבים) יש להשוות תחילה כדי להבטיח רעילות היא במיוחד בשל ביטוי של חלבון הריבית והוא ל…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הליכים צעד אחר צעד לזיהוי מסלולים ביולוגיים מארחים ממוקד על ידי חלבונים החיידק אפקטור באמצעות הרעלת שמרים שונה מסך מדכא. זן שמרים השתמשו, ס cerevisiae ס W303, הוא auxotrophic עבור אורציל ו leucine. Uracil הגביע של הנבג משמש כדי לבחור שמרים נושאת את החלבון של עניין על pYesNTA-Kan וקטור בעוד לאו?…

Materials

Agar	Fisher Scientific	BP2641500
Galactose	MilliporeSigma	G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit	ThermoFisher Scientific	K0691
GeneJet PCR purification kit	ThermoFisher Scientific	K0701
GeneJet plasmid miniprep kit	Thermo	K0503
Glucose	MilliporeSigma	G8270-1KG
Herring Sperm DNA	Promega	D1811
KpnI-HF	New England Biolabs	R3142S
Lithium acetate dihydrate	MilliporeSigma	L6883-250G
Peptone	Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530
Poly(ethylene glycol) 3350	MilliporeSigma	1546547-1G
pYep13	ATCC	37323
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S
Tryptophan	MilliporeSigma	470031-1G
XhoI-HF	New England Biolabs	R0146S
Yeast extract	Fisher Scientific	BP1422-500
Yeast miniprep kit	Zymo	D2001
Yeast nitrogen base without amino acids	MilliporeSigma	Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	MilliporeSigma	Y1501-20G	without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements	MilliporeSigma	Y1771-20G	without uracil, leucine, tryptophan