Summary
Представлен протокол для изоляции гепатоцитов мыши от печени взрослых мышей с использованием модифицированной методики перфузии коллагенеза. Также описана долгосрочная культура гепатоцитов в 3D коллагенсэндвиче, а также иммуномаркировка цитоскелетных компонентов для изучения образования желчных каналикуляров и его реакции на лечение.
Abstract
Гепатоциты являются центральными клетками печени, отвечающими за ее метаболическую функцию. Таким образом, они образуют однозначно поляризованный эпителий, в котором два или более гепатоцитов способствуют апикальных мембран, образуя желчь канализациической сети, через которую выделяется желчь. Поляризация гепатоцитов необходима для правильного формирования каналикуляров и зависит от взаимодействия между цитоскелетом гепатоцитов, клеточными контактами и внеклеточной матрицей. В пробирке исследования гепатоцитов цитоскелет атравимы участия в формировании canaliculi и его ответ на патологические ситуации препятствуют отсутствие клеточной культуры, которая будет очень похож на структуру сети canaliculi in vivo. Описано здесь протокол для изоляции гепатоцитов мыши от печени взрослой мыши с помощью модифицированного метода перфузии коллагенеза. Также описано производство культуры в 3D коллагенсэндвич настройки, которая используется для иммуномаркировки компонентов цитоскелета для изучения желчных каналикулярных формирования и его ответ на лечение в пробирке. Показано, что гепатоцит3D коллагена сэндвич культур реагировать на лечение с токсинами (этанол) или актин цитоскелет изменения наркотиков (например, блеббистатин) и служить ценным инструментом для в пробирке исследования желчных каналикули формирования и функции.
Introduction
Гепатоциты, центральные клеточные структуры печени, которые отвечают за ее метаболические функции, являются однозначно поляризованными эпителиальными клетками. Их поляризация, появляющаяся у млекопитающих вскоре после рождения, приводит к образованию желчной каналикулярной сети и необходима для правильной секреции желчи. Аптические мембраны гепатоцитов коллективно образуют желчь canaliculi, в то время как базальные мембраны остаются в контакте с эндотелием синусоидов. Потеря поляризации гепатоцитов приводит к перераспределению транспортеров желчи и приводит к патологическим процессам, связанным с задержкой желчи в печени (т.е. холестаз).
Создание и поддержание поляризации гепатоцитов и развитие желчных каналикули влечет за собой сложные механизмы. Основные процессы зависят от коллективного взаимодействия между цитоскелетом гепатоцитов, контактами клеток и взаимодействиями с внеклеточной матрицей1. Цитоскелет гепатоцитов состоит из всех трех сетей нити, актина цитоскелет, микротрубочки, и промежуточных нитей, которые обеспечивают структурную поддержку каналикулярного образования. Дифференциальная роль компонентов цитоскелета в регенерации и поддержании желчных каналических сетей ранее была проиллюстрирована in vitro в 3D коллаген-сэндвич гепатоцитных культурах2.
Актин микрофиламентов и микротрубочек имеют важное значение на начальных стадиях поляризации мембраны гепатоцитов в местах генерации canaliculus2. Актин цитоскелет устанавливает структуру и функцию желчных каналикули, образуя мембранно-ассоциированные микрофилеты и окружное кольцо, тем самым поддерживая каналическую архитектуру и вставляя актиновый цитоскелет в плотные и придерживающиеся узлов3. Кольцо кератиновых промежуточных нитей за пределами актина цитоскелета еще больше стабилизирует каналикулярную структуру3.
Важность белков в гепатоцитных стыковочных комплексах в организации желчных каналикули архитектуры была хорошо документирована в нескольких выбивания моделей мыши, которые показывают искаженные каналикули у мышей, не хватает как жесткие и / или приверженцев соединения белков4,5,6. Удаление адептов соединения белка-катенина, как было показано, приводит к дезорганизации гепатоцитов актин цитоскелет, расширение желчных каналикулярных люменов, вытекающей жесткой соединения, и эффективно холестатический фенотип4. Кроме того, исследования in vitro показали важность связующих компонентов соединения E-кадерин и q-катенин в реконструкции гепатоцеллю apical lumen и торговли белками7.
Поразительно, абляция цитоскелет кросспригвации белка плектин, который является основным организатором кератина, выявил фенотипы сопоставимы с теми, которые связаны с актина цитоскелет8. Это говорит о решающей роли кератина промежуточных нитей в поддержке каналикулярной структуры. В пробирке исследования с использованием 3D гепатоцитов коллагена бутерброды также показали важность AMP активированного белка киназы и его восходящий активатор LKB1 в желчных каналикулярныхсетейформирования 9 . Эти выводы были затем дополнительно подтверждены последующими исследованиями in vivo10,11. Таким образом, стало ясно, что исследования in vitro необходимы для углубления понимания сигнальных процессов, связанных с установлением поляризации гепатоцитов, надлежащего формирования каналикулярной сети и секреции желчи.
Основной проблемой в изучении процессов, связанных с образованием желчи и его реакцией на патологические ситуации in vitro, является использование условий клеточной культуры, которые очень напоминают ситуацию in vivo12. Свежеизолированные первичные гепатоциты не поляризуются; таким образом, они теряют свою функцию, морфологию и функциональные желчные каналикули в 2D-культурных условиях (например, изменения в регуляции генов, поляризации и дедифференциации13,14,15). Несмотря на это факт, свежеизолированные гепатоциты наиболее точно отражают природу печени invivo, в отличие от печено-производных клеточных линий16. Даже если они были использованы в прошлом, увековеченные клеточные линии не оказывают эпителиально-как характерная морфология гепатоцитов, и желчные каналикулярные люмены, образованные этими клетками напоминают печень canaliculi плохо7. В последнее время 3D культур первичных гепатоцитов, как от мышей и крыс, стали полезным инструментом для изучения процессов, связанных с образованием желчных каналикулярных сетей in vitro9. Первичные гепатоциты, культивированные между двумя слоями коллагена (именуемые 3D коллагеном, могут быть повторно поляризованы в течение нескольких дней. Из-за высоких технических требований, необходимых при культивировании мышей гепатоцитов в 3D коллагеновых сэндвичах, здесь мы представляем сложный протокол для изоляции, культивирования, и иммуномаркировки мыши гепатоцитов, встроенных в 3D коллагенбутерброды бутерброды для того, чтобы охарактеризовать участие цитоскелетных компонентов во время формирования желчных каналов.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Европейской директивой 2010/63/EU и были одобрены Чешской центральной комиссией по защите животных.
1. Материалы
- Домашние животные в специфических условиях без патогенов в соответствии с руководящими принципами Федерации лабораторных ассоциаций наукоемких животных с бесплатным доступом к регулярной чау и питьевой воде. Домашние животные под циклом темного/света 12 h/12 h. Для изоляции гепатоцитов и культуры используйте животных в возрасте 8–12 недель.
- Фондовые решения A и B
- Подготовьте биржевое решение A и биржевое решение B в соответствии с таблицей 1 и таблицей 2,соответственно, заранее. Растворите все компоненты в 1 l дистиллированной H2O (dH2O).
- Отрегулируйте рН растворов до 7.2 и отфильтруйте растворы через фильтр 0,2 мкм. Оба раствора могут храниться при 4 градусах Цельсия в течение 6 месяцев.
- Фондовое решение C
- Подготовьте раствор С в день первичной изоляции гепатоцитов.
- Добавьте все компоненты в соответствии с таблицей 3, заполните до 50 мл общего объема с dH2O, и растворите. Отрегулируйте рН до 7,3.
- Aliquot 50 мл раствора в 50 мл труб. Используйте одну трубку на одно животное. Поместите все необходимые аликвоты в предварительно разогретую водяную ванну (37 градусов по Цельсию).
- Акционерное решение D
- Подготовьте раствор D в день первичной изоляции гепатоцитов.
- Добавить все компоненты в соответствии с таблицей 4, заполнить до 30 мл общий объем с dH2O, и растворить. Отрегулируйте рН до 7,3.
- Aliquot 30 мл раствора в 50 мл труб. Добавить коллагенеза I (5 мг/30 мл) в раствор D. Используйте один аликот на животное. Поместите все аликвоты в предварительно разогретую водяную ванну (37 градусов по Цельсию).
- Биржевое решение E
- Подготовьте раствор E в день первичной изоляции гепатоцитов.
- Добавьте все компоненты в соответствии с таблицей 5, заполните до 50 мл общего объема с dH2O, и растворите. Отрегулируйте рН до 7,3.
- Aliquot 50 мл раствора в 50 мл труб. Добавьте альбумин V (0,65 г/50 мл) в раствор E. Используйте один аликот на животное. Поместите все аликвоты в предварительно разогретую водяную ванну (37 градусов по Цельсию).
2. Приготовление коллагеновых сэндвичей
- За день до первичной изоляции гепатоцитов, подготовить первый слой коллагена I бутерброд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Работа на льду и использовать предварительно охлажденные растворы, советы, пластины и трубки, чтобы свести к минимуму нежелательное гелирование коллагена I. - Нейтрализовать необходимое количество коллагена I (из крысиного хвоста) в соответствии с протоколом производителя. На экспериментальный образец (3,5 см) требуется объем нейтрализации коллагена (1,5 мг/мл). Для приготовления 1 мл нейтрализованного коллагена (1,5 мг/мл) добавьте 100 л 10x DMEM, 1,5 л из 1 МН НаОХ и 48,5 л dH2O в 500 л коллагена (концентрация запасов 3 мг/мл). Проверьте рН нейтрализованного коллагена с лакмусовой бумагой (рН должен быть 7,5 евро).
- Рассеять 100 л нейтрализованного раствора коллагена равномерно, используя предварительно охлажденный 200 л оконечности над поверхностью 3,5 см блюдо, установленное на льду.
- Инкубировать ночь в стандартных условиях культуры (инкубатор с 5% CO2 при 37 градусах Цельсия). В день первичной изоляции гепатоцитов добавьте 1 мл предварительно разогретого (37 градусов По Цельсию) PBS к первому коллагеновому слою. Разрешить коллагена для регидратации в течение 2-3 ч при 37 градусах Цельсия.
3. Оборудование настроено
- Подготовьте все оборудование, указанное в таблице материалов, и установите, как показано на рисунке 1.
4. Хирургическая процедура
- Анестезия мыши путем внутримышечной инъекции плитки (60 мг/кг массы тела), золазепама (60 мг/кг) и ксилазина (4,5 мг/кг). Через несколько минут, подтвердить надлежащее анестезии на ноге щепотку. Если животное не реагирует на щепотку, перейдите на 4.2.
- Поместите обезопаживающую мышь на коврик для вскрытия и засучив нижние и верхние конечности, чтобы зафиксировать мышь в положении на спине. Swab живот с 70% этанола и открыть живот с V-образным разрезом от лобковой области до передних ног. Сложите кожу на грудь, чтобы раскрыть брюшную полость. Поместите рассекающий коврик под рассекающим сядр микроскопом.
- Согните иглу инсулинового шприца (30 G) под углом 45 градусов. Выставляют нижнюю полину вены (IVC), перемещая кишечник и толстую кишку в каудальном направлении.
- Заполните 2,5 мл предварительно разогретого (37 градусов по Цельсию) раствора С в шприц 2 мл с канюлей. Убедитесь, что в канюле или шприцах нет пузырьков воздуха.
- Перед cannulation IVC, изменить положение доли печени, нажав их до диафрагмы с мокрой (PBS) ватным тампоном. Поместите шелковый шов вокруг IVC чуть ниже печени(Рисунок 2A, B).
- Введите 10 л гепарина (5000 U/mL) в вену портала с помощью инсулинового шприца с иглой 30 G, согнутой под углом 45 градусов(рисунок 2С).
- Чтобы канитование печени, сделать небольшой разрез с микрохирургическими ножницами в IVC непосредственно рядом с печенью (ниже шва; Рисунок 2D), который достаточно велик, чтобы вставить канюли. Закрепите канюлу в положении с помощью швов и двух хирургических узлов(рисунок 2E).
- Вырезать вену портала(Рисунок 2F), чтобы перфузии буферов вытекать из печени, чтобы предотвратить расширение печени.
- Вручную пронизываете печень 1,5 мл предварительно разогретого раствора С, медленно нажимая шприц, подключенный к канюле (это должно занять 15 с). Удаление крови из печени путем обесцвечивания печени теперь можно наблюдать.
- Предварительно заполните перистальтический насос предварительно подогретым (37 градусов по Цельсию) раствором C. Проверьте перфузийный аппарат и убедитесь, что в системе нет пузырьков воздуха.
- Осторожно отключите канюлю от шприца и подключите ее к трубам перистальтического насоса, работающего со скоростью потока 2,5 мл/мин. Работайте быстро, но осторожно и убедитесь, что канюля остается в положении и что никакие пузырьки не попадают в трубку или канюлю.
- Пронизываете печень раствором С в течение 2 мин (5 мл раствора С). Измените раствор D и продолжайте перфузию еще 10 мин (25 мл раствора D).
- После того, как печень была проникнута, удалить его из брюшной полости. Печень теперь будет очень хрупкой и бледного цвета(рисунок 3).
5. Изоляция первичных гепатоцитов
- Удалите печень из мыши. Канюля будет по-прежнему привязаны к печени, так что используйте щипцвы, чтобы поднять канюли с печенью, и тщательно отрезать все соединения фасции. Перенесите печень в трубку 50 мл, содержащую 20 мл предварительно прогретого раствора Е.
- Держите канюли с печенью с помощью щипков и отмежевать ткани, потирая печень вокруг стенки трубки для передачи изолированных гепатоцитов в буфер. Держите изолированные клетки на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изолированные первичные гепатоциты жизнеспособны в течение нескольких часов, сохраняя на льду. Пользователи могут повторить шаги 4.1 до 5.2 изоляции первичных гепатоцитов от другой донорской мыши, если это необходимо, или приступить к следующему шагу. - Поместите 70 мкм нейлоновой ячейки ситечко на вершине 50 мл трубки и фильтровать изолированные клетки.
- Центрифуга трубки на 50 х г и 4 кв к в течение 5 мин. Аспирируй супернатант. Чтобы удалить мертвые клетки и увеличить процент жизнеспособных клеток, resuspend гранулы в 20 мл 40% percol в DMEM.
- Центрифуги трубки на 50 х г и 4 кв в течение 5 мин. Аспирировать супернатант, содержащий мертвые клетки и resuspend гранулы в 20 мл раствора Е.
- Центрифуги трубки на 50 х г и 4 кв в течение 5 мин. Аспирировать супернатант и resuspend гранулы в 10 мл раствора Е.
- Проверьте первичный выход гепатоцитов и жизнеспособность с помощью trypan синий окрашивания. Подсчитайте номер ячейки с помощью камеры подсчета клеток Нойбауэр и отрегулируйте концентрацию клеток до 3,75 х 105 жизнеспособных ячеек/мл. Держите клетки на льду.
6. Культивирование первичных гепатоцитов в 3D коллагеновых сэндвичах
- Подготовка гепатоцитов культуры среды (HCM). Добавьте 15 кл глюкагона (1 мг/мл), 15 л гидрокортизона (50 мг/мл) и 40 л инсулина (10 мг/мл) до 50 мл полной среды (DMEM, высокая глюкоза, 10% FBS, 1% пенициллина-стрептомицина).
- Равномерно рассеять 2 мл (5 х 105 клеток/мл) жизнеспособных первичных гепатоцитов в предварительно покрытой 3,5 см блюдо. Инкубировать клетки с 5% CO2 при 37 градусах по Цельсию на 3 ч. Важно: Равномерно распределить клетки, наклоняя блюдо во всех направлениях непосредственно перед тем, как положить блюдо в инкубатор.
- Приготовьте нейтрализованный коллаген I (100 л/3,5 см блюдо; т.е. достаточный объем для всех блюд, как описано выше ,шаг 2.1). Держите на льду до использования.
- После 3 ч тщательно удалите средние и неприсоединенные клетки и добавьте 100 кЛ нейтрализованного коллагена I к каждому 3,5 см блюду, чтобы сформировать верхний слой коллагена бутерброд на клетках. Инкубировать сэндвич с коллагеном в стандартных условиях клеточной культуры (5% CO2 при 37 градусах Цельсия) на 1 ч. После 1 ч инкубации, тщательно добавьте 2 мл HCM.
- После 24 ч культуры, изменить среду HCM на свежий.
- Культура в течение 3-8 дней, в зависимости от образования желчных каналикули. Проверьте культуру каждый день под микроскопом(рисунок 4). Изменение HCM каждый второй день.
7. Иммуномаркировка первичных гепатоцитов в 3D коллагеновых сэндвичах
- Удалите средства массовой информации из гепатоцитов бутерброды, а затем тщательно мыть с предварительно подогретых PBS. Исправьте культуры сэндвича с 1 мл 4% параформальдегида в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре (RT).
- После фиксации, мыть бутерброды 3x в течение 10 минут в 2 мл PBS 0,1% Tween 20 (PBS-T).
- Пермяки клетки с 1 мл 0,1 м глицин, 0,2% Тритон X-100 в PBS на RT для 1 ч. Вымойте 3x на 10 мин в PBS-T.
- Аккуратно нарушить верхний слой коллагена, используя 10 л погрузочный наконечник подключен к вакуумной аспирации для обеспечения достаточного проникновения антител.
- Блок с 1 мл 5% BSA в PBS-T (т.е. блокирующий раствор) для 2 ч. Инкубировать с первичными антителами, разбавленными в блокирующем растворе на ночь при 37 градусах Цельсия. Вымойте 3x в течение 15 мин в PBS-T.
- После мытья, инкубировать со вторичными антителами при 37 кс на 5 ч. Вымойте 3x в течение 15 минут в PBS-T следуют 1x мыть с дистиллированной H2O.
- Гора с анти-увядание монтажа средств (см. Таблица материалов) для микроскопии.
Representative Results
Мышиные первичные гепатоциты были выделены и посеяны в 3D коллагеновы бутерброды. Bile canaliculi между двумя смежными клетками начали образовываться в течение нескольких часов после посева. Клетки образовывали кластеры и самоорганизовывались в приблизительно регулярной сети желчных каналикули в течение 1 дня(рисунок 4). В течение 3-6 дней, кластеры 5-10 клеток, как правило, наблюдались, с полностью поляризованными гепатоцитов формирования каналикулярной сети(рисунок 4).
Лечение первичных гепатоцитов мыши в 3D коллагеновых сэндвичах с токсином (этанол) или цитоскелет-изменяющими препараты (например, blebbistatin, окадаиновая кислота) привело к изменениям в гепатоцитцит цитоскелет, canaliculi ширина, форма, и количество желчных каналикули иллюстрируется иммуномаркировки с антитела к кератину 8 (наиболее обильные кератина в гепатоцитов), фаллоидин (визуализация F-актин), и антитела к жесткой белка перекресток zon-ocquo Рисунок 5).
Лечение этанолом оказало лишь легкое воздействие на организацию кератина 8; однако, это увеличило мучительность (как видно из F-актина окрашивания) и распределение желчных каналикулярных ширин(рисунок 5). Интенсивность сигнала окрашивания ЗО-1 была снижена в этанол-обработанных желчных каналикули по сравнению с необработанными контроля, что свидетельствует о потере жестких узлов после лечения этанола. Ингибирование актомиозина контрактильность с блеббистатином значительно повлияло на форму и количество желчных каналикули. Регулярная каналикулярная сеть была реорганизована, по сравнению с необработанными гепатоцитами, в беспорядочную форму желчных каналикули с повышенной частотой толстых округлых желчных каналикули вместо тонких длинных (как видно в гистограмме каналикулярной ширины).
Кроме того, лечение окадановой кислотой (ОА), ингибирующей фосфатазы сильно влияет на физические свойства кератинов, как ранее показано8,17. ОА изменяет растворимость кератиновных нитей; таким образом, лечение привело к глубокой реорганизации кератина сетки, которая рухнула на большие перинуклеарные агрегаты. Как F-актин, так и плотный протеин соединения ЗО-1 не были локализованы в какие-либо конкретные структуры, что свидетельствует о почти полном исчезновении организованных желчных каналикули и полной потере полярности гепатоцитов. Остальные желчные каналикули были значительно сужены по сравнению с необработанными элементами управления, как видно на гистограмме ширины каналикулярной(рисунок 5).
Для корреляции микроскопических наблюдений изменений в цитоскелете гепатоцитов с гепатоцелликальной биохимической реакцией на лечение, протокол также измерил уровни аланина аминотрансферазы (ALT) и аспартата трансаминаза (АСТ) (два фермента печени, которые обычно используются в качестве маркеров гепатоцеллической травмы) в супернатанте из 3D коллагеновых сэндвичей... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Лечение этанолом значительно повысило уровень как АЛТ, так и АСТ, что свидетельствует о серьезной гепатоцеллюлярной травме. Лечение blebbistatin не привело к каким-либо значительным изменениям в уровнях ALT и AST по сравнению с окадановой кислотой лечения, которое вызвало мягкие биохимические изменения с повышенным уровнем ALT, но никаких изменений в уровнях АСТ. Таким образом, биохимические маркеры гепатоцеллюлярной травмы измеряются в пробирке от гепатоцитов супернатанта, коррелирующих с цитоскелетными изменениями, наблюдаемыми иммуностогированием.
Рисунок 1: Экспериментальная настройка. (A)Мышь, закрепленная в положении на спине, помещается под рассекающим микроскопом перед операцией. Все необходимые хирургические инструменты помещаются на поднос. (B) Perfusion Suite во время перфузии печени мыши показаны силиконовые трубки подключения резервуарс с теплым буфером и проникнуты мыши. (C) Схематическое представление B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Открытие брюшной полости и каниляция IVC. Брюшко открывается V-образным разрезом от лобковой области до передних ног. Кожа складывается над грудью, чтобы разоблачить и увеличить брюшную полость. Чтобы разоблачить IVC, кишечник и толстая кишка тщательно перемещаются caudally. (A, B) Перед cannulation IVC, доли печени должны быть перемещены путем нажатия их вверх к диафрагме с PBS-мокрый ватный тампон. IVC затем тщательно отделены от окружающих тканей, и шелковый шов помещается вокруг IVC в непосредственной близости от печени. Панель B представляет схемы брюшной полости, показанные в панели А. Указаны доли печени, кишечник, нижняя полая вена (IVC, красный) и швы. (C) Гепарин вводится в вену портала (PV, стрелка) с инсулиновым шприцем (30 G игла согнута под углом 45 "). (D) Чтобы канюляции печени, IVC вырезованный непосредственно рядом с печенью (ниже шва). (E) Канюля вставляется и закреплены швами, связывая два хирургических узлов. (F) Вены портала полностью вырезать, чтобы свободный отток буфера, предотвращая расширение печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Представитель изображения печени до и после перфузии. (A, B) Канированная печень была резечена и проникнута в течение 12 мин при скорости потока 2,5 мл/мин. Обратите внимание на значительно обесцвеченную печень после перфузии (B) по сравнению с свежерезеченной печенью (А). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: 3D коллаген сэндвич культуры первичных гепатоцитов мыши. Представитель ярко-поля изображения мыши первичных гепатоцитов культивируется в течение 1, 2 и 3 дней в 3D условиях. Следует отметить, что более крупные кластеры высокоорганизованных клеток образуются после 3 дней в культуре. Коробок области показывают 3x увеличенные изображения. Стрелы указывают на желчь canaliculi. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Оценка морфологического ответа на токсический стресс с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии. Первичные гепатоциты мыши, культивированные в 3D коллагеновых сэндвичах, лечились токсинами (этанол, блеббистатин или окадаевская кислота) на 3-й день культуры. Фиксированные клетки были окрашены для визуализации цитоскелетных компонентов: кератин 8 (зеленый), F-актин (красный), и zonula occludens-1 (ЗО-1, пурпурный) иммунофлуоресценции. Токсическая обработка привела к дезорганизации визуализированных цитоскелетных компонентов, а также к уменьшению количества и увеличению мучительности желчных каналикули. Ширина каналикуляров измерялась как в необработанных, так и в обработанных гепатоцитах и изображалась как гистограммы распределения ширины. Стрелы указывают на желчь canaliculi. Шкала бар 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: Биохимический анализ реакции 3D гепатоцитов коллагена бутерброды с токсичными травмами в пробирке. ALT и AST, устоявшиеся маркеры гепатоцеллюлярной травмы, были измерены в супернатанте из 3D гепатоцитов коллагена бутерброды, обработанные токсинами (этанол, блеббистатин, и окадаиновая кислота). ALT и AST были повышены в обработанных клетках по сравнению с необработанными. Данные сообщаются как арифметические средства - SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Фондовый решение A (10x) | |
| Реагента | Окончательная концентрация (г/литр) |
| Nacl | 80 |
| Kcl | 4 |
| MgSO4No7H2O | 1.97 |
| Na2HPO4No2H2O | 0.598 |
| KH2PO4 | 0.6 |
Таблица 1: Биржевое решение A рецепт.
| Фондовый раствор B (10x) | |
| Реагента | Окончательная концентрация (г/литр) |
| Nacl | 69 |
| Kcl | 3.6 |
| KH2PO4 | 1.30 |
| MgSO4No7H2O | 2.94 |
| CaCl2 | 2.772 |
Таблица 2: Рецепт фондового раствора B.
| Решение C | |
| Реагента | |
| Фондовый решение A (10x) | 5 мл |
| NaHCO3 | 0,1094 г |
| EGTA | 0,0095 г |
| dH2O | до 50 мл |
Таблица 3: Рецепт фондового раствора C.
| Решение D | |
| Реагента | |
| Стоковое решение A (10x) | 3 мл |
| NaHCO3 | 0,065 г |
| CaCl2 | 0,0125 г |
| dH2O | до 30 мл |
Таблица 4: Рецепт фондового раствора D.
| Решение E | |
| Реагента | |
| Стоковое решение B (10x) | 5 мл |
| NaHCO3 | 0,1 г |
| Глюкозы | 0,045 г |
| dH2O | до 50 мл |
Таблица 5: Биржевое решение E рецепт.
Discussion
Использование мыши первичной гепатоцитов культур имеет важное значение для исследований в пробирке, чтобы лучше понять сигнальные процессы, участвующие в создании поляризации гепатоцитов, надлежащего формирования каналикулярной структуры, и секреции желчи. Проблемы в изоляции и долгосрочной культуре мыши первичных гепатоцитов в 2D-культуре привели к изобретению нескольких технических подходов с повышенной изоляционностью и долговечностью изолированных клеток, каждый из которых имеет несколько преимуществ и Недостатки. В настоящее время широко признано, что 2D культуры первичных гепатоцитов имитируют лишь ограниченное количество атрибутов биологии печени в течение короткого периода времени. Таким образом, 3D-культивирование в расположении сэндвича коллагена широко заменяет 2D условия, особенно когда сосредоточено на функции цитоскелета в биологии печени (например, токсические лекарственные эффекты или пространственная организация переноса желчи).
С 1980-х годов было описано несколько протоколов изоляции гепатоцитов мыши с различными модификациями. Двухступенчатый коллагенеза перфузии подход стал широко использоваться во многих лабораториях. Добавление градиентной центрифугирования в протокол изоляции позволяет удалить мертвые клетки19,20 и значительно увеличивает количество жизнеспособных клеток (здесь, обычно до 93%). Несмотря на то, что этот шаг расширяет время обработки клеток и приводит к уменьшению числа клеток21, этот шаг рассматривается как необходимый в 3D коллагена сэндвич культуры для надлежащего образования желчных каналикулярной сети. Кроме того, более важно действовать быстро и точно во время перфузионных шагов, что сокращает время обработки клеток.
Другими важными факторами, повышающие жизнеспособность клеток и их способность юбилярной сети в 3D, является использование свежеприготовленных растворов и избегание пузырьков во время перфузии. Поэтому решения должны быть подготовлены в день изоляции гепатоцитов мыши, а перистальтический насос и трубки должны быть проверены при смене растворов. Если соблюдать протокол, то изоляция первичных гепатоцитов должна быть успешной с высокой урожайностью жизнеспособных клеток.
Другим важным фактором в долгосрочной культуре 3D гепатоцитов является первоначальный источник первичных гепатоцитов, которые используются. Важно использовать животных, которым от 8 до 12 недель, которые служат оптимальными донорами гепатоцитов. Использование гепатоцитов пожилых животных было не столь успешным в долгосрочной культуре, так как эти гепатоциты меняли свою морфологию чаще, деполяризовали и перестали формировать каналикулярные сети. Кроме того, нашивание гепатоцитов на правильно нейтрализованном коллагеновом геле, образованном из относительно высококонцентрированного раствора, является жизненно важным шагом. В большинстве протоколов используются концентрации около 1 мг/мл. После многих оптимизаций, концентрация 1,5 мг/мл является оптимальной для долгосрочного выращивания гепатоцитов и обеспечивает высокоорганизованные гепатоциты с сформированными желчных каналикули.
Этот простой в последующей протокол позволяет долгосрочное выращивание первичных гепатоцитов мыши. Представитель результаты демонстрируют широкий спектр использования для 3D культивированных первичных гепатоцитов мыши при изучении роли цитоскелетных компонентов в формировании желчных каналикули.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Грантагентством Чешской Республики (18-02699S); Грантовое агентство Министерства здравоохранения Чешской Республики (17-31538A); Институциональный исследовательский проект Чешской академии наук (RVO 68378050) и проекты MEYS CR (L-1604 NPU II, LTC17063, LM2015040, OP RDI C.1.05/2.1.00/19.0395, и OP RDE C.02.1.01/0.0/0.0/16-013/0001775); Карлов университет (личная стипендия К.К.), а также проект оперативной программы «Прага-конкурентоспособность» (C.2.16/3.1.00/21547). Мы признательна За поддержку с помощью микроскопии, IMG CAS, Prague, Czech Republic (поддерживаемые MEYS CR проекты LM2015062 и LO1419).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm TC-treated culture dish | Corning | 430165 | |
| 50 mL Centrifuge tubes, SuperClear, Ultra High Performance | VWR | 525-0156 | |
| 70 µm nylon cell strainer | Biologix | 15-1070 | |
| Albumin Fraction V | ROTH | 8076.4 | |
| Arteriotomy Cannula (1mm) | Medtronic | 31001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Collagen I. from Rat tail (3mg/ml) | Corning | 354249 | |
| Collagenase (from Clostridium Hystolyticum) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| D(+) glucose monohydrate | ROTH | 6780.1 | |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 508 | |
| DMEM, high glucose | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| EGTA | ROTH | 3054.2 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | |
| Glucagon | Sigma-Aldrich | G-2044 | |
| Glycine | Pufferan | G 05104 | |
| Heparin (5000 U/mL) | Zentiva | 8594739026131 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| Insulin syringe (30G) | BD Medical | 320829 | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | ROTH | T888.1 | |
| microsurgical forceps | FST | 11252-20 | |
| microsurgical forceps | FST | 11251-35 | |
| microsurgical scissor | FST | 15025-10 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic Pump Minipuls Evolution | Gilson | F110701, F110705 | |
| Potassium Chloride | ROTH | 6781.1 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fischer Scientific | P10144 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Round cover glasses, 30 mm, thickness 1.5 | VWR | 630-2124 | |
| Silk braided black | Chirmax | EP 0.5 – USP 7/0 | |
| Sodium Chloride | ROTH | 3957.1 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30435 | |
| Syringe 2 ml | Chirana | CH002L | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Water bath | Nuve | NB 9 | |
| Whatman membrane filters nylon, pore size 0.2 μm, diam. 47 mm | Sigma-Aldrich | WHA7402004 | |
| Whatman pH indicator papers, pH 6.0-8.1 | GE Healthcare Life Sciences | 2629-990 | |
| Zoletil | Vibrac | VET00083 |
References
- Gissen, P., Arias, I. M. Structural and functional hepatocyte polarity and liver disease. Journal of Hepatology. 63 (4), 1023-1037 (2015).
- LeCluyse, E. L., Fix, J. A., Audus, K. L., Hochman, J. H. Regeneration and maintenance of bile canalicular networks in collagen-sandwiched hepatocytes. Toxicology In Vitro. 14 (2), 117-132 (2000).
- Tsukada, N., Ackerley, C. A., Phillips, M. J. The structure and organization of the bile canalicular cytoskeleton with special reference to actin and actin-binding proteins. Hepatology. 21 (4), 1106-1113 (1995).
- Herr, K. J., et al. Loss of alpha-catenin elicits a cholestatic response and impairs liver regeneration. Scientific Reports. 4, 6835 (2014).
- Yeh, T. H., et al. Liver-specific beta-catenin knockout mice have bile canalicular abnormalities, bile secretory defect, and intrahepatic cholestasis. Hepatology. 52 (4), 1410-1419 (2010).
- Pradhan-Sundd, T., et al. Dual catenin loss in murine liver causes tight junctional deregulation and progressive intrahepatic cholestasis. Hepatology. 67 (6), 2320-2337 (2018).
- Theard, D., Steiner, M., Kalicharan, D., Hoekstra, D., van Ijzendoorn, S. C. Cell polarity development and protein trafficking in hepatocytes lacking E-cadherin/beta-catenin-based adherens junctions. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2313-2321 (2007).
- Jirouskova, M., et al. Plectin controls biliary tree architecture and stability in cholestasis. Journal of Hepatology. 68 (5), 1006-1017 (2018).
- Fu, D., Wakabayashi, Y., Ido, Y., Lippincott-Schwartz, J., Arias, I. M. Regulation of bile canalicular network formation and maintenance by AMP-activated protein kinase and LKB1. Journal of Cell Science. 123, Pt 19 3294-3302 (2010).
- Woods, A., et al. LKB1 is required for hepatic bile acid transport and canalicular membrane integrity in mice. Biochemical Journal. 434 (1), 49-60 (2011).
- Porat-Shliom, N., et al. Liver kinase B1 regulates hepatocellular tight junction distribution and function in vivo. Hepatology. 64 (4), 1317-1329 (2016).
- Sarnova, L., Gregor, M. Biliary system architecture: experimental models and visualization techniques. Physiological Research. 66 (3), 383-390 (2017).
- Talamini, M. A., Kappus, B., Hubbard, A.
- Bhandari, R. N., et al. Liver tissue engineering: a role for co-culture systems in modifying hepatocyte function and viability. Tissue Engineering. 7 (3), 345-357 (2001).
- Godoy, P., et al. Recent advances in 2D and 3D in vitro systems using primary hepatocytes, alternative hepatocyte sources and non-parenchymal liver cells and their use in investigating mechanisms of hepatotoxicity, cell signaling and ADME. Archives of Toxicology. 87 (8), 1315 (2013).
- Wilkening, S., Stahl, F., Bader, A. Comparison of primary human hepatocytes and hepatoma cell line Hepg2 with regard to their biotransformation properties. Drug Metabolism and Disposition. 31 (8), 1035-1042 (2003).
- Strnad, P., Windoffer, R., Leube, R. E. In vivo detection of cytokeratin filament network breakdown in cells treated with the phosphatase inhibitor okadaic acid. Cell and Tissue Research. 306 (2), 277-293 (2001).
- Chalupsky, K., et al. ADAM10/17-Dependent Release of Soluble c-Met Correlates with Hepatocellular Damage. Folia Biologica. 59 (2), 76-86 (2013).
- Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
- Horner, R., et al. Impact of Percoll purification on isolation of primary human hepatocytes. Scientific Reports. 9 (1), 6542 (2019).
- Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
