Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Identifiering av värdvägar riktade av bakteriella Effektorproteiner med hjälp av jäst toxicitet och suppressor skärmar

Published: October 25, 2019 doi: 10.3791/60488
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, University of Iowa

Summary

Bakteriella patogener utsöndrar proteiner till värden som riktar avgörande biologiska processer. Att identifiera de värdvägar som är riktade mot bakteriella effektorproteiner är nyckeln till att ta itu med molekylär patogenes. Här, en metod med hjälp av en modifierad jäst suppressor och toxicitet skärmen för att belysa värdvägar riktade av giftiga bakteriella effektor proteiner beskrivs.

Abstract

Intracellulära bakterier utsöndrar virulensfaktorer som kallas effektorproteiner i den mottagande cytosolen som agerar för att undergräva värd proteiner och/eller deras associerade biologiska vägar till nytta för bakterien. Identifiering av förruttande bakteriella effektorproteiner har blivit mer hanterbar på grund av framsteg i bakteriell genom sekvensering och tillkomsten av algoritmer som möjliggör i silico identifiering av gener som kodar sekretion kandidater och/eller eukaryota-liknande Domäner. Identifieringen av dessa viktiga virulensfaktorer är dock bara ett första steg. Målet är naturligtvis att bestämma den molekylära funktionen hos effektorproteiner och belysa hur de interagerar med värden. Under de senaste åren, tekniker som jästen två-hybrid skärm och storskaliga immunoprecipitations tillsammans med masspektrometri har hjälpt till att identifiera protein-protein interaktioner. Även om identifieringen av en värd bindnings partner är det avgörande första steget mot att belysa den molekylära funktionen hos ett bakteriellt effektorprotein, finns ibland värd proteinet som har flera biologiska funktioner (t. ex. Actin, clathrin, tubulin) eller bakterie proteinet kanske inte fysiskt binder värd proteiner och berövar forskaren viktig information om den exakta värdvägen som manipuleras. En modifierad jästtoxicitetsskärm i kombination med en suppressor-skärm har anpassats för att identifiera värdvägar som påverkas av bakteriella effektorproteiner. Toxiciteten skärmen förlitar sig på en toxisk effekt i jäst orsakad av effektor proteinet stör värd biologiska vägar, som ofta manifesteras som ett tillväxtfel. Uttryck för en jäst genomiskt bibliotek används för att identifiera värd faktorer som hämmar toxiciteten av bakteriefakterictor protein och därmed identifiera proteiner i den väg som effektor protein mål. Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner för både toxicitet och suppressor skärmar. Dessa tekniker kan utföras i alla laboratorier som kan molekylär kloning och odling av jäst och Escherichia coli.

Introduction

Den första rapporten av förfaranden som liknar dem som presenteras här kännetecknas Legionella pneumophila typ IV effektor sidd, en deAMPylase som modifierar Rab11. Jämförbara tekniker användes för karakteriseringen av flera L. pneumophila effektorer1,2,3. Analysen var anpassad för att karakterisera en Coxiella burnetii typ IV effektor protein4, och nyligen nyttan av denna teknik utökades för karakterisering av klamydia trachomatis integration membranproteiner5 .

Detta protokoll kan delas in i två huvuddelar: 1) den jästtoxicitet skärmen, där bakterieeffektorprotein av intresse uttrycks i jäst och kloner screenas för en toxisk fenotyp som framgår av en tillväxtfel, och 2) jästen suppressor skärmen , där den toxiska fenotypen dämpas genom uttryck av ett jästgenomiskt bibliotek i den giftiga stammen. Således är toxiciteten skärmen en skärm för giftiga fenotyper som manifesteras som tillväxtdefekter när bakteriell effektor av intresse är överuttryckt. Giftiga kloner, framgångsrikt omvandlas med och uttrycker bakteriell effektor, väljs och sparas för nästa steg. Det andra stora steget innebär att överuttrycka en delvis smält jäst genomiskt bibliotek i giftiga jästklon. Plasmider som utgör jäst genomiskt bibliotek föreslås för användning i detta protokoll bära 5 − 20 KB skär, vanligen motsvarande 3 − 13 jäst öppen läsning ramar (ORF) av en genomsnittlig gen storlek ~ 1,5 KB över alla plasmider, som representerar hela jästgenomet täckt cirka 10X. Denna del av analysen kallas suppressor skärmen, eftersom målet är att undertrycka toxiciteten av bakterieeffektorproteinet. Potentiella suppressor plasmider är isolerade från jäst, sekvenserade, och undertrycka ORFs identifierats. Den logiska grunden bakom suppressor skärmen är att effektor proteinet binder, interagerar med, och/eller övervältar delar av värdvägen den mål, och att ge dessa värd proteiner tillbaka i överskott kan rädda den toxiska effekten på vägen och därmed, tillväxten defekt. Således identifierade ORFs som hämmar toxicitet ofta representerar flera deltagare i en värd väg. Ortogonala experiment utförs sedan för att kontrollera att bakterien effektor faktiskt interagerar med den inblandade vägen. Detta är särskilt nödvändigt om en bindande partner som proteinet eller aktin har identifierats, eftersom dessa proteiner är involverade i en mängd värdprocesser. Ytterligare experiment kan sedan belysa den fysiologiska funktionen av effektorproteinet under infektion. Toxiciteten och suppressor skärmarna är också kraftfulla verktyg för att dechiffrera den fysiologiska funktionen av bakteriella effektorproteiner som inte fysiskt binder värd proteiner med affiniteter som är tillräckliga för att detektera genom immunoprecipitation eller som interagerar med värd i enzymatiska hit-and-Run interaktioner som inte kan upptäckas av en jäst-två hybrid skärm.

Även om suppressor skärmen kan vara en kraftfull metod för att avslöja potentiella fysiologiska interaktioner mellan bakteriella effektorproteiner och värdvägar, bakterie effektor proteinet måste inducera en tillväxtfel i jäst, annars använder den i suppressor skärmen kommer att vara till föga nytta. Dessutom måste den toxiska fenotypen resultera i minst en 2 − 3 log10 underskott i tillväxt eller det kommer att bli svårt att identifiera suppressorer. Om ett laboratorium är inrättat för cellkultur, screening effektor proteiner för toxicitet i gemensamma cellinjer såsom HeLa kan ofta ge insikt om huruvida det är värt ansträngningen att gå vidare med jästtoxicitet skärmen. Ektopisk uttryck för effektorproteinet i HeLa celler resulterar ibland i toxicitet som korrelerar mycket starkt med toxicitet i jäststammen som används för dessa skärmar4. Observerbara kännetecken av stress i HeLa celler inkluderar förlust av stress fibrer, cell avlossning från plattan, och nukleär kondensation indikerar apoptos. Varje visuell indikation av stress i HeLa celler gör proteinet av intresse en bra kandidat för att framkalla en tillväxtfel i jäst, som replikerar mycket snabbare och är därmed mer lyhörd för störning av viktiga vägar.

Det bör noteras att den suppressor skärmen inte alltid identifiera värd bindande partner som dämpning, men det kan fortfarande inblandade kritiska komponenter i värdvägen (er) riktade, vilket ger en helhetsbild av de biologiska processer som kapas av bakterie effektor protein. På ytan, detta verkar kontraintuitivt, eftersom att ge bindande partner av effektor protein i överskott skulle kunna förväntas rädda tillväxtdefekten. I arbetet med att identifiera vägar riktade av C. trachomatis effektor protein CT229 (cpos), som binder till minst 10 olika Rab gtpases under infektion5, ingen av Rab bindande partners undertryckt toxiciteten av CT229. Men många suppressorer inblandade i clathrin-belagda vesikel (CCV) människohandel identifierades, vilket ledde till ytterligare arbete visar att CT229 specifikt underminerar Rab-beroende CCV trafficking. Likaså, vid utredning av C. burnetii effektor protein Cbu0041 (CIRA) flera Rho gtpases som räddade jästen tillväxtfel identifierades, och det konstaterades senare att CIRA fungerar som en gtpase aktivera protein (Gap) för RhoA4.

Nyttan av jäst suppressor skärmen för att belysa värdvägar riktade av bakteriella effektorproteiner kan inte överskattas, och andra forskare som försöker karakterisera intracellulära bakteriella effektorproteiner kan i hög grad dra nytta av dessa tekniker. Dessa analyser är av värde om immunoprecipitations och/eller jäst-två hybrid skärmar har misslyckats med att hitta en bindande partner och kan belysa vilka vägar som är riktade av bakterieeffektorproteinet. Här, detaljerade protokoll för toxicitet och suppressor skärmar för att identifiera värd biologiska vägar riktade av intracellulära bakteriella effektor proteiner tillhandahålls, liksom några av de gemensamma hinder som upplevs när du använder dessa analyser och deras motsvarande lösningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av media och reagenser

Anmärkning: plattorna bör förberedas före dagen för analysen och är bra för 1 månad. Media och reagenser kan göras när som helst och är bra för 1 månad.

  1. Bered 1 L glukos lösningen (10% w/v) genom att lösa upp 100 g D-(+)-glukos i 800 mL destillerat vatten i en bägare på 1 000 mL. Justera volymen till 1 L med destillerat vatten. Filtrera genom en 0,2 μm sterilt filter till en steril 1 L medie lagrings flaska.
  2. Bered 1 L galaktoslösningen (10% w/v) genom att lösa upp 100 g D-(+)-galaktos i 800 mL destillerat vatten i en 1 L bägare. Justera volymen till 1 mL med destillerat vatten och filtrera genom ett sterilt 0,2 μm steril filter till en steril 1 000 mL medie Förvaringsflaska.
  3. Bered 1 L jästextrakt peptondextros (YPD)-agar genom att lösa upp 10 g jästextrakt, 20 g pepton, 20 g glukos och 20 g agar i 1 000 mL destillerat vatten. Autoklav i 20 min och kyla i 56 ° c vattenbad tills kyls. Häll i 100 mm plattor med ~ 20 mL Media per tallrik.
  4. Bered 1 L YPD- buljong genom att lösa upp 10 g jästextrakt, 20 g pepton och 20 g glukos i 1 000 ml destillerat vatten. Autoklav för 20 min.
  5. Förbered syntetiska avhopp (SD) uracil (URA-) glukos agar. För 1 L, lös 6,7 g jäst kväve bas utan aminosyror, 1,9 g av avhopp tillägg utan uracil, och 15 g agar i 800 ml destillerat vatten. Autoklav i 20 min och kyla i en 56 ° c vattenbad tills temperaturen är ~ 50 − 60 ° c. Med hjälp av en 50 ml serologiska pipett eller en steril graderad cylinder, tillsätt 200 ml av glukos lösningen beredd i steg 1,1. Blanda väl genom att försiktigt virvlande eller placera på rör plattan. Häll i 100 mm plattor med ~ 20 mL Media per tallrik.
  6. Förbered den syntetiska avhopp (SD) uracil (URA-) galaktose agar. För 1 L, lös 6,7 g jäst kväve bas utan aminosyror, 1,9 g av avhopp tillägg utan uracil, och 15 g agar i 800 ml destillerat vatten. Autoklav i 20 min och kyla i en 56 ° c vattenbad tills temperaturen är ~ 50 − 60 ° c. Med hjälp av en 50 mL serologisk pipett eller en steril graderad cylinder, tillsätt 200 mL av galaktoslösningen som bereds i steg 1,2. Blanda väl genom att försiktigt virvlande eller placera på rör plattan. Häll i 100 mm plattor med ~ 20 mL Media per tallrik.
  7. Förbered syntetisk avhopp (SD) uracil (URA-) glukos buljong. För 1 L, lös 6,7 g jäst kväve bas utan aminosyror och 1,9 g av avhopp tillägg utan uracil i 800 ml destillerat vatten. Autoklav i 20 min och kyla i en 56 ° c vattenbad tills temperaturen är ~ 50 − 60 ° c. Med hjälp av en 50 ml serologiska pipett eller en steril graderad cylinder, tillsätt 200 ml av glukos lösningen beredd i steg 1,1.
  8. Förbered den syntetiska avhopp (SD) uracil (URA-) leucin (Leu-) glukos agar. För 1 L, lös 6,7 g av jästen kväve bas utan aminosyror; 1,9 g av avhopp tillägg utan uracil, leucin, och tryptofan; 15 g agar; och 0,076 g tryptofan i 800 mL destillerat vatten. Autoklav i 20 min och kyla i en 56 ° c vattenbad tills temperaturen är ~ 50 − 60 ° c. Med hjälp av en 50 ml serologiska pipett eller en steril graderad cylinder, tillsätt 200 ml av glukos lösningen beredd i steg 1,1. Häll i 100 mm plattor med ~ 20 mL Media per tallrik.
  9. Förbered syntetisk avhopp (SD) uracil (URA-) leucin (Leu-) galaktosinagar. För 1 L, lös 6,7 g jäst kväve bas utan aminosyror; 1,9 g av avhopp tillägg utan uracil, leucin, och tryptofan; 15 g agar; och 0,076 g tryptofan i 800 mL destillerat vatten. Autoklav i 20 min och kyla i en 56 ° c vattenbad tills temperaturen är ~ 50 − 60 ° c. Med hjälp av en 50 mL serologisk pipett eller en steril graderad cylinder, tillsätt 200 mL av galaktoslösningen som bereds i steg 1,2. Blanda väl genom att försiktigt virvlande eller placera på en rör platta. Häll i 100 mm plattor med ~ 20 mL Media per tallrik.
  10. Förbered syntetiskt avhopp (SD) uracil (URA-) leucin (Leu-) glukos buljong. För 1 L, lös 6,7 g jäst kväve bas utan aminosyror; 1,9 g av avhopp tillägg utan uracil, leucin, tryptofan; och 0,076 g tryptofan i 800 mL destillerat vatten. Autoklav i 20 min och kyla i ett 56 − 60 ° c vattenbad tills temperaturen är ~ 50 ° c. Med hjälp av en 50 ml serologiska pipett eller en steril graderad cylinder, tillsätt 200 ml av glukos lösningen beredd i steg 1,1.
  11. Bered polyetylenglykol (PEG) lösning. Tillsätt 50% w/v av polyetylenglykol 3350 i destillerat vatten. Sterilisera genom autoklav.
  12. Bered 1 M litiumacetat (LiAc) genom att lösa upp 10,2 g litiumacetatdehydrat i 200 mL destillerat vatten. Sterilisera genom autoklav.
  13. Förbered sill spermier DNA. Späd 10 mg/mL sill sperma-DNA till 2 mg/mL med destillerat vatten. Värm vid 100 ° c i 5 min och omedelbart plats på is i 5 min.

2. kloning av genen av intresse i jästtoxiciteten plasmid pYesNTA-kan

Obs: för närvarande finns det en sort jäst toxicitet vektorer tillgängliga både kommersiellt och akademiskt. Jästen suppressor skärmen kan användas tillsammans med många av dessa vektorer förutsatt plasmid uttrycker effektor protein av intresse använder en avhopp val än uracil och en antibiotika markör än blaR. Detta arbete används en modifierad pyesnta vektor4,5som innehåller en kanamycin motstånd kassett för enklare screening för potentiella suppressorer. Klonings systemet måste göra det möjligt för effektorproteinet att vara i bild med gal-promotorn och hans-tagg. Den Chlamydia trachomatis integration membranprotein CT229 användes som ett bevis på princip för dessa analyser.

  1. Använd PCR för att förstärka CT229 från C. trachomatis genomisk DNA efter tillverkarens instruktioner med CT229 + 1 KPN F (ccggtaccaatgagctgttctaatgttaattcaggt) och CT229 xhoi R (ccctcgagttttttacgacgggatgcc) primers. Använd följande PCR-villkor: (1) 98 ° c i 30 s; (2) 98 ° c för 10 s, 55 ° c för 30 s, 72 ° c i 2 min; (3) Upprepa steg 2 för totalt 25x; (4) 72 ° c i 10 min; och (5) 4 ° c Hold.
  2. Analysera 5 μL av PCR-produkten på en 1% aguppkom gel (figur 1).
  3. Rengör resterande 45 μL DNA med ett PCR-renings kit enligt tillverkarens anvisningar.
  4. Smält 50 μL av renat PCR-skär och pYesNTA-kan (figur 2) i 1 h vid 37 ° c i ett vattenbad med kpni-HF och xhoi-HF.
    Anmärkning: för pYesNTA-kan, Digest 5 μg Plasmid med 5 μL KpnI-HF, 5 μl XhoI-HF och 6 μL buffert i en total volym av 60 μL. För skäret, smälta hela 50 μL av den renade PCR-produkten med 2 μL KpnI-HF, 2 μL XhoI-HF och 6 μL buffert.
  5. Kör hela plasmid Digest på en 1% aguppstod gel. Utför rening av smält Plasmid med hjälp av en gel extraktion kit enligt tillverkarens anvisningar.
  6. Rengör den smälta PCR-insatsen med hjälp av ett PCR-renings kit enligt tillverkarens anvisningar.
  7. Klona skäret i pYesNTA-kan med hjälp av 2 μL pYesNTA-kan (steg 2,5), 2 μL DNA ligasbuffert, 1 μL T4 Ligase och 15 μL av insatsen (steg 2,6). Inkubera vid rumstemperatur i 1 h.
  8. Tillsätt hela klonings reaktionen till 50 μL av de kompetenta cellerna i E. coli och utför omvandlings reaktionen.
  9. Platta hela omvandlings reaktionen på en LB-platta som innehåller 100 μg/mL carbenicillin.
  10. Inokulera 10 mL av LB som innehåller 100 μg/mL carbenicillin med tre individuella kolonier. Inkubera över natten vid 37 ° c med skakning vid 150 RPM.
  11. Isolera Plasmid med hjälp av ett plasmid-miniprep-kit enligt tillverkarens anvisningar.
  12. Sekvensera de isolerade plasmiderna med hjälp av genspecifika primrar (steg 2,1).

3. testa proteinet av intresse för toxicitet i jäst

  1. Streak Saccharomyces cerevisiae W303 på YPD agar (steg 1,3) för att få isolerade kolonier. Inkubera vid 30 ° c i 24 timmar.
  2. Inokulera 10 mL YPD-buljong (steg 1,4) med en enda koloni från agarplattan (steg 3,1). Inkubera vid 30 ° c med skakning vid 150 rpm över natten.
  3. Tillsätt 0,5 mL av natt kulturen till 10 mL YPD-buljong (steg 1,4) och inkubera vid 30 ° c med skakning vid 150 rpm under 4 timmar.
    1. Pellets 10 mL av kulturen på 3 000 x g i 10 min vid 4 ° c.
    2. Omsuspendera pelleten i 1 mL sterilt vatten, överför till microcentrifugeröret och pelleten på 3 000 x g i 1 min vid rumstemperatur.
    3. Omsuspendera pelleten i 1 mL 1 mM litiumacetat (LiAc) och pellets på 3 000 x g i 1 min vid rumstemperatur.
    4. Upprepa LiAc Wash 2x.
    5. Ta bort tvätten. Omsuspendera pelleten i 2,4 mL 50% PEG 3350. Tillsätt 360 μl av 1m LiAc, 500 μl 2 mg/ml sill, spermie-DNA, och 400 μl sterilt vatten.
      Obs: detta räcker för 20 transformationer.
    6. Tillsätt 180 μL av omvandlings blandningen från steg 3.3.5 till ett microcentrifugerör som innehåller 5 μL pYesNTA-kan CT229 plasmid-DNA (100 − 500 ng) från steg 2,12.
    7. Inkubera i ett vattenbad vid 30 ° c i 30 min.
    8. Inkubera i ett vattenbad vid 42 ° c i 30 min.
    9. Pellets vid 3 000 x g i 1 min vid rumstemperatur.
    10. Ta bort omvandlings blandningen med pipetten. Omsuspendera pelleten i 100 μL sterilt vatten. Platta omvandlingen på SD URA- agar med glukos (steg 1,5).
    11. Inkubera plattorna vid 30 ° c för 48 h.
  4. Inokulera 5 mL SD URA- buljong som innehåller glukos (steg 1,7) med en enda koloni från plattan. Inkubera över natten vid 30 ° c med skakning vid 150 RPM. Inkludera jäst omvandlas med vektorn ensam som en negativ kontroll.
    1. Tillsätt 180 μL sterilt vatten till 5 brunnar i en 96-borrplatta (a2 − A6).
    2. Vortex natt kulturen att blanda.
    3. Tillsätt 180 μL jäst till den första brunnen (a1). Späd 1:10 (sex prover totalt inklusive outspädd).
    4. Med hjälp av en multikanalpipett, spot 5 μL av varje utspädning på SD URA- glukos (steg 1,5) och URA- galaktos (steg 1,6) agar plattor. Inkubera vid 30 ° c i 48 h.
  5. Bedöma toxiciteten genom att jämföra tillväxten av jästen uttrycker effektor protein av intresse som odlas på galaktose-innehållande media till tillväxten av jäst uttrycker vektorn ensam.
  6. Bekräfta uttrycket av his-tag fusion protein av Western blotting.

4. omvandla giftiga jäst med jästen genomiskt bibliotek

  1. Inokulera 100 mL SD URA- glukobuljong (steg 1,7) med 1 ml av beståndet från steg 3,4. Inkubera i 16 − 24 timmar vid 30 ° c med skakning vid 150 RPM. Placera 900 mL SD URA- glukobuljong vid 30 ° c över natten för att förvärma mediet.
  2. Tillsätt hela 100 mL av natt kulturen till den förvärmda 1 L-kolven. Inkubera i 4 − 5 h vid 30 ° c med skakning vid 150 RPM.
    1. Pellets kulturen vid 6 000 x g i 10 min vid 4 ° c.
    2. Kassera supernatanten. Omsuspendera pelleten i 250 mL sterilt vatten. Pellets kulturen vid 6 000 x g i 5 min vid 4 ° c.
    3. Kassera supernatanten. Omsuspendera pelleten i 250 mL 1 mM LiAc. Pellets kulturen vid 6 000 x g i 5 min vid 4 ° c.
    4. Ta bort LiAc och Omsuspendera pelleten i 9,6 mL 50% PEG 3350. Tillsätt 1,44 mL 1M LiAc, 2 mL 2 mg/mL sill spermie DNA, 50 μg av pYep13 genomiskt bibliotek (ATCC 37323). Justera volymen till 15 mL med sterilt vatten. Blanda försiktigt med inversion.
    5. Inkubera i ett vattenbad vid 30 ° c i 30 min.
    6. Tillsätt 750 μL dimetylsulfoxid (DMSO) för att öka omvandlings effektiviteten. Inkubera i ett vattenbad vid 42 ° c i 30 min. Blanda med mild inversion var 10 min.
    7. Pellets jästen på 3 000 x g i 5 min vid rumstemperatur.
    8. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 10 mL sterilt vatten. Pellets vid 3 000 x g i 5 min vid rumstemperatur.
    9. Omsuspendera pelleten i 8 mL sterilt vatten.
    10. För att bestämma omvandlings effektiviteten, späd 1:10 och platta 100 μL av varje utspädning på SD URA- Leu- glukoagar (steg 1,8).
    11. Platta 200 μL av provet på SD URA- Leu-galaktos- agar (steg 1,9) tallrikar. Använd totalt 50 plattor.
    12. Inkubera vid 30 ° c i 48 − 96 timmar eller tills kolonierna dyker upp.
      Observera: kolonier uppträder vanligen på glukos-agar-plattor vid 48 − 72 h och galaktos-agarplattor vid 72 − 96 h.
  3. Plåster kolonier (potentiella räddningar) på SD URA- Leu- galaktose agar (steg 1,9) för att expandera och göra lager. Inkubera vid 30 ° c i 24 − 48h.
  4. Inokulera 5 mL SD URA- Leu- glukobuljong (steg 1,10) med hjälp av den del av plåstret. Inkubera över natten vid 26 ° c med skakning vid 150 RPM.
    1. Tillsätt 180 μL sterilt vatten till 5 brunnar i en 96-borrplatta (a2 − A6).
    2. Vortex natt kulturen att blanda.
    3. Tillsätt 180 μL jäst till den första brunnen (a1). Späd 1:10 (sex prover totalt inklusive outspädd).
    4. Med en flerkanalspipett, spot 5 μL av varje utspädning på SD URA- glukos och SD URA- galaktose agar plattor. Inkludera toxisk effektor ensamt som en kontroll.
    5. Inkubera vid 30 ° c i 48 h.
  5. Jämför tillväxten av jästen uttrycker giftiga effektor ensam till jäst som innehåller de potentiella suppressorer. Endast fortsätta med potentiella suppressorer som har minskad toxicitet jämfört med jästen uttrycker effektor ensam.

5. identifiera och bekräfta suppressorer

  1. Inokulera 5 mL SD URA- Leu- glukobuljong (steg 1,10) med 100 μL jäst från steg 4,4 och inkubera över natten vid 30 ° c med skakning vid 150 RPM.
    1. Pellets jästen på 3 000 x g för 2 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten försiktigt med en pipett.
    2. Isolera Plasmid med en jäst plasmid miniprep kit enligt tillverkarens anvisningar.
  2. Omvandla den isolerade plasmiden till de kompetenta cellerna i E. coli och platta hela omvandlingen på lb-agar med 100 μg/ml carbenicillin. Inkubera vid 37 ° c i 24 timmar.
  3. Inokulera 10 mL LB-buljong innehållande 100 μg/mL carbenicillin, med tre kolonier från plattan och inkubera vid 37 ° c över natten med skakning vid 150 RPM.
    1. Pellets kulturer vid 3 000 x g i 10 min vid rumstemperatur. Isolera Plasmid med hjälp av ett miniprep-kit enligt tillverkarens anvisningar.
  4. Återomvandla den giftiga jästen med de isolerade plasmiderna från steg 5.3.1 enligt stegen i del 3 av protokollet.
    1. Inokulera 5 mL av SD URA- Leu- glukobuljong med en koloni från omvandlings plattan. Inkubera över natten vid 30 ° c med skakning vid 150 RPM.
    2. Spot på URA- Leu- glukos och galaktoagar för att bekräfta undertryckande av toxicitet.
  5. Sekvens med pYep13 F (ACTACGCGATCATGGCGA) och pYep13 R (TGATGCCGGCCACGATGC) primers att identifiera jäst ORFs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Innan den faktiska jäst suppressor skärmen kan utföras, den effektor protein av intresse måste testas för toxicitet i jäst. Detta åstadkoms genom att uttrycka proteinet av intresse för jäst under kontroll av en galaktos-inducible promotor. Tillväxt på glukos (noninducerande villkor) bör först jämföras för att säkerställa toxicitet är specifikt på grund av uttrycket av proteinet av intresse och är inte en allmän defekt. Som framgår av figur 3manifesteras toxicitet som mindre kolonier och/eller minskad tillväxt. En 2 − 3 log minskning av jäst tillväxt är idealisk för jästen suppressor skärmar.

Som framgår av figur 4, kan toxiciteten och suppressor skärmen åstadkommas i åtta steg med hjälp av de metoder som beskrivs i avsnittet protokoll. Genen av intresse klonas till en lämplig vektor1, och den resulterande konstruktioner omvandlas till jäst att bedöma toxicitet. Denna studie använde CT229 som genen av intresserar och pYesNTA-kan som vektorn. Dessutom bekräftades uttrycket av hans-märkta fusionsprotein av Western blotting. Helst bör en 2 − 3 log minskning av jäst som odlas på galaktos-innehållande Media observeras. Om proteinet av intresse är giftigt för jäst (figur 3 och figur 4), den suppressor skärmen kan utföras genom att omvandla den giftiga stammen med jästen genomisk Library pYep13. Transformanter är pläterade på glukos agar för att bestämma omvandlings effektivitet och galaktose agar för att identifiera potentiella suppressorer. Med hjälp av detta protokoll uppnåddes en minsta verkningsgrad på 5 x 105 med sammanlagt 10 − 250 kolonier på galaktosagar. Lapp dessa kolonier på SD URA- Leu- galaktose agar (figur 4) med hjälp av identifiering av sanna suppressorer, eftersom många falska positiva kommer inte att växa när lappat. Här var 50 kolonier lappade och åtta kloner som undertryckt effektortoxicitet erhölls (figur 4). Spotting suppressorer på SD URA- Leu- galaktose agar gjordes för att bekräfta dämpning av toxicitet. Som framgår i figur 4, PSup1 och psup 2 undertryckt toxiciteten av effektorproteinet, medan pSup3 inte. Därför pSup3 ignorerades. Plasmider isolerades därefter från suppressorerna och förvandlades till E. coli för att öka plasmid-avkastningen. Plasmiden kan sedan omformas till den giftiga jästen för att bekräfta att den isolerade plasmid definitivt dämpar effektortoxicitet (figur 4). Medan de flesta av de isolerade plasmider bör rädda toxicitet, ibland en Plasmid som inte undertrycka toxicitet när omformas till den giftiga jäststammen erhålls. Dessa plasmider kasseras, och endast de som hämmar toxicitet efter omomvandling bör sekvenseras.

Den isolerade plasmid kommer att innehålla flera jäst ORFs4. För att identifiera vilken är den sanna suppressor, varje ORF kan vara individuellt klonade och uttrycks i den giftiga jäststammen som tidigare beskrivits1,2,3,4.

Figure 1
Figur 1: PCR-amplifiering av målgenen. CT229 från Chlamydia trachomatis serovar L2 var PCR förstärks från genomiskt DNA. PCR-produkter analyserades på en 1% aguppkom gel som färgas med etidiumbromid bromid. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: pYesNTA-kan plasmid karta. Målet genen av intresse var klonade till flera kloning webbplats (MCS) av pyesnta-kan. kanamycin användes för val i E. coli och uracil avhopp användes för val i S. cerevisiae. Uttrycket av hans-märkta fusionsprotein kontrollerades av Western blotting. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: representativa jästtoxicitetsresultat. Effector proteiner av intresse var klonade till pYesNTA-kan. sekvens-kontrollerade plasmider omvandlades till S. cerevisiae och transformanter var seriellt utspädd och fläckig på URA- glukos och galaktose agar att bedöma toxicitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: översikt över den jästsuppressor skärmen. Målgenen av intresse var klonade till pYesNTA-kan och plasmider förvandlades till S. cerevisiae. Transformanter var seriellt utspädd och fläckig på URA- glukos och galaktose agar att bedöma toxicitet. För att identifiera den väg som riktas mot den giftiga effektorproteinet förvandlades jäststammen som uttryckte det giftiga proteinet med en jäst genomisk bibliotek. Kolonier var lappade på URA- Leu- galaktose agar och fläckig för att bedöma toxicitet. Plasmider isolerades från dem som hämmar toxiciteten av effektorproteinet. Plasmider omomvandlades till den giftiga jäststammen för att bekräfta att den isolerade plasmid är en suppressor. Plasmider från suppressorer var sekvenserade för att identifiera jäst ORFs närvarande. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll beskriver steg-för-steg-procedurer för att identifiera värd biologiska vägar riktade av bakteriella effektorproteiner med hjälp av en modifierad jäst toxicitet och suppressor skärm. Den jäst stam som används, S. cerevisiae W303, är auxotrophic för både uracil och leucin. Uracil auxotrophy av stammen används för att välja jäst transporterar protein av intresse på pyesnta-kan vektor medan leucin auxotrophy används för att välja för jästen genomisk Library Vector pYep13. Jästen genomiskt Arkiv plasmider bär 3 − 13 ORFS, så varje ORF bör individuellt klonas in i P415-ADH vektor6 eller en liknande vektor och omformas in i den giftiga jästen för att identifiera som är det riktigt suppressor. Det är typiskt att identifiera flera suppressorer som representerar en värd biologisk väg. Suppressorer kan ibland vara direkta bindande partner av bakterie protein av intresse, men inte alltid.

Generera jäst kloner transporterar bakterie protein av intresse på pYesNTA-kan är det första stora steget och stor försiktighet bör iakttas för att bevara integriteten av dessa kloner så snart som möjligt eftersom det finns starkt negativt urval för jäst redovisade giftiga proteiner, även utan avsiktlig galaktoinducering, och de kan förlora Plasmiden. Ibland finns plasmid förlust även när jästen upprätthålls under urval på avhopp media. En metod har tidigare rapporterats för att minska förekomsten av plasmid förlust genom linearizing vektorn och integrera den i jästgenomet1.

En stor nackdel med dessa tekniker är att den suppressor skärmen endast ger meningsfulla data om överuttryck av bakteriell effektor proteinet utlöser en observerbar och konsekvent tillväxtfel i jäst. Den primära svårigheten i denna metod är när inga suppressorer identifieras. Det är svårt att avgöra om en underlåtenhet att identifiera suppressorer beror på biologiska skäl eller tekniska frågor. Ur ett biologiskt perspektiv kan det finnas flera orsaker: proteinet av intresse kan vara så giftigt att proteiner från genomiskt bibliotek inte kan kraftigt undertrycka toxicitet, kan den riktade vägen vara oförmögen att rädda, eller många Co-uttryckte faktorer kan krävas för att övervinna den toxiska effekten. Närmar sig den biologiska förklaringen är utmanande, eftersom det finns många odefinierade variabler att dissekera. Eftersom det finns ett etablerat protokoll, utforska tekniska förklaringar är en mycket mer tractable strategi. Ur teknisk synvinkel, ett misslyckande att identifiera dämpning är sannolikt resultatet av låg verkningsgrad av jäst genomiskt bibliotek. Detta protokoll använder ATCC S. cerevisiae AB320 delvis smält genomiskt bibliotek i pYEp13. Andra bibliotek kan vara tillräckliga och andra vektorer, men det här protokollet använder specifikt ATCC-biblioteket och det finns inga studier som för närvarande publiceras som rapporterar alternativa bibliotek eller vektor källor. Det rekommenderas starkt att täckningen av jästgenomet bör vara minst 10X, eller underrepresentation kan hindra identifieringen av suppressorer. Minskad omvandlings effektivitet kan ge dessa nummer under 1x. Således kan delar av jästgenomet inte representeras i suppressor skärmen. Låg omvandlings effektivitet kan bero på många problem, inklusive dåliga reagenser eller dålig biblioteks beredning. Denna metod följer till stor del den DMSO/LiAc omvandlings metod först läggas fram av Hill et al.7. Det rekommenderas att nya DMSO, 50% PEG, och färsk sill sperma DNA köps och förberett för transformationer och används uteslutande för dessa analyser för att minska kontaminering eller försämring av kvaliteten på reagenser. DMSO är mycket hygroskopiskt och absorberar vatten från atmosfären lätt. Därför, att göra många individuella användning alikvoter rekommenderas att undvika upprepad öppning av en behållarens lock och exponering för atmosfären. Hög kvalitet sill sperma DNA kan lagras vid-20 ° c och förblir lämplig för användning i flera år, även om en ny beredning bör förberedas från beståndet för varje omvandling. När kokt och svalnat, bör sill sperman DNA inte rekokt eller återanvändas, så det är bäst att bara ta bort vad som behövs och undvika att göra mer än vad som är nödvändigt för den aktuella omvandlingen. Uppmärksamhet på Detaljer kan avsevärt förbättra omvandlings effektiviteten av jäst och förbättra chanserna att identifiera en suppressor.

Med tanke på att jästen pYep13 vektor bär 3 − 13 olika jäst ORFs, minska antalet falskt positiva plasmider är avgörande för att identifiera suppressorer. Jäst kan ta upp och hysa flera kopior av liknande vektorer, medan den allmänna visdom i samband med plasmid inkompatibilitet traditionellt dikterar att E. coli endast upprätthåller en typ av plasmid med samma ursprung replikering (ORI) i taget, även om detta inte alltid är fallet. Detta kan bli en viktig fråga när man försöker identifiera suppressor kandidater. Om suppressor jäst kloner identifieras, plasmiderna kommer att extraheras och omformas till E. coli för förökning och efterföljande sekvensering för identifiering. När kandidaten suppressor plasmid har isolerats och omomvandlats till E. coli, det rekommenderas starkt att minst fem E. coli kolonier plockas för sekvensering, eftersom det är möjligt att enskilda kloner kan bära olika plasmider. Eftersom e. coli bör endast kunna propagera en Plasmid i taget, om jästen isoleringen ger flera plasmider, olika E. coli kloner på plattan bör bära endast en av dem i taget. Därför plocka fem kolonier baserat på normal omvandling effektivitet i E. coli bör visa om klonerna bär samma eller olika plasmider. Om flera plasmider uppstår efter sekvensering av plasmiderna från E. coli, bör var och en omvandlas till den giftiga jästklon och bedömas för räddning av tillväxtdefekten. Dessutom, även om endast en enda suppressor plasmid identifieras, för noggrannhet och reproducerbarhet omformning av Plasmiden i giftiga klon uppmuntras.

Den jäst suppressor analysen är ett mycket stort experiment och lämplig tid och material bör planeras i enlighet därmed. Detta protokoll innehåller många detaljer som måste följas strikt och det rekommenderas att forskaren utför dessa analyser noggrant läsa och titta på protokollet i sin helhet innan du startar ett test. Detta är ett multipartsförfarande som omfattar både bakterier och jäst som behöver odlas vid olika temperaturer. Isolering av plasmider från jäst kan ibland vara svårt på grund av deras tuffa cellväggen och användning av DMSO hjälper till att uppnå högre omvandlings effektivitet.

En av de största fördelarna med jästtoxicitet och suppressor skärmen är att bakterien effektor inte behöver fysiskt binda till värd substrat för någon märkbar mängd tid att upptäcka den förmodade vägen riktade. Endast en liten handfull studier har rapporterat med hjälp av denna eller en liknande teknik1 – 5. Det finns dock rapporter om tekniker som identifierar värdvägar och många tekniker för att avskärma för bindande partners av bakteriella effektorproteiner. Kramer et al. rapporterade en ny systembiologi metod för att identifiera vägar riktade av bakteriella effektorproteiner8. Tekniken används en haploida radering stam insamling av S. cerevisiae att skärmen för mutanter känsliga för Shigella effektor Osp4. Med hjälp av denna teknik, Osp4 var kopplad till regleringen av MAPK signalering och dämpning av medfödd immunitet i värdceller. Array-baserade, hög genomströmning, automatiserad jäst-två hybrid skärmar kan nu snabbt identifiera förmodade bakteriell effektor bindande partners genom screening många samtidigt mot miljontals värd proteiner9. På samma sätt, hög genomströmning immunoprecipitations tillsammans med masspektrometri används för att massan identifiera förmodade bindande partners av hela familjer av bakteriella effektor proteiner10. Medan många av dessa studier kan påskynda tidsplanen för effektor proteinkarakterisering, de ger sällan insikt om vilka fysiologiska processer som manipuleras och vad det holistiska resultatet av dessa interaktioner är. Sålunda, tekniker som jästtoxicitet och suppressor skärmen är viktiga för att belysa cellulära processer som manipuleras av dessa effektor proteiner. Vid något tillfälle, observationer identifiera bindande partners eller vägar riktade av bakteriella effektor proteiner måste återvända till cellulära infektions modeller för att avgöra om dessa in vitro-fynd hålla sant i fysiologiskt relevanta scenarier. Genetisk manipulation av obligate intracellulära patogener som C. trachomatis har varit ett stort hinder tills nyligen11 – 15 och generering av platsspecifika mutanter för att studera effektorproteiner var inte möjligt. Under de senaste åren har dock en revolution för att generera klamydial mutanter, som kompletterar dem, och överuttrycker målproteiner inträffat. Dessa nya framsteg har kraftigt förbättrat värdet av den information som härrör från studier med hjälp av toxicitet och suppressor skärmar som det är nu möjligt att gå från jäst direkt till infektion för att söka giltigheten av resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Shelby Andersen, Abby McCullough och Laurel Woods för deras hjälp med dessa tekniker. Denna studie finansierades av startup medel från University of Iowa Institutionen för mikrobiologi och immunologi till Mary M. Weber.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Fisher Scientific BP2641500
Galactose MilliporeSigma G0750-1KG
GeneJet Gel extraction kit ThermoFisher Scientific K0691
GeneJet PCR purification kit ThermoFisher Scientific K0701
GeneJet plasmid miniprep kit Thermo K0503
Glucose MilliporeSigma G8270-1KG
Herring Sperm DNA Promega D1811
KpnI-HF New England Biolabs R3142S
Lithium acetate dihydrate MilliporeSigma L6883-250G
Peptone Fisher Scientific
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0530
Poly(ethylene glycol) 3350 MilliporeSigma 1546547-1G
pYep13 ATCC 37323
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202S
Tryptophan MilliporeSigma 470031-1G
XhoI-HF New England Biolabs R0146S
Yeast extract Fisher Scientific BP1422-500
Yeast miniprep kit Zymo D2001
Yeast nitrogen base without amino acids MilliporeSigma Y0626-250G
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1501-20G without uracil
Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements MilliporeSigma Y1771-20G without uracil, leucine, tryptophan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tan, Y., Luo, Z. Q. Legionella pneumophila SidD is a deAMPylase that modifies Rab1. Nature. 475 (7357), 506-509 (2011).
  2. Guo, Z., Stephenson, R., Qiu, J., Zheng, S., Luo, Z. A Legionella effector modulates host cytoskeletal structure by inhibiting actin polymerization. Microbes and Infection. 16 (3), 225-236 (2014).
  3. Tan, Y., Arnold, R. J., Luo, Z. -Q. Legionella pneumophila regulates the small GTPase Rab1 activity by reversible phosphorylcholination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (52), 21212-21217 (2011).
  4. Weber, M. M., et al. The type IV secreted effector protein CirA stimulates the GTPase activity of RhoA and is required for virulence in a mouse model of Coxiella burnetii infection. Infection and Immunity. 84, (2016).
  5. Faris, R., et al. Chlamydia trachomatis CT229 subverts Rab GTPase-dependent CCV trafficking pathways to promote chlamydial infection. Cell Reports. 26, 3380-3390 (2019).
  6. Mumberg, D., Müller, R., Funk, M. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene. 156, 119 (1995).
  7. Hill, J., Donald, K. A. G., Griffiths, D. E. DMSO-enhanced whole cell yeast transformation. Nucleic Acids Research. 19 (20), 41070 (1991).
  8. Kramer, R. W., et al. Yeast Functional Genomic Screens Lead to Identification of a Role for a Bacterial Effector in Innate Immunity Regulation. PLoS Pathogens. 3 (2), 21 (2007).
  9. Häuser, R. T. S., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
  10. Mirrashidi, K. M., et al. Global mapping of the inc-human interactome reveals that retromer restricts chlamydia infection. Cell Host and Microbe. 18 (1), 109-121 (2015).
  11. Wang, Y., et al. Development of a transformation system for chlamydia trachomatis: Restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258 (2011).
  12. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene deletion by fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7 (1), 1-9 (2016).
  13. Johnson, C. M., Specific Fisher, D. J. Site-Specific, Insertional Inactivation of incA in Chlamydia trachomatis Using a Group II Intron. PLoS ONE. 8 (12), 83989 (2013).
  14. Weber, M. M., et al. Absence of specific Chlamydia trachomatis inclusion membrane proteins triggers premature inclusion membrane lysis and host cell death. Cell Reports. 19 (7), 1406-1417 (2017).
  15. Weber, M. M., et al. A functional core of IncA is required for Chlamydia trachomatis inclusion fusion. Journal of Bacteriology. 198 (8), 1347-1355 (2016).

Tags

Genetik bakteriell effektor protein jäst suppressor effektor proteinfunktion jäst skärmar Chlamydia trachomatis typ III utsöndras effektor protein väg identifiering
Identifiering av värdvägar riktade av bakteriella Effektorproteiner med hjälp av jäst toxicitet och suppressor skärmar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Faris, R., Weber, M. M.… More

Faris, R., Weber, M. M. Identification of Host Pathways Targeted by Bacterial Effector Proteins using Yeast Toxicity and Suppressor Screens. J. Vis. Exp. (152), e60488, doi:10.3791/60488 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter