Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Идентификация хост Пути целевых бактериальных протеинов с использованием дрожжей токсичности и супрессорэкранов

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60488
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

Summary

Бактериальные патогены выделяют белки в хост, которые нацелены на важнейшие биологические процессы. Выявление путей пребывания, мишенью для белков бактериальных эффекторов является ключом к решению молекулярного патогенеза. Здесь описан метод с использованием модифицированного супрессора дрожжей и экрана токсичности для выяснения путей пребывания, мишенью которыми становятся токсичные бактериальные протеины.

Abstract

Внутриклеточные бактерии выделяют вирулентные факторы, называемые эффекторными белками в цитозол хозяина, которые действуют, чтобы подорвать белки-хозяева и/или связанные с ними биологические пути в пользу бактерии. Идентификация допустимых бактериальных эффекторов белков стала более управляемой благодаря достижениям в секвенировании бактериального генома и появлению алгоритмов, которые позволяют в силико-идентификации генов, кодирующих секрецию кандидатов и/или эукариотических Доменов. Однако выявление этих важных факторов вирулентности является лишь первым шагом. Естественно, цель состоит в том, чтобы определить молекулярную функцию эффекторов белков и выяснить, как они взаимодействуют с хозяином. В последние годы такие методы, как дрожжи двухгибридного экрана и крупномасштабных иммунопрециций в сочетании с масс-спектрометрии помогли в выявлении белково-белковых взаимодействий. Хотя идентификация партнера, связывающего хозяина, является важнейшим первым шагом на пути к выяснению молекулярной функции белка бактериального эффектора, иногда протеин-хозяин имеет несколько биологических функций (например, актин, клатрин, тубулин) или бактериальный белок не может физически связывать белки-хозяева, лишая исследователя важной информации о точном пути пребывания, которым манипулируют. Модифицированный экран токсичности дрожжей в сочетании с экраном супрессора был адаптирован для идентификации путей пребывания, пострадавших от белков бактериальных эффекторов. Экран токсичности опирается на токсическое воздействие на дрожжи, вызванное эффектор белка вмешательства в принимающей биологических путей, который часто проявляется как дефект роста. Выражение дрожжевой геномной библиотеки используется для выявления факторов, которые подавляют токсичность белка бактериального эффектора и таким образом определить белки в пути, что эффектор белка цели. Этот протокол содержит подробные инструкции как для токсичности, так и для экранов супрессора. Эти методы могут быть выполнены в любой лаборатории, способной молекулярного клонирования и выращивания дрожжей и кишечной палочки.

Introduction

Первый доклад процедур, аналогичных тем, которые представлены здесь характеризуется Legionella пневмофилы типа IV эффектор СидД, deAMPylase, который изменяет Rab11. Сопоставимые методы были использованы для характеристики нескольких L. пневмофила эффекторов1,2,3. Анализ был адаптирован для характеристики Coxiella burnetii типа IV эффектор белка4, и в последнее время полезность этой техники была расширена для характеристики Chlamydia trachomatis включения мембранных белков5 .

Этот протокол может быть разбит на две основные части: 1) экран токсичности дрожжей, в котором бактериальный белок, представляющий интерес, выражается в дрожжах, а клоны проверяются на токсичный фенотип, о чем свидетельствует дефект роста, и 2) экран супрессора дрожжей , в котором токсичный фенотип подавляется выражением дрожжевой геномной библиотеки в токсичном штамме. Таким образом, экран токсичности является экраном для токсичных фенотипов, которые проявляются как дефекты роста, когда бактериальный эффект интереса является переэкспрессива. Токсичные клоны, успешно трансформированные с помощью бактериального эффектора и выражающие бактериальный эффектор, отбираются и сохраняются для следующего шага. Второй важный шаг включает в себя переэкспрессирование частично переваренных дрожжей геномной библиотеки в токсичных клон дрожжей. Плазмиды, составляющие дрожжевой геномной библиотеки, предложенные для использования в этом протоколе нести 5'20 кб вставки, как правило, соответствующие 3'13 дрожжей открытых кадров чтения (ORF) среднего размера гена 1,5 кб во всех плазмидах, представляющих весь геном дрожжей покрыты примерно в 10 раз. Эта часть ассея называется экраном супрессора, так как цель состоит в том, чтобы подавить токсичность белка бактериального эффектора. Потенциальные супрессорные плазмиды изолированы от дрожжей, секвенируются, и подавления ORFs определены. Обоснование, лежащее в основе экрана супрессора, состоит в том, что протеин-эффектор связывается, взаимодействует с и/или переполняет компоненты пути пребывания, на которые он нацелен, и что предоставление этих белков-хозяев в избытке может спасти токсическое воздействие на пути и, таким образом, дефект роста. Таким образом, выявленные ORF, подавляющие токсичность, часто представляют несколько участников пути хоста. Ортогоналальные эксперименты затем выполняются для проверки того, что бактериальный эффектор действительно взаимодействует с вовлеченным пути. Это особенно необходимо, если связывающий партнер, такой как клатрин или актин, был выявлен, потому что эти белки участвуют во множестве принимающих процессов. Дальнейшие эксперименты могут затем выяснить физиологическую функцию белка-эффектора во время инфекции. Токсичность и супрессор экраны также мощные инструменты для расшифровки физиологической функции бактериальных белков, которые физически не связывают белки-хозяева с сродствами, достаточными для обнаружения иммунопрецицией или которые взаимодействуют с хост в ферментативных хит-и-запустить взаимодействия, которые не могут быть обнаружены дрожжи-два гибридного экрана.

Хотя экран супрессора может быть мощным методом, чтобы выявить потенциальные физиологические взаимодействия между бактериальными белками-эффекторами и путями хозяина, бактериальный белок должен вызвать дефект роста в дрожжах, в противном случае используя его в экран супрессора будет мало пользы. Кроме того, токсичный фенотип должен привести, по крайней мере, к дефициту роста в 2х3 журнала10, иначе будет трудно определить супрессоры. Если лаборатория создана для клеточной культуры, скрининг эффектор белков для токсичности в общих клеточных линий, таких как HeLa часто может дать представление о том, стоит ли усилия, чтобы приступить к экрану токсичности дрожжей. Эктопическое выражение белка-эффектора в клетках HeLa иногда приводит к токсичности, которая очень сильно коррелирует с токсичностью в штамме дрожжей, используемом для этих экранов4. Наблюдаемые признаки стресса в клетках HeLa включают потерю стрессовых волокон, отслоение клеток от пластины и ядерный конденсацию, указывающий на апоптоз. Любое визуальное указание стресса в клетках HeLa делает интересующий белок хорошим кандидатом для индуцирования дефекта роста в дрожжах, которые размножаются гораздо быстрее и, таким образом, более чутко реагируют на возмущение основных путей.

Следует отметить, что экран супрессора не всегда определяет партнеров-хоста, связывающих сяпок, как супрессоров, но он все еще может вовлечь критические компоненты пути хоста (ы) целевых, что дает целостное представление о биологических процессах, захваченных бактериальный эффектор белка. На первый взгляд, это кажется нелогичным, потому что предоставление связующего партнера протеина-эффектора в избытке, как ожидается, спасет дефект роста. В усилиях по выявлению путей, направленных на C. trachomatis эффектор белка CT229 (CpoS), который связывается с по крайней мере 10 различных Rab GTPases во время инфекции5, ни один из Раб связывания партнеров подавлены токсичности CT229. Тем не менее, были выявлены многочисленные супрессоры, занимающиеся торговлей везикулами с покрытием clathrin (CCV), что привело к дальнейшей работе, продемонстрировавшей, что CT229 специально подрывает торговлю ХКВ, зависящим от раба. Аналогичным образом, при исследовании C. burnetii эффектор белка Cbu0041 (CirA) несколько Rho GTPases, которые спасли дефект роста дрожжей были выявлены, и позже было установлено, что CirA функции в качестве GTPase активации белка (GAP) для RhoA4.

Полезность экрана супрессора дрожжей для выяснения путей хозяина, мишенью которыми становятся бактериальные эффекторные белки, не может быть переоценена, и другие исследователи, пытающиеся охарактеризовать внутриклеточные бактериальные эффекторные белки, могут извлечь большую пользу из эти методы. Эти анализы имеют значение, если иммунопрецитарии и / или дрожжей два гибридных экранов не смогли найти связующего партнера и может выяснить, какие пути ориентированы на бактериальный эффектор белка. Здесь предоставляются подробные протоколы для токсичности и супрессоров для определения биологических путей пребывания, нацеленных на внутриклеточные бактериальные эффекторные белки, а также некоторые из распространенных препятствий, испытываемых при использовании этих анализов и их соответствующих решений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка носителей и реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Плиты должны быть подготовлены до дня проведения ассеа и хороши в течение 1 месяца. Медиа и реагенты могут быть сделаны в любой момент и хороши в течение 1 месяца.

  1. Приготовьте 1 л раствора глюкозы (10% ж/в), растворив 100 г D-(я)-глюкозы в 800 мл дистиллированной воды в стакане 1000 мл. Отрегулируйте громкость до 1 л с дистиллированной водой. Фильтр через 0,2 мкм стерильный фильтр в стерильной 1 L бутылку хранения средств массовой информации.
  2. Приготовьте 1 л раствора галактоза (10% ж/в) путем растворения 100 г D-(я)- галактоза в 800 мл дистиллированной воды в стакане 1 л. Отрегулируйте громкость до 1 мл с помощью дистиллированной воды и процедите через стерильный фильтр объемом 0,2 мкм в стерильную бутылку для хранения средств хранения 1000 мл.
  3. Приготовьте 1 л дрожжевого экстракта пептон декстроза (YPD) агар, растворив 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 20 г глюкозы и 20 г агара в 1000 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладить в 56 градусов по Цельсию водяной бане до охлаждения. Налейте в 100 мм пластин, используя 20 мл носителей на тарелку.
  4. Приготовьте 1 l бульона YPD, растворив 10 г экстракта дрожжей, 20 г пептона и 20 г глюкозы в 1000 мл дистиллированной воды. Автоклав на 20 мин.
  5. Подготовка синтетического отсева (SD) uracil (Ура- )глюкоза агар. На 1 л растворите 6,7 г дрожжевой азотной базы без аминокислот, 1,9 г добавки отсева без урацила и 15 г агара в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56 градусов по Цельсию до температуры 50-60 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора глюкозы, подготовленного в шаге 1.1. Хорошо перемешать, аккуратно закрученного или место на перемешать пластины. Налейте в 100 мм пластин, используя 20 мл носителей на тарелку.
  6. Подготовка синтетического отсева (SD) uracil (Ура- )галактозы агара. На 1 л растворите 6,7 г дрожжевой азотной базы без аминокислот, 1,9 г добавки отсева без урацила и 15 г агара в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56 градусов по Цельсию до температуры 50-60 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора галактоза, подготовленного в шаге 1.2. Хорошо перемешать, аккуратно закрученного или место на перемешать пластины. Налейте в 100 мм пластин, используя 20 мл носителей на тарелку.
  7. Приготовить синтетический отсев (SD) урацил (Ura- )бульон глюкозы. Для 1 Л растворите 6,7 г дрожжевой азотной базы без аминокислот и 1,9 г добавки отсева без урасила в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56 градусов по Цельсию до температуры 50-60 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора глюкозы, подготовленного в шаге 1.1.
  8. Подготовка синтетического отсева (SD) uracil (Ура- )лейцин (Leu- )глюкоза агар. На 1 л растворите 6,7 г дрожжевой азотной базы без аминокислот; 1,9 г отсева дополнение без uracil, лейцин, и триптофан; 15 г агара; и 0,076 г триптофана в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56 градусов по Цельсию до температуры 50-60 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора глюкозы, подготовленного в шаге 1.1. Налейте в 100 мм пластин, используя 20 мл носителей на тарелку.
  9. Подготовка синтетического отсева (SD) uracil (Ура- )лейцин (Leu- )галактозы агара. На 1 л растворите 6,7 г дрожжевого азотного основания без аминокислот; 1,9 г отсева дополнение без uracil, лейцин, и триптофан; 15 г агара; и 0,076 г триптофана в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56 градусов по Цельсию до температуры 50-60 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора галактоза, подготовленного в шаге 1.2. Хорошо перемешайте, аккуратно закрученного или поместив на перемешать пластины. Налейте в 100 мм пластин, используя 20 мл носителей на тарелку.
  10. Приготовьте синтетический отсев (SD) uracil (Ura- )лейцин (Leu- )бульон глюкозы. На 1 л растворите 6,7 г дрожжевого азотного основания без аминокислот; 1,9 г отсева дополнение без uracil, лейцин, триптофан; и 0,076 г триптофана в 800 мл дистиллированной воды. Автоклав в течение 20 минут и охладите в водяной бане 56–60 градусов по Цельсию до температуры 50 градусов по Цельсию. Используя серологический пипетку мощностью 50 мл или стерильный цилиндр, добавьте 200 мл раствора глюкозы, подготовленного в шаге 1.1.
  11. Приготовить полиэтиленовый гликоль (PEG) раствор. Добавьте 50% w/v полиэтилена гликоля 3350 в дистиллированную воду. Стерилизовать с помощью автоклавирования.
  12. Приготовьте 1 M литий-ацетат (LiAc), растворив 10,2 г обезвоживания литиевого ацетата в 200 мл дистиллированной воды. Стерилизовать с помощью автоклавирования.
  13. Подготовка ДНК спермы сельди. Разбавить 10 мг/мл ДНК сельди до 2 мг/мл с помощью дистиллированной воды. Нагрейте при температуре 100 градусов по Цельсию в течение 5 минут и сразу же поставить на лед в течение 5 минут.

2. Клонирование гена интереса в дрожжей токсичности плазмид pYesNTA-Кан

ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время существуют различные векторы токсичности дрожжей, доступные как в коммерческом, так и в академическом плане. Экран супрессора дрожжей можно использовать в сочетании со многими из этих векторов при условии плазмида, выражающий эффектор белка интерес использует отсева выбор, кроме uracil и антибиотик маркер, кроме BlaR. Эта работа использовала модифицированный вектор pYesNTA4, 5, который включает в себя кассету сопротивления канамицина для облегчения скрининга потенциальных супрессоров. Схема клонирования должна позволить для белка-эффектора быть в кадре с промоутером Gal и его-Tag. Chlamydia trachomatis включение мембранного белка CT229 был использован в качестве доказательства принципа для этих анализов.

  1. Используйте PCR для усиления CT229 от Геномной ДНК C. trachomatis в соответствии с инструкциями производителя, используя ct229 Крпн F (CCGGTACCAATGAGCTCTCTAATTAATTAATTATCAGGT) и CT229 XhoI R (CCCTTTTTACGACGGGGTATGC) праймеры. Используйте следующие условия ПЦР: (1) 98 градусов по Цельсию на 30 с; (2) 98 градусов по Цельсию на 10 с, 55 градусов по Цельсию за 30 с, 72 градуса по Цельсию в течение 2 мин; (3) повторить шаг 2 в общей сложности 25x; (4) 72 кк в течение 10 мин; и (5) 4 градуса по Цельсию.
  2. Проанализируйте 5 ЗЛ продукта ПЦР на 1% агарозного геля(рисунок 1).
  3. Очистите оставшиеся 45 л ДНК с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Дайджест 50 зл очищенной пЦР вставить и pYesNTA-Kan(Рисунок 2) для 1 ч при 37 градусов по Цельсию в водяной бане с помощью KpnI-HF и XhoI-HF.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для pYesNTA-Kan, дайджест 5 мкг плазмиды с использованием 5 зл KpnI-HF, 5 л XhoI-HF, и 6 зл буфера в общей сумме 60 зл. Для вставки, переварить весь 50 юл очищенного продукта ПЦР с использованием 2 Зл KpnI-HF, 2 Зл XhoI-HF, и 6 л буфера.
  5. Запустите весь плазмидный дайджест на 1% агарозный гель. Выполните очистку переваренной плазмиды с помощью комплекта для извлечения геля в соответствии с инструкциями производителя.
  6. Очистите переваренную пЦР-вставку с помощью комплекта для очистки ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.
  7. Клонвайте вставку в pYesNTA-Kan, используя 2 злиц pYesNTA-Kan (шаг 2.5), 2 Зл из буфера лигазы ДНК, 1 Зл из Лиги залисения T4 и 15 зл вставки (шаг 2.6). Инкубировать при комнатной температуре 1 ч.
  8. Добавьте всю реакцию клонирования к 50 МЛ компетентных клеток кишечной палочки и выполните трансформационную реакцию.
  9. Плита всей реакции преобразования на пластине LB, содержащей 100 мкг/мл карбеничиллина.
  10. Прививать 10 мл ЛБ, содержащий 100 мкг/мл карбеничиллина с тремя отдельными колониями. Инкубировать на ночь при 37 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин.
  11. Изолировать плазмид с помощью плазмидного мини-комплекта в соответствии с инструкциями производителя.
  12. Последовательность изолированных плазмидов с помощью генно-специфических грунтов (шаг 2.1).

3. Проверьте интересуя йенбелин для токсичности в дрожжах

  1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 на агаре YPD (шаг 1.3) для получения изолированных колоний. Инкубировать при 30 градусах по Цельсию на 24 ч.
  2. Прививать 10 мл бульона YPD (шаг 1.4) с одной колонией из агарной пластины (шаг 3.1). Инкубировать при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин на ночь.
  3. Добавьте 0,5 мл ночной культуры до 10 мл бульона YPD (шаг 1.4) и инкубировать при 30 градусах Цельсия с тряской при 150 об/мин на 4 ч.
    1. Пеллет 10 мл культуры при 3000 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия.
    2. Приготовьграйте гранулы в 1 мл стерильной воды, перенесите в микроцентрифугую трубку и гранулы при температуре 3000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
    3. Отдохните гранулы в 1 мл литиевого ацетата 1 мм (LiAc) и гранулы на 3000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
    4. Повторите Лиакк мыть 2x.
    5. Снимите стирку. Отрежь гранулу в 2,4 мл 50% PEG 3350. Добавьте 360 л 1М лиакк, 500 л 2 мг/мл ДНК сельди и 400 л стерильной воды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этого достаточно для 20 преобразований.
    6. Добавьте 180 qL преобразования смеси от шага 3.3.5 к микроцентрифуге трубки, содержащей 5 Зл pYesNTA-Kan CT229 плазмид ДНК (100-500 нг) от шага 2.12.
    7. Инкубировать на водяной бане при 30 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    8. Инкубировать на водяной бане при 42 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    9. Пеллетка при температуре 3000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре.
    10. Удалите смесь преобразования с пипеткой. Приостановите гранулы в 100 л стерильной воды. Плита преобразования на SD Ura- агар с глюкозой (шаг 1.5).
    11. Инкубировать пластины при 30 градусах по Цельсию в течение 48 ч.
  4. Прививать 5 мл SD Ura- бульон, содержащий глюкозу (шаг 1.7) с одной колонией из пластины. Инкубировать на ночь при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин. Включите дрожжи, преобразованные только с вектором в качестве отрицательного контроля.
    1. Добавьте 180 л стерильной воды к 5 скважинам из 96 скважины (A2-A6).
    2. Vortex ночь культуры смешивать.
    3. Добавьте 180 л дрожжей к первому колодцу (A1). Серийно разбавлять 1:10 (всего шесть образцов, включая неразбавленные).
    4. Используя многоканальный пипетку, наместе 5 л каждого разбавления на SD Ura- глюкозе (шаг 1.5) и Ura- galactose (шаг 1.6) агарных пластин. Инкубировать при 30 градусах по Цельсию 48 ч.
  5. Оцените токсичность, сравнивая рост дрожжей, выражающий эффекторный белок интереса, выращенный на галактозосодержащих носителях, с ростом дрожжей, выражающих только вектор.
  6. Подтвердите выражение белка синтеза его тегов западным испугом.

4. Преобразование токсичных дрожжей с дрожжевой геномной библиотекой

  1. Прививать 100 мл SD Ura- бульон из глюкозы (шаг 1,7) с использованием 1 мл бульона от шага 3.4. Инкубировать по 16-24 ч при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин. Поместите 900 мл SD Ura- бульон из глюкозы при 30 градусах Цельсия на ночь, чтобы предварительно разогреть средства массовой информации.
  2. Добавьте все 100 мл ночной культуры в предварительно разогретую 1 l колбу. Инкубировать 4-5 ч при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин.
    1. Пеллет культуры на 6000 х г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
    2. Отбросьте супернатант. Отрежь гранулу в 250 мл стерильной воды. Пеллет культуры на 6000 х г в течение 5 мин при 4 кв. C.
    3. Отбросьте супернатант. Отрежь гранулу в 250 мл 1 мМ LiAc. Пеллет культуры на 6000 х г в течение 5 мин при 4 кв. C.
    4. Удалить LiAc и повторно йрупелв в 9,6 мл 50% PEG 3350. Добавьте 1,44 мл 1М лиакк, 2 мл 2 мг/мл ДНК сельди, 50 мкг геномной библиотеки pYep13 (ATCC 37323). Отрегулируйте объем до 15 мл со стерильной водой. Смешайте осторожно инверсии.
    5. Инкубировать на водяной бане при 30 градусах по Цельсию в течение 30 мин.
    6. Добавьте 750 л диметилсулькоксида (DMSO) для повышения эффективности преобразования. Инкубировать на водяной бане при 42 градусах по Цельсию в течение 30 мин. Смешайте нежной инверсией каждые 10 минут.
    7. Пеллет дрожжи при температуре 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Откажитесь от супернатанта и отдохните гранулы в 10 мл стерильной воды. Пеллетка при температуре 3000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
    9. Приостановите гранулы в 8 мл стерильной воды.
    10. Для определения эффективности преобразования разбавьте 1:10 и пластину 100 л каждого разбавления на SD Ura- Leu- глюкоза агара (шаг 1.8).
    11. Плита 200 л образца на пластинах SD Ura- Leu- galactose agar (шаг 1.9). Используйте 50 пластин в общей сложности.
    12. Инкубировать при 30 градусах Цельсия в течение 48-96 ч или до появления колоний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Колонии обычно появляются на агарных пластинах глюкозы на 48-72 ч и галактоза агар пластин на 72-96 ч.
  3. Патч колоний (потенциальных спасений) на SD Ура- Leu- galactose агар (шаг 1.9) для расширения и сделать запас. Инкубировать при 30 градусах по Цельсию при 24-48ч.
  4. Прививать 5 мл SD Ura- Leu- бульон глюкозы (шаг 1.10) с использованием части патча. Инкубировать на ночь при 26 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин.
    1. Добавьте 180 л стерильной воды к 5 скважинам из 96 скважины (A2-A6).
    2. Vortex ночь культуры смешивать.
    3. Добавьте 180 л дрожжей к первому колодцу (A1). Серийно разбавлять 1:10 (всего шесть образцов, включая неразбавленные).
    4. Используя многоканальный пипетку, наместе 5 л каждого разбавления на SD Ura- глюкозе и SD Ura- галактозных агарных пластинах. Включите токсичный эффектор только в качестве контроля.
    5. Инкубировать при 30 градусах по Цельсию 48 ч.
  5. Сравните рост дрожжей, выражающих токсичный эффектор только дрожжи, содержащие потенциальные супрессоры. Только приступить к потенциальным супрессоров, которые уменьшились токсичности по сравнению с дрожжами, выражающих эффектор в одиночку.

5. Определить и подтвердить супрессоры

  1. Прививать 5 мл SD Ura- Leu- бульон глюкозы (шаг 1.10) с 100 л дрожжей со ступенькой 4.4 и инкубировать ночь при 30 градусах Цельсия с тряской при 150 об/мин.
    1. Пеллет дрожжи при температуре 3000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Аккуратно отбросьте супернатант с помощью пипетки.
    2. Изолировать плазмид с дрожжевой плазмид мини-комплект в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Преобразуйте изолированную плазмиду в компетентные клетки кишечной палочки и наплитуйте всю трансформацию на агаре LB с 100 мкг/мл карбеничиллина. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию на 24 ч.
  3. Прививать 10 мл бульона LB, содержащего 100 мкг/мл карбеничиллина, с тремя колониями из тарелки и инкубировать при 37 градусах Цельсия в одночасье с тряской при 150 об/мин.
    1. Культура пеллет при температуре 3000 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Изолировать плазмид с помощью комплекта miniprep в соответствии с инструкциями производителя.
  4. Переформатировать токсичные дрожжи с изолированными плазмидов от шага 5.3.1 после шагов в части 3 протокола.
    1. Прививать 5 мл SD Ura- Leu- глюкозный бульон с колонией из преобразуемая пластины. Инкубировать на ночь при 30 градусах Цельсия при встряхивании при 150 об/мин.
    2. Пятно на Ura- Leu- глюкоза и галактоза агар для подтверждения подавления токсичности.
  5. Последовательность с использованием pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) и pYep13 R (TGATGCGCCACGATGCGCGCGCGCGCGCGCGCGC) грунтовки для выявления дрожжей ORFs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Прежде чем фактический экран супрессора дрожжей может быть выполнена, эффектор белка интерес должны быть проверены на токсичность в дрожжах. Это достигается путем выражения белка интереса к дрожжам под контролем галактоз-индуцируемого промоутера. Рост глюкозы (неиндуцирующие условия) следует сначала сравнить, чтобы обеспечить токсичность именно из-за выражения белка интерес и не является общим дефектом. Как показано на рисунке 3, токсичность проявляется как меньшие колонии и / или снижение роста. Снижение роста дрожжей в 2,3 года идеально подходит для экранов супрессоров дрожжей.

Как показано на рисунке 4,токсичность и экран супрессора могут быть выполнены в восемь шагов с использованием методов, описанных в разделе протокола. Ген интереса клонируется в подходящий вектор1,и полученные конструкции преобразуются в дрожжи для оценки токсичности. Это исследование использовало CT229 в качестве гена интереса и pYesNTA-Kan в качестве вектора. Дополнительно, выражение его-tagged протеина сплавливания было подтвержено западным blotting. В идеале следует наблюдать снижение дрожжей, выращенных на галактозосодержащих носителях, в 2,3 мгновения. Если интерес протеин токсичен для дрожжей(Рисунок 3 и Рисунок 4),экран супрессора может быть проведен путем преобразования токсического штамма с дрожжевой геномной библиотекой pYep13. Трансформенцы покрываются на агар глюкозы для определения эффективности преобразования и galactose агар для выявления потенциальных супрессоров. Используя этот протокол, была достигнута минимальная эффективность преобразования 5 х 105, в общей сложности 10–250 колоний на галактозе-агаре. Патчирование этих колоний на SD Ura- Leu- galactose агар(Рисунок 4) помогли в идентификации истинных супрессоров, потому что многие ложные срабатывания не будет расти, когда патч. Здесь, 50 колоний были исправлены и восемь клонов, которые подавляли токсичность эффектора были получены(рисунок 4). Обнаружение супрессоров на SD Ura- Leu- галактоз-агар было сделано для подтверждения подавления токсичности. Как показано на рисунке 4, pSup1 и pSup 2 подавляли токсичность белка-эффектора, в то время как pSup3 этого не сделали. Таким образом, pSup3 был отброшен. Плазмиды были впоследствии изолированы от супрессоров и преобразованы в кишечную палочку, чтобы увеличить урожайность плазмидных. Плазмида может быть преобразована в токсичных дрожжей, чтобы подтвердить, что изолированные плазмиды определенно подавляет токсичность эффектора (Рисунок 4). Хотя большинство изолированных плазмиды должны спасти токсичность, иногда плазмида, которая не подавляет токсичность при преобразовании в токсичных штамм дрожжей получается. Эти плазмиды отбрасываются, и только те, которые подавляют токсичность после перепреобразования должны быть секвенированы.

Изолированные плазмиды будет содержать несколько дрожжей ORFs4. Чтобы определить, какой является истинным супрессором, каждый ORF может быть индивидуально клонирован и выражен в токсичных штамм дрожжей, как ранее описано1,2,3,4.

Figure 1
Рисунок 1: ПЦР усиление гена-мишени. CT229 от Chlamydia trachomatis serovar L2 был пЦР, усиленный из геномной ДНК. Продукты ПЦР были проанализированы на 1% агарозный гель, окрашенный бромидом этидия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: pYesNTA-Кан плазмидная карта. Целевой ген интереса был клонирован в рассеянный сайт клонирования (MCS) pYesNTA-Kan. Канамицин был использован для отбора в E. coli и uracil отсева был использован для выбора в S. cerevisiae. Выражение его помеченного белка синтеза было проверено западным blotting. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Представитель дрожжей токсичности результатов. Эффекторные белки, представляющие интерес, были клонированы в pYesNTA-Kan. Последовательность проверенных плазмидов были преобразованы в S. cerevisiae и трансформаторов были последовательно разбавлены и пятнистый на Ura- глюкоза и галактоза агар для оценки токсичности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Обзор экрана супрессора дрожжей. Целевой ген интереса был клонирован в pYesNTA-Kan и плазмиды были преобразованы в S. cerevisiae. Трансформаторы были последовательно разбавлены и замечены на Ura- глюкозе и галактозе агар для оценки токсичности. Чтобы определить путь, направленный на токсичный эффектор белка, дрожжевый штамм, выражающий токсичный белок был преобразован с дрожжевой геномной библиотеки. Колонии были исправлены на Ура- Leu- галактоза агар и пятнистый для оценки токсичности. Плазмиды были выделены из тех, которые подавляют токсичность белка-эффектора. Плазмиды были преобразованы в токсичных штамм дрожжей, чтобы подтвердить, что изолированные плазмиды является супрессором. Плазмиды от супрессоров были секвенированы для определения дрожжей ORFs настоящее время. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом протоколе излагаются пошаговые процедуры для определения биологических путей пребывания, нацеленных на бактериальные эффекторные белки с использованием модифицированной токсичности дрожжей и экрана супрессоров. Дрожжи штамм используется, S. cerevisiae W303, auxotrophic для обоих uracil и лейцин. Uracil auxotrophy штамма используется для выбора дрожжей, несущих белок интерес на векторе pYesNTA-Кан в то время как лейкин auxotrophy используется для выбора для дрожжей геномной библиотеки вектор pYep13. Дрожжи геномных плазмид библиотеки нести 3-13 ORFs, так что каждый ORF должны быть индивидуально клонированы в p415-ADH вектор6 или аналогичный вектор и преобразованы в токсичных дрожжей, чтобы определить, который является истинным супрессором. Характерно определить несколько супрессоров, представляющих биологический путь хозяина. Супрессоры иногда могут быть прямыми связующим партнерами интересующего бактериального белка, но не всегда.

Создание дрожжевых клонов, несущих бактериальный белок интерес на pYesNTA-Кан является первым крупным шагом и большую осторожность должна быть принята, чтобы сохранить целостность этих клонов как можно скорее, потому что есть сильный отрицательный выбор для дрожжей, несущих токсичные белки, даже без преднамеренной индукции галактозы, и они могут потерять плазмид. Иногда есть плазмид потери, даже когда дрожжи поддерживается под отбор омовение на отсева средств массовой информации. Ранее сообщалось, что метод уменьшает возникновение потери плазмида путем линейной интеграции вектора и интеграции его в геном дрожжей1.

Основным недостатком этих методов является то, что экран супрессора дает только значимые данные, если переэкспрессия бактериального белка эффектора вызывает наблюдаемый и последовательный дефект роста в дрожжах. Основная трудность в этом методе, когда не suppressors определены. Трудно определить, является ли неспособность определить супрессоры из-за биологических причин или технических проблем. С биологической точки зрения, может быть несколько причин: белок интерес может быть настолько токсичным, что белки из геномной библиотеки не в состоянии значительно подавить токсичность, целевой путь может быть невсостоянина на спасение, или многочисленные совместно выраженные для преодоления токсического эффекта могут потребоваться факторы. Подход к биологическому объяснению является сложной задачей, так как существует много неопределенных переменных для вскрытия. Поскольку существует установленный протокол, изучение технических объяснений является гораздо более уступчивым подходом. С технической точки зрения, неспособность определить супрессоры, вероятно, является результатом низкой эффективности преобразования дрожжей геномной библиотеки. Этот протокол использует ATCC S. cerevisiae AB320 частично переваренной геномной библиотеки в pYEp13. Другие библиотеки могут быть достаточными, так же как и другие векторы, но этот протокол конкретно использует библиотеку ATCC и в настоящее время нет исследований, которые сообщают альтернативные библиотеки или векторные источники. Настоятельно рекомендуется, чтобы охват генома дрожжей был не менее 10раз, или недопредставленность может препятствовать идентификации супрессоров. Снижение эффективности преобразования может привести эти цифры в 1x. Таким образом, части генома дрожжей не могут быть представлены на экране супрессора. Низкая эффективность преобразования может быть связана со многими проблемами, включая плохие реагенты или плохую подготовку библиотеки. Этот метод в значительной степени придерживается метода преобразования DMSO/LiAc, впервые выдвинутого Hill et al.7. Рекомендуется, чтобы новые DMSO, 50% ПЭГ, и свежей днк спермы сельди закупаются и подготовлены для преобразований и используется исключительно для этих анализов, чтобы уменьшить загрязнение или ухудшение качества реагентов. DMSO очень гигроскопичен и легко поглощает воду из атмосферы. Поэтому, делая много индивидуальных aliquots рекомендуется, чтобы избежать повторного открытия крышки контейнера и воздействия атмосферы. Высококачественная ДНК спермы сельди может храниться при -20 градусов и остается пригодной для использования в течение нескольких лет, хотя свежий препарат должен быть подготовлен из бульона для каждой трансформации. После варки и охлаждения, днк сельди спермы не должны быть восстановлены или повторно, так что лучше только удалить то, что необходимо и избежать сделать больше, чем это необходимо для текущей трансформации. Внимание к деталям может значительно повысить эффективность преобразования дрожжей и повысить шансы на выявление супрессора.

Учитывая, что вектор дрожжей pYep13 несет 3-13 различных дрожжей ORFs, сокращение числа ложноположительных плазмидов имеет первостепенное значение для выявления супрессоров. Дрожжи могут взять и гавани несколько копий аналогичных векторов, в то время как общая мудрость, связанная с плазмид несовместимость традиционно диктует, что кишечная палочка поддерживает только один тип плазмиды с тем же происхождением репликации (ORI) в то время, хотя это не всегда так. Это может стать серьезной проблемой при попытке определить кандидатов супрессора. Если идентифицированы клоны дрожжей супрессора, плазмиды будут извлечены и преобразованы в кишечную палочку для распространения и последующего секвенирования для идентификации. После того, как кандидат супрессор плазмида была изолирована и преобразована в кишечную палочку,настоятельно рекомендуется, чтобы по крайней мере пять e. coli колоний выбрали для секвенирования, потому что вполне возможно, что отдельные клоны могут нести различные плазмиды. Так как кишечная палочка должна быть в состоянии размножаться только один плазмид в то время, если дрожжи изоляции дает несколько плазмидов, различные e. coli клонов на пластине должны нести только один из них в то время. Поэтому выбор пяти колоний на основе нормальной эффективности преобразования в кишечной палочке должен показать, являются ли клоны несут те же или различные плазмиды. Если несколько плазмидов возникают после секвенирования плазмидов от кишечной палочки,то каждый из них должен быть преобразован в токсичный клон дрожжей и оценен для спасения дефекта роста. Кроме того, даже если только один супрессор плазмида определяется, для строгости и воспроизводимости репреводящей репрецирования плазмиды в токсичных клон поощряется.

Дрожжи супрессор асссе очень большой эксперимент и соответствующее время и материалы должны быть запланированы соответствующим образом. Этот протокол содержит много деталей, которые должны соблюдаться строго, и рекомендуется, чтобы исследователь проведения этих анализов тщательно читать и смотреть протокол в полном объеме до начала проверки. Это многопартийная процедура, включающая бактерии и дрожжи, которые необходимо выращивать при различных температурах. Изоляция плазмидов от дрожжей иногда может быть трудно из-за их жесткой клеточной стенки и использование DMSO помогает достичь более высокой эффективности преобразования.

Одним из самых больших преимуществ токсичности дрожжей и супрессора экран является то, что бактериальный эффектор не нужно физически связываться с хозяином субстратов для любого заметного количества времени, чтобы обнаружить putative пути целевых. Только небольшая горстка исследований сообщили, используя этот или аналогичный метод1-5. Тем не менее, Есть сообщения о методах, которые определяют хост пути и многие методы для проверки для связывания партнеров бактериальных белков эффектора. Kramer et al. сообщили о новом подходе биологии систем для выявления путей, мишенью которых являются бактериальные эффекторные белки8. Техника использовала коллекцию штамма гаплоида S. cerevisiae для проверки мутантов, чувствительных к эффектору Shigella Osp4. Используя этот метод, Osp4 был связан с регулированием MAPK сигнализации и ослаблении врожденного иммунитета в клетках-хозяинах. Array основе, высокой пропускной силы, автоматизированные дрожжи два гибридных экранов теперь может быстро определить putative бактериальный эффектора связывания партнеров путем скрининга многих в то же время против миллионов принимающих белков9. Аналогичным образом, высокопроизводительные иммунопрециции в сочетании с масс-спектрометрией используются для массового выявления предполагаемого связующего партнеров целых семейств белков бактериальных эффекторов10. Хотя многие из этих исследований могут ускорить график характеристики белка эффектора, они редко дают представление о том, что физиологические процессы манипулируют и каковы целостный результат этих взаимодействий. Таким образом, такие методы, как токсичность дрожжей и экран супрессора имеют важное значение для освещения клеточных процессов, которыми манипулируют эти эффекторные белки. В какой-то момент, наблюдения выявления связывающих партнеров или путей, направленных на бактериальных белков эффектора необходимо вернуться к клеточной инфекции моделей, чтобы определить, являются ли эти выводы in vitro верно в физиологически значимых сценариев. Генетические манипуляции обликратных внутриклеточных патогенов, таких как C. trachomatis был основным препятствием до недавнего времени11-15 и поколение сайта конкретных мутантов для изучения эффектор белков не было возможно. В последние несколько лет, хотя, революция в генерации хламидийных мутантов, дополняя их, и переэкспрессии целевых белков произошло. Эти последние достижения значительно повысили ценность информации, полученной в результате исследований с использованием токсичности и супрессоров экранов, как теперь можно перейти от дрожжей непосредственно в инфекцию, чтобы исследовать достоверность результатов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим Шелби Андерсен, Эбби Маккалоу и Лорел Вудс за помощь в этих методах. Это исследование было профинансировано за счет стартап-фондов от Университета Айовы Департамента микробиологии и иммунологии мэри М. Вебер.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Fisher Scientific BP2641500
Galactose MilliporeSigma G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit ThermoFisher Scientific K0691
GeneJet PCR purification kit ThermoFisher Scientific K0701
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo K0503
Glucose MilliporeSigma G8270-1KG
Herring Sperm DNA Promega D1811
KpnI-HF New England Biolabs R3142S
Lithium acetate dihydrate MilliporeSigma L6883-250G
Peptone Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530
Poly(ethylene glycol) 3350 MilliporeSigma 1546547-1G
pYep13 ATCC 37323
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
Tryptophan MilliporeSigma 470031-1G
XhoI-HF New England Biolabs R0146S
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500
Yeast miniprep kit Zymo D2001
Yeast nitrogen base without amino acids MilliporeSigma Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1501-20G without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1771-20G without uracil, leucine, tryptophan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Tags

Генетика Выпуск 152 бактериальный протеин супрессор дрожжей функция протеина эффектора экраны дрожжей Chlamydia trachomatis тип III секретированный протеин эффектора идентификация путей
Идентификация хост Пути целевых бактериальных протеинов с использованием дрожжей токсичности и супрессорэкранов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faris, R., Weber, M. M.… More

Faris, R., Weber, M. M. Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens. J. Vis. Exp. (152), e60488, doi:10.3791/60488 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter