Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקולים של הערכת תגובת Tfh ו- GC B במודל העכבר של זיהום וירוס שפעת.
Abstract
תאי T Follicular Helper (Tfh) הם תת-קבוצה עצמאית של תאי CD4+ T המתמחה במתן עזרה לפיתוח מרכז נביטה (GC) ויצירת נוגדנים בעלי זיקה גבוהה. בזיהום וירוס שפעת, חזק Tfh ו- GC B תגובות תאים המושרים כדי להקל על מיגור וירוס יעיל, אשר מעניק מודל עכבר מוסמך למחקר הקשורים Tfh. במאמר זה תיארנו פרוטוקולים באיתור תגובה חיסונית בסיסית הקשורה ל-Tfh במהלך זיהום בנגיף השפעת בעכברים. פרוטוקולים אלה כוללים: חיסון תוך-אנלתי של וירוס שפעת; כתם cytometry זרימה וניתוח של תאי Tfh פוליקלוניים ואנטיגן ספציפי, תאי GC B ותאי פלזמה; זיהוי חיסוני של מחשבים אישיים; בדיקה אימונוסורבנטית (ELISA) הקשורה לאנזימים של נוגדן ספציפי לנגיף שפעת בסרום. מבחנים אלה בעצם לכמת את הבידול והתפקוד של תאי Tfh בזיהום וירוס שפעת, ובכך לספק עזרה למחקרים במנגנון בידול מבהיר ואסטרטגיית מניפולציה.
Introduction
בעשור האחרון, מחקרים רבים התמקדו בקבוצת המשנה החדשה שזוהתה CD4+ T תא, קבוצת משנה של תא Tfh, על תפקידיה החיוניים בהתפתחות מרכז נביטה (GC) B. לימפומה B תא 6 (Bcl6), אשר נחשב בעיקר מדכא גנים, הוא גורם הגדרת שושלת של תאי Tfh עבור הראיות כי ביטוי חוץ רחמי של Bcl6 מספיק כדי לנהוג בידול Tfh תוך מחסור של Bcl6 תוצאות בידול Tfh נעלם1,2,3. שלא כמו קבוצות משנה אחרות CD4+ T helper המבצעות את פונקציית האפקטים שלהן על ידי הגירה לאתרי הדלקת, תאי Tfh מספקים את העזרה לתא B בעיקר באזור הזקיקים של תא B של טחול וצומת לימפה. מולקולות מגרה משותף ICOS ו CD40L, לשחק תפקידים משמעותיים באינטראקציה בין תאי Tfh ו- GC B. במהלך בידול Tfh, ICOS משדר אותות הדרושים מתאי קוגניציה B וגם פועל כקולטן המקבל אותות הגירה מתאי עובר אורח B עבור לוקליזציה של אזור B4,5. CD40L הוא מתווך של אותות מתאי Tfh עבור התפשטות תאי B והישרדות6. גורם נוסף הממלא את התפקיד הדומה ל- CD40L הוא ציטוקינים IL21, המופרשים בעיקר על ידי תאי Tfh. IL21 מווסת ישירות את פיתוח וייצור תאי GC B וייצור נוגדנים בעלי זיקה גבוהה, אך תפקידו בבידול Tfh עדיין שנוי במחלוקת7,8. PD-1 ו- CXCR5, אשר משמשים כיום בתדירות הגבוהה ביותר בזיהוי תאי Tfh בניתוח cytometry זרימה, גם לשחק תפקידים משמעותיים הבידול והתפקוד של קבוצת משנה זו. CXCR5 הוא הקולטן של כימוקין זקיקי של תא B ומתווך לוקליזציה של תאי Tfh בזקיקי תא B9. PD-1 מזוהה כעת לא רק יש את פונקציית ההנחיה הזקיקית, אלא גם להעביר אותות קריטיים בתהליך של התבגרות תאים GC B10. בהתבסס על ממצאים אלה, הערכת הביטוי של מולקולות אלה יכול בעצם לשקף את ההבשלה והתפקוד של תאי Tfh.
GC הוא מבנה מיקרואנטומי חולף המושרה באיברי הלימפה משניים ותלוי מאוד בתאי Tfh, ובכך להיות קריאה מושלמת כדי להעריך את תגובת Tfh. ב- GC, לאחר קבלת אותות בתיווך ציטוקינים ומולקולות מגרה משותף, תאי B כפופים להחלפת מעמד והיפרמוטציה סומטית כדי ליצור נוגדנים בעלי זיקה גבוהה11. החלפת מחלקת נוגדנים דיפרנציאלית מתרחשת בנישת ציטוקינים דיפרנציאלית, שבה IL4 ו- IL21 גורמים להחלפת מחלקת IgG1 בעוד IFNγ גורמת למיתוג IgG2 מסוג12. תאי פלזמה הם היצרנים של נוגדנים מופרשים והם תאים מובחנים סופניים. כמו תאי Tfh, התפתחות תאי B ב- GC קשורה לביטוי דינמי של מולקולות משמעותיות רבות. בהתבסס על המחקר הנוכחי, ניתן לזהות תאי GC B כ- B220+PNA+Fas+ או B220+GL7+Fas+ תאים ותאי פלזמה, בהשוואה למבשרים שלהם, ביטוי downregulate של B220 וביטוי CD138 upregulate13. מה עוד, שני מאפיינים אלה ניתן לזהות cytometry זרימה וניתוח immunofluorescence, ובכך להיות הערכה מתאימה של תגובת GC.
תגובות תאיות והומוריסטיות חזקות נגרמות בזיהום וירוס שפעת, עם תאי Tfh ו- Th1 השולטים בתגובת CD4+ T cell14, מה שהופך אותו למודל מושלם למחקר בידול תאי Tfh. שפעת A / פורטו ריקו / 8/34 H1N1(PR8), שהוא זן מותאם לעכבר נפוץ, משמש לעתים קרובות במחקר זה14,15,16. כאן, אנו מתארים כמה פרוטוקולים בסיסיים של Tfh מחקר רלוונטי assay בזיהום וירוס שפעת: 1) חיסון תוך-אפי של וירוס PR8; 2) תאי Tfh ספציפיים לאנטיגן, תאי GC B ופלזמה וזיהוי IL21 עם ציטומטריית זרימה; 3) הדמיה היסטולוגית של GC; 4) זיהוי של טיטר נוגדן ספציפי אנטיגן בסרום עם ELISA. פרוטוקולים אלה מספקים את הטכניקות הדרושות לחוקרים חדשים במחקר הקשור ל- Tfh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של מכון פסטר של שנגחאי, סין. כל הניסויים בוצעו על סמך הפרוטוקולים המוסדיים לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בבעלי חיים שאושרו על ידי הוועדה.
הערה: זיהום וירוס של עכברים ובידוד של איברים צריך להתבצע במצב ABSL2.
1. חיסון של וירוס שפעת PR8 והקלטה של משקל עכברים
- הכינו עכברי C57BL/6 זכרים בני 8 שבועות לזיהום בחדר ABSL2.
הערה: פרוטוקול זה מתאים גם בניסויים עם עכברים נקביים. - דילול של וירוס PR8: להוציא את הנגיף מן המקפיא -80 מעלות צלזיוס דגירה על קרח עד שהוא נמס לתוך נוזל. וורטקס וירוס המניה ביסודיות לדלל את הנגיף ל 2 PFU / μL עם מלוחים סטריליים פוספט אגירה (PBS, 135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 מ"מNa 2HPO4, 1.8 mM KH2PO4) בצינור מראש מצונן 1.5 mL.
-
הרדמה עכברים: לשקול כל עכבר ולחשב את נפח (4-פי (μL) משקל העכבר (ז)) של נתרן pentobarbital (2 מ"ג / מ"ל) לשימוש. להזריק את הנפח המחושב של נתרן pentobarbital תוך-פיריטונית.
הערה: צעד זה הוא לגרום לעכברים לנשום בהתמדה ובשלווה, כך titer מדויק של וירוס יכול להיות מחוסן intranasally. פעימות לב מהירות או איטיות מדי מצביעות על הרדמה בלתי הולמת. בנוסף, מומלץ להשתמש במשחה וטרינרית כדי למנוע יובש בעיניים. - חיסון תוך-אנלתי: מערבולת וירוס PR8 מדולל ביסודיות. צינור 10 μL ולבצע בזהירות חיסון תוך-אנלייתי בצד אחד טיפה אחר טיפה. לאחר סיום החיסון של כל העכברים בכלוב אחד (מקסימום 5 עכברים) בצד זה, חיסון חוזר בצד השני (לשמור על הנשימה של העכבר שלווה ויציבה לאורך כל החיסון). כל עכבר נגוע 40 PFU של וירוס PR8 בסך הכל.
- מניחים את העכברים בנסיכות עצם החזה בכלובים חמים לתחייה טובה יותר.
- יש לנטר את משקל העכבר מדי יום במשך 10 ימים. (יום ההדבקה נרשם כיום 0).
2. בידוד של לימפוציטים מן הטחול ואת בלוטות הלימפה mediastinal (mLN)
- המתת עכבר: לשים את העכברים בתא קטן המתת עכברים על ידי שאיבה לתוך CO2 בשלווה מתחתית התא. להוציא עכברים כאשר הם לא זזים ולבצע נקע בצוואר הרחם כדי להבטיח עכברים למות לחלוטין. טובלים את העכברים עם 75% אתנול ומעבירים למכסה המנוע.
- לשתק את העכברים עם מחטי ניתוח על צלחת קצף ניתוח מכוסה נייר סופג. חותכים את העור לאורך קו האמצע של הבטן ואת הרגליים האחוריות עם מספריים ניתוח למתוח את העור עם פינצטה. לשתק את העור מתוח עם מחטי ניתוח.
- מכינים שתי מנות 6 ס"מ עבור כל עכבר ולשמור אותם על הקרח. שים מסננת תאים 70-μm בכל מנה ולהוסיף 5 מ"ל של DMEM בתוספת 1% סרום שור עוברי (DMEM (1% FBS))
- בידוד טחול: לחתוך את הצפק כדי לחשוף את חלל הבטן עם מספריים ניתוח. קח את הטחול ולשים אותו בצלחת מוכנה.
- בידוד mLN: לחתוך את הסרעפת ואת החלק התחתון של צלע הכלוב לקרבת התימוס. משוך את הצלע הצידה ולהצמיד אותו עם מחטי ניתוח כדי לחשוף את חלל בית החזה. משוך את הריאה הצידה לצד ימין ולהשתמש פינצטה לקחת mLN, מתחת ללב ליד הצד הגחוני של קנה הנשימה.
- שים את mLN בצלחת מוכנה.
- להשיג את המתלים תא יחיד: רשת הטחול או mLN בעדינות עם בוכנה של מזרק 3 מ"ל דרך מסננת תאים 70-μm. יש לשטוף את מסננת התאים ב-1 מ"ל של DMEM טרי (1% FBS). להחזיר את השעיית התא ולהעביר לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
- צנטריפוגה השעיית התא ב 350 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הסר טבעי במיוחד והוסף 1 מ"ל של DMEM (1% FBS).
- Resuspend גלולת התא עם 1 mL-פיפטה ביסודיות. הוסף 4 מ"ל של DMEM (1% FBS) לתוך מתלים תא טחול ולשמור אותם על הקרח עבור הפעולות הבאות.
הערה: יש צורך resuspend גלולה התא עם 1 מ"ל של בינוני הראשון, לא 5 מ"ל, עבור בידוד מוחלט תאים בודדים מן גלולה.
משלב זה ואילך, ניתן לבצע את כל הניתוחים במעבדה הרגילה. -
ספירת תאי טחול
- התחדשו בתאים על ידי סיבוב הצינורות למעלה ולמטה מספר פעמים. קח 10 μL לתוך 90 μL של תא דם אדום (RBC) מאגר תמוגה (10 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, 155mM NH4Cl). דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 3 דקות ולהוסיף 900 μL של PBS קר כדי לסיים את התגובה.
- צנטריפוגה ב 400 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant. Resuspend עם 100 μL של PBS קר. קח 10 μL של תאים לתוך 10 μL של 0.4% w / v כחול trypan ולקחת 10 μL מתוך התערובת לספירת תאים עם המוציטרומטר.
- חישוב: חשב תאים כשיטה רגילה. בקצרה, לספור מספרי תאים בשני ריבועים פינתיים אלכסוניים על המוציטרומטר ולקבל N1, N2 עבור כל ריבוע פינה. יש לחשב את ריכוז התא של השעיית תא 5 מ"ל כ- (N1+N2)/2 x 104 /mL.
3. חיסון של תאי Tfh פוליקלונליים עם PD-1 ו- CXCR5
- כתמים עם נוגדן ביוטין נגד CXCR5.
- המשך את השעיית התאים על-ידי סיבוב הצינור מעלה ומטה. קח 2 x 106 תאים לתוך הצינור FACS ולהוסיף 2 מ"ל של מאגר כתמים (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). לשטוף על ידי מערבולת על מכשיר תנודות מערבולת.
- צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את supernatant על ידי שפיכת הנוזל לטבול את הפה צינור על הנייר סופג פעמיים.
- לשחרר את גלולת התא עם נוזל שאריות על ידי הקשה על החלק התחתון של הצינור. שים את הצינור במחזיק הצינור על קרח.
הערה: נפח הנוזל בשאריות הוא כ 25 μL. - הוסף 0.2 μL של CD16/CD32 נגד עכבר (חוסם Fc-קולטן) עבור כל צינור. וורטקס על ידי הקשה על תחתית הצינור בעדינות ודגר על קרח במשך 10 דקות.
הערה: הכן תערובת נוגדנים לדגימות מרובות על ידי דילול עם 5μL של חיץ כתמים עבור כל צינור. המתכון לתערובת צריך להיות מוכן על ידי דילול (n/10+1) x 0.2 μL Fc-קולטן חוסם לתוך (n/10+1) x 5 מאגר כתמים μL ולהוסיף 5.2 μL תערובת לתוך כל צינור. - הוסף 0.3 μL של ביוטין אנטי עכבר CXCR5 לתוך שאריות 30 μL של חיץ כתמים עבור כל צינור ומערבולת על ידי הקשה על תחתית הצינור.
הערה: הכן תערובת כמתואר בשלב 3.1.4. - דגירה על קרח במשך 1 שעות עם בעדינות לשימוש חוזר תאים על ידי הקשה על הצינור ב 30 דקות.
הערה: וורטקס ב 30 דקות היא להימנע אגרגטים התא עבור כתמים טובים יותר. - הוסף 2 מ"ל של חיץ כתמים ומערבולת על התקן תנודות המערבולת. צנטריפוגה ב 350 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant כמתואר בשלב 3.1.2. וורטקס על ידי הקשה על הצינור ודגרת על קרח עבור כתמים הבאים.
- מכתים עם סמני משטח אחרים.
- הכן תערובת נוגדנים (טבלה 1) כמתואר בשלב 3.1.4.
- מוסיפים תערובת נוגדנים לכל צינור. וורטקס על ידי הקשה על תחתית הצינור ודגרת על קרח במשך 30 דקות.
- לשטוף תאים עם 2 מ"ל של חיץ כתמים. צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- השלך את supernatant ולהוסיף 400 μL של חיץ כתמים. וורטקס הצינור על מכשיר תנודות המערבולת ולשמור על הצינור בחושך עד ניתוח cytometry זרימה.
4. חיסון של נגיף שפעת PR8 NP ספציפי תאי Tfh
הערה: פרוטוקול זה של הכתמת תאי Tfh ספציפיים ל- NP הוא ממחקריםקודמים 15,17.
- בצע כתמי ביוטין-CXCR5 כמתואר בשלב 3.1, למעט העובדה שמספר התא שנלקח עבור הכתמה הוא 3 x 106 עבור מספיק תאים ספציפיים לאנטיגן שיירשמו בציטומטריית זרימה.
- הוסף 0.3 μL של APC-מצומד-IAbNP311-325 MHC מחלקה II (NP311-325)טטרמר לתוך הצינור מ 3.1.7. הכנת תערובת לדגימות מרובות כמו בשלב 3.1.4
הערה: חשוב להכתים טטרמר לפני הוספת נוגדן אנטי CD4 כמו מחייב בין CD4 ו נוגדן אנטי CD4 יפריע כתמי טטרמר אופטימלית. - מוציאים מחדש את תערובת התאים על ידי הקשה עדינה על הצינור ודגרסיה בחושך ב- RT במשך 30 דקות.
הערה: לכסות נייר רטוב על הפה של צינורות כדי להפחית את האידוי - מוסיפים את התערובת של סמני משטח אחרים(טבלה 1)וממשיכים דגירה ב- RT במשך 30 דקות.
- לשטוף ולהשהות מחדש תאים כמתואר בשלבים 3.2.3 ו 3.2.4.
5. חיסון של Bcl6 בתאי Tfh פוליקלונליים
- בצע סמני משטח (טבלה 2) כתמים כמתואר בסעיף 3, למעט כי לשטוף האחרון עם 2 מ"ל של PBS, במקום חיץ מכתים.
- צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את כדורי התא supernatant ו resuspend על ידי הקשה בעדינות על תחתית הצינור.
- הוסף 300 μL של 3.7% פתרון פורמלדהיד (מדולל מ 37% פורמלדהיד עם PBS) לתוך הצינור עבור קיבוע התא. וורטקס על מכשיר תנודות המערבולת והדגירה ב- RT במשך 20 דקות.
- מוסיפים 2 מ"ל של חיץ כתמים לכביסה וצנטריפוגה ב-500 x גרם למשך 6 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השלך את התאים העל-טבעיים וההתחדשות על-ידי הקשה עדינה על הצינור.
- הוסף 300 μL של 0.2% טריטון-X 100 ו resuspend תאים על ידי מערבולת על התקן תנודות מערבולת. דגירה ב RT במשך 15 דקות.
- הוסף 2 מ"ל של חיץ כתמים לכביסה. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך תאים על-טבעיים ונצל מחדש על-ידי הקשה עדינה על תחתית הצינור.
- הוסף 1.5 μL של נוגדן PE-anti-Bcl6 עבור כל צינור. בעדינות הקשה על תחתית הצינור כדי resuspend את התערובת דגירה ב RT במשך 2 שעות עם הקשה בעדינות על הצינור כל 30 דקות.
הערה: מכסים נייר רטוב על הפה של צינורות כדי להפחית את אידוי תערובת. - הוסף 2 מ"ל של PBS בתוספת 0.01% טריטון-X 100 לתוך הצינור. וורטקס וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- חזור לשטוף כשלב 5.8. Resuspend תאים עם 400 μL של חיץ מכתים. שמור תאים בחושך על קרח עד ניתוח ציטומטריה זרימה.
6. כתמים תאיים של IL21
- לעורר תאים עם PMA (phorbol 12-myristate 13-אצטט) ו ionomycin.
- קח 2 x 106 תאים מהשעיית תאים טחול וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את גלולת תא supernatant ו resuspend עם 500 μL של תא T מלא בינוני. מעבירים את התאים לצלחת ה-24 באר.
- הוסף 20 nmol PMA ו 2 μmol ionomycin לתוך 500 μL של מדיום שלם18 ומערבבים ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה.
- הוסף פתרון מוכן בשלב 6.2 לתוך השעיית התא בצלחת 24-well ומערבבים על ידי טלטול הצלחת. הגדר את הפקד unstimulated על ידי הוספת 500 μL להשלים תא T בינוני ללא תוספת של PMA ו ionomycin לתוך התאים. דגירה באינקובטור CO2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
- הוסף 10 מיקרומול BFA (ברפלדין A, מומס עם מתנול) לתוך כל באר כדי לחסום את מנגנון Golgi מתווך העברת חלבון. מחזירים את הצלחת לאינקובטור התא ומדגגרים במשך 2 שעות.
- בצע כתמי סמן משטח תא.
- השהה מחדש תאים על-ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה והעבר את התאים לצינור FACS. מוסיפים 1 מ"ל של חיץ כתמים לתוך הצינור וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- בצע כתמי חוסם Fc-קולטן כשלב 3.1.4.
- בצע כתמי משטח תאים (טבלה 3) כמתואר בשלבים 3.2.1 עד 3.2.3 למעט תאי כביסה עם 2 מ"ל של PBS.
- צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השלך את התאים העל-טבעיים וההשתוב מחדש על-ידי הקשה על תחתית הצינור.
- הוסף 0.2 μL של מגיב מתוך ערכת כתמים Live /Dead Fixable Aqua Dead Cell ודגר את הצינור בחושך ב- RT למשך 10 דקות כדי לבצע כתמים של תאים מתים.
- הוסף 2 מ"ל של PBS לתוך הצינור ומערבולת על מכשיר תנודות מערבולת. צנטריפוגה ב 350 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך את supernatant.
- בצע את קיבוע התא כמתואר בשלבים 5.3 ו- 5.4.
- מוסיפים 300 μL של חיץ כתמים כדי resuspend תאים ולאחסן את הצינורות במקרר 4 מעלות צלזיוס לילה. צנטריפוגה ב 500 x g במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר את supernatant.
הערה: ניתן להשמיט שלב זה ולהמשיך לשלב 6.7 ישירות לאחר שלב 6.5. - הוסף 1 מ"ל של מאגר סאפונין (חיץ כתמים בתוספת 0.2%(w/v) סאפונין) לתוך הצינור ומערבולת על התקן תנודות מערבולת. דגירה על קרח במשך 20 דקות כדי לבצע חדירה לתאים.
- צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 6 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולהשליך supernatant.
- הוסף 0.5 μL של קולטן FC-IL21 אנושי לתוך כל צינור. הכן תערובת נוגדנים עבור מרובים כמו שלב 3.1.4 למעט נוגדן מדולל עם מאגר סאפונין במקום חיץ מכתים.
- דגירה ב RT במשך 1 שעות עם הקשה בעדינות על תחתית הצינור כדי resuspend תאים ב 30 דקות.
- הוסף 2 מ"ל של מאגר סאפונין לשטוף תאים צנטריפוגה ב 500 x g במשך 6 דקות. יש להשליך שטיפה על-טבעית וחוזרת פעם אחת.
- הוסף 0.1 μL של APC-אנטי אדם Ig(H +L) לתוך כל צינור. הכן תערובת לדגימות מרובות כשלב 3.1.4 מלבד הנוגדן המדלל עם מאגר סאפונין במקום חיץ מכתים.
- דגירה את הדגימות על קרח במשך 30 דקות.
- Resuspend תאים עם 400 μL של חיץ מכתים. שמור את המדגם בחושך על קרח עד ניתוח cytometry זרימה.
7. כתמי GC B ותאי פלזמה
- קח תאים ולבצע כתמי נוגדן נגד Fc-קולטן כמו צעדים מ 3.1.1 כדי 3.1.4.
- בצע כתמי סמני משטח (טבלה 4) כצעדים מ 3.1.5 עד 3.1.7 אלא שזמן הדגירה הוא 30 דקות במקום 1 שעות.
- Resuspend תאים עם 400 μL של חיץ מכתים. שמור את הדגימות בחושך על קרח עד ניתוח ציטומטריה זרימה.
8. בידוד סרום מדם
- ביום 14 שלאחר ההדבקה (d.p.i 14), לאסוף את הדם מווריד הפנים ולשמור דגימות דם במקרר 4 מעלות צלזיוס לילה.
הערה: בצע איסוף דם במצב ABSL2 ומצעד זה ואילך כל ההליכים יכולים להתבצע במעבדה הרגילה. - צנטריפוגה הדם ב 400 x g במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לבודד את הסרום עם פיפטה 200 μL בזהירות, כדי למנוע זיהום של תאים אדומים. Aliquot לתוך 3 צינורות עבור כל מדגם ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס.
9. בדיקה של טיטר נוגדן ספציפי HA עם ELISA
- מעיל צלחות ELISA עם 50 μL של 2 מיקרוגרם / מ"ל HA פתרון חלבון לכל באר דגירה אותם במקרר 4 מעלות צלזיוס לילה.
- לשטוף שלוש פעמים עם 200 μL של PBS מדולל 0.05% tween (PBST). הוסף 100 μL של חלב PBST מדולל 5% דל שומן לתוך כל באר דגירה ב RT במשך 2 שעות כדי לחסום את מחייב לא ספציפי.
- דילול וסרום ודגרת: הכינו 3% BSA ב-PBS כמאגר הדילול. לדלל את הנסיוב במאגר דילול כמו 1:50, 1:150, 1:450, ...... ל- 1:36450 (מומלץ דילול סדרתי פי שלושה). מוסיפים 50 μL של סרום מדולל לכל באר ומדגרים במקרר 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- להשליך את הסרום במהירות לשטוף את הבארות פעם אחת על ידי הוספת 200 μL של PBST לתוך כל באר (לנער אותו בעדינות, ולאחר מכן להשליך). ואז לאט לשטוף את הצלחות על שייקר עם 200 μL של PBST שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד.
- הוסף 100 μL של נוגדן משני שכותרתו HRP ספציפי עבור IgG הכולל, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, מדולל עם PBST) ואת הדגירה ב RT במשך 1 שעות. לשטוף את הצלחות על ידי PBST כמתואר ב 9.4.
- הוציאו נפח שווה של Buffer A ו-Buffer B (TMB) מאחסון בנפח 4 מעלות צלזיוס והתחממו למשך 30 דקות לפחות ב-RT לפני השימוש. מערבבים A ו- B ומוסיפים 100 μL של TMB לתוך כל באר ולהדגיר אותם במשך 10-30 דקות ב RT על ידי רועד ברכות.
הערה: זהו תיאור קצר של המדריך של ערכת ריאגנט מצע TMB (BD,555214). - פיפטה 100 μL של 2M H2SO4 לתוך כל באר כדי לסיים את התגובה. קרא את ערך OD450 באמצעות מכשיר.
- ניתוח נתונים: קבל את ערך OD450 הסופי על-ידי חיסור אות הרקע (ערך OD450 של באר ריקה). צייר את העקומה המתאימה לאיזוטיפ נוגדן של כל דגימה עם גורם הדילול על ציר X ואת ערך OD450 על ציר Y.
10. היסטולוגיה
- לבודד את הטחולים ב D.p.i 10. לתקן אותם ב 3.7% פתרון פורמלדהיד עבור 1 שעה ב RT. להשליך את מאגר הקיבעון ולשטוף עם PBS במשך 5 דקות על שייקר במשך שלוש פעמים.
- לייבש את הטחולים ב PBS (10% סוכרוז) ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה ולאחר מכן לייבש אותם PBS (30% סוכרוז) ב 4 מעלות צלזיוס עם רועד ברכות עד הטחולים לשקוע לתחתית הצינור 15 מ"ל.
- מוציאים את הטחולים המיובשים, מטמימים אותם בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית וקיאוקציה.
- מצננים מראש את האצטון ב-20°C. דגירה את חלקי הרקמה עם אצטון מצונן מראש במשך 10 דקות. לשטוף את הרקמה עם PBS במשך שלוש פעמים.
- לחלחל קטעי הרקמה עם PBS המכיל 0.2% טריטון X-100 במשך 20 דקות ולשטוף אותם במשך שלוש פעמים עם PBS.
- חסום את הכריכה הלא ספציפית עם PBS המכיל 10% סרום עזים רגיל (חיץ חסימה) למשך שעה אחת ב- RT ולשטוף את מקטעי הרקמה עם PBS פעם אחת.
- חסום את האיגוד הלא ספציפי באמצעות ערכת חסימת STREPTAVIDIN/BIOTIN.
הערה: אל תתנו לדגימות להתייבש משלב זה ואילך. - כתמים עם נוגדן ראשוני: להוסיף חסימת חיץ מדולל ביוטין-PNA (25 מיקרוגרם / מ"ל) וחולדה נגד עכבר IgD (2.5 מיקרוגרם / מ"ל) על קטעי הרקמה בזהירות. דגירה את חלקי הרקמה בתא הרטוב במקפיא 4 מעלות צלזיוס לילה.
- לשטוף במהירות את חלקי הרקמה עם PBST פעם אחת. לשטוף במהירות את חלקי הרקמה PBST עם רועד לאט במשך 5 דקות. יש לשטוף שלוש פעמים.
- לדלל אלקסה פלואור 488-סטרפטבידין (1:500) ואלקסה פלואור 555-עז נגד חולדה IgG (1:500) נוגדנים עם חיץ חסימה ולהוסיף אותם על קטעי הרקמה בזהירות
- דגירה ב RT במשך 1 שעות.
- לשטוף את חלקי הרקמה כמו שלב 10.8 בזהירות לעלות עם הפתרון להאריך. מכסים את הרקמה עם coverlips בזהירות ולשמור אותם כהים ב 4 מעלות צלזיוס עד ניתוח confocal.
- נתח את גודל תגובת GC על-ידי ספירת מספרי GC לכל גודל אזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אפיון תחלואה בעכבר בזיהום בנגיף השפעת
לאחר זיהום בנגיף השפעת, עכברים פעילים פחות אנורקסית עקב מחלה, אשר באה לידי ביטוי על ידי ירידה במשקל חמורה, סימפטום נפוץ כדי לפקח על תחלואה העכבר19. כפי שמוצג באיור 1a, עכברים נגועים בנגיף PR8 החלו לרדת במשקל ביום 6, הגיעו לרמת האובדן הגבוהה ביותר ביום 8 וחזרו לרמה הראשונית ביום 10. כצפוי, ירידה במשקל לא נצפתה לאורך כל התקופה בעכברי בקרה שטופלו ב- PBS. עבור סימפטומים vivo, זיהום וירוס מוביל הרחבת לימפוציטים חזקים בצומת הלימפה ניקוז, mLN במקרה זה. לכן, גודל גדול משמעותית של רשתות mLN נצפו בעכברים נגועים בנגיף PR8 מאשר בעכברי בקרה(איור 1b). יחד, כל העכברים האלה הראו סימפטומים צפויים והוסמכו למחקר התגובה החיסונית הקשורות Tfh הבאים.
זיהוי של בידול Tfh ומולקולות הקשורות לתפקוד
כדי לנתח את הבידול Tfh, עכברים הוקרבו ביום 5, 7, 10 ו 14 לאחר זיהום mLNs או טחולים היו מבודדים לניתוח cytometry זרימה. איור 2א ואיור 2b מציגים את אסטרטגיית גיטינג האוכלוסין של Tfh, כאשר Tfh מגודרכתאי Hi CXCR5 PD-1 ותאים שאינם Tfh כתאיםנמוכיםשל CXCR5 PD-1. עם אסטרטגיה זו gating, הקינטיקה של בידול Tfh במהלך זיהום וירוס שפעת היו assayed. כפי שמוצג באיור 2c, התמיינות Tfh אותחלה ביום 5 והגיעה לשיאה ביום העשירי. אז לקחנו דגימות של היום העשירי לניתוח נוסף. כפי שמוצג באיור 3a, התמיינות תאי Tfh חזקה נגרמה בעכברים נגועים בנגיף שפעת בהשוואה לעכברי בקרה. כדי לנתח תאי Tfh ספציפיים לנגיף שפעת, נוספו תאי Tfh בעלי תווית פלואורוכרום IAbNP311–325 MHC CLASS II tetramers (NP311-325)בלוח הכתמת תאי Tfh פוליקלונליים (טבלה 1). הן בתאי MLN והן בטחול מעכברים נגועים בנגיף שפעת, תאי NP311-325- CD4+ T ספציפיים הושפעו באופן משמעותי ותאי TfhNP 311-325ספציפיים יכולים להיות מנותחים על ידי הוספת PD-1 ו- CXCR5 לניתוח(איור 3e). בשל תפקידים חיוניים של Bcl6 בבידול Tfh, Bcl6+CXCR5+ תאים יכולים לייצג גם את אוכלוסיית Tfh. באופן עקבי, גם תאי Tfh המזוהים עם אסטרטגיה זו הושפעו באופן חזק (איור 3b). אנו מנתחים עוד יותר את הביטוי של Bcl6 בתאי Tfh ולא Tfh. כפי שמוצג באיור 3c, ביטוי גבוה יותר של Bcl6 בתאי Tfh מזה שבתאים שאינם Tfh מציין כתמי Bcl6 מוצלחים. עם אסטרטגיה דומה, ICOS, נותחה גם מולקולה נוספת הקשורה ל-Tfh (איור 3D). בשל התפקיד המיוחד של תאי Tfh במתן עזרה לתאי B, בדיקת הביטוי של IL21, אשר מופרש בעיקר על ידי תאי Tfh והוכח ישירות לווסת את הישרדותם של תאי B והתפשטותם, יכול לחשוף את תפקוד תאי Tfh במידה מסוימת. כפי שניתן לראות באיור 3f, הכתמה תאית של IL21 גילתה כי זיהום PR8 גרם לייצור גבוה משמעותית של ציטוקינים אלה, עם תאים לא מגולגלים כבקרת גיתינג. יחד, מבחנים אלה יכולים לשקף מידע בסיסי של בידול Tfh ולספק את התובנות על יכולת העזרה לתא B.
גילוי של GC B ותאי פלזמה פיתוח ונוגדנים ספציפיים לנגיף שפעת בסרום
הפונקציה העיקרית של תאי Tfh היא לספק עזרה לתאי B ב- GCs, שבה מתרחשים מיתוג מחלקת נוגדנים והתבגרות זיקה. אז פיתוח GC B יכול בעקיפין לשקף בידול ותפקוד של תאי Tfh. תאי GC B יכולים להיות מגודרים כתאי B220+PNA+Fas+ תאים (איור 2d). באמצעות אסטרטגיית גיטינג זו, הנחנו את הקינטיקה של תגובת תאי GC B ומצאנו שתגובת GC B החלה ביום העשירי והמשיכה לעלות ביום 14(איור 2e). ההשוואה בין עכברי ה-PR8 הנגועים בנגיף לבין עכברי הבקרה הראתה כי GC B חזק נגרם הן ב-mLN והן בטחול לאחר הידבקות בנגיףהשפעת(איור 4a),אשר עולה בקנה אחד עם הבידול המושרה Tfh בעכברים נגועים בנגיף PRB. בנוסף, מכתים אימונופלואורסצנטיות עם IgD ו- PNA מספק תמונות חזותיות המצביעות על תגובת GC המושרה (אזורים ירוקים) בעכברים נגועים בנגיף PR8 (איור 4d). תאי פלזמה, שזוהו כתאי IgDLOWCD138+ איור 2d,נוצרו גם בעכברים נגועים בנגיף PR8 (איור 4b). מחקרים קודמים זיהו כי IFNƳ ו IL21 יכול להיות מופרש משני תאים Th1 ו Tfh בזיהום וירוס לגרום IgG2 ו IgG1 בכיתה מיתוג, בהתאמה20. איור 4c מתאר את הדור של נוגדן ספציפי לנגיף שפעת על ידי ELISA assay של IgM ספציפי HA, סך IgG, IgG1, IgG2b ו IgG2C. יחד, כל מבחנים אלה משקפים את התגובות לתאי B הקשורים ל- Tfh בזיהום וירוס שפעת.
איור 1: אפיון תחלואה בעכבר. עכברים זכרים בני 8 שבועות נדבקו ב-40 PFU של נגיף שפעת PR8 על ידי חיסון תוך-אנלתי. עכברים נשקלו מדי יום במשך 10 ימים (א) ו- mLNs היו מבודדים על d.p.i 10(b). קוויהשגיאהב- ( a ) מייצגים את הממוצע ± SD. n = 4 עכברים לכל קבוצה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אסטרטגיית גטינג של תאי Tfh ותאי GC B. (a)לימפוציטים מוגדרים על ידי FSC-A ו- SSC-A, וסינגלים של תאים מגודרים עם FSC-A, FSC-H ו- SSC-A, SSC-W. (ב)לאחר gating בתאי CD4+ T, סמני פני השטח CD62L ו- CD44 משמשים כדי להבחין בין תאי T נאיביים (CD44loCD62Lhi)ותאי T מופעל (CD44hiCD62Llo). תאים Tfh פוליקלוניים ניתן לגזום מתאי T מופעלים כמו PD-1היי CXCR5היי האוכלוסייה, לעומת זאת, תאים שאינם Tfh כמו PD-1נמוךCXCR5נמוך. תאי Tfh ספציפיים לווירוסים PR8 מוגדרים כתאי CD4+CD44+ NP311-325 טטרמר+PD-1hi CXCR5hi תאים. (ג,ה) קינטיקה של תדירות Tfh בתאים פעילים (c) ותדירות GC B בתאי B220+ (e). (ד)תאי GC B מגודרים כתאי B220+ PNA+FAS+ , ותאי פלזמה הם IgD-CD138+ תאים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח של בידול Tfh בעכברים נגועים בנגיף PR8. עכברים הוקרבו על d.p.i 10 ו mLNs וטחול היו מבודדים לניתוח בידול Tfh. (a)אחוז Tfh ב- mLNs וטחול בעכברים נגועים בנגיף PR8 ועכברים שטופלו ב- PBS (הלוח העליון). הסטטיסטיקה של תאי Tfh (הלוח התחתון). (ב)הכתם תאי של Bcl6 בתאי CD4+CD44hi T (הלוח העליון). הסטטיסטיקה של Bcl6+CXCR5+ תאים (הלוח התחתון). (c) Bcl6 ו- (ד) ביטוי ICOS בתאי Tfh (אדום קו) ותאים שאינם Tfh (אפור מלא). (ה)Gating של NP311-325-ספציפי CD4+ תאי T ב- mLNs וטחול של PR8 נגוע בווירוסים ועכברים שטופלו ב- PBS (פאנל שמאלי). אחוז תאי Tfh הספציפיים לווירוסים PR8 ב- mLNs וטחול (הפאנל האמצעי). "Isotype" מציין כתמים עם בקרת טטרמר לא רלוונטית. הסטטיסטיקה של NP311-325- CD4 ספציפי+ תאי T (לוח ימני). (ו)כתמים תאיים של IL-21 בתאי טחול CD4+ T מעכברים נגועים בנגיף PR8 ו- PBS שטופלו, אי-ההטמיות המוצגת כפקד (משמאל). הסטטיסטיקה של מכתים IL-21 (מימין). **P < 0.01, ***P < 0.001 ו-**** P < 0.0001 (מבחן t דו-זנבי). קווי השגיאה מייצגים את הממוצע ± SD. n = 3 עכברים לכל קבוצה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: ניתוח של תגובה הקשורה לתא GC B בעכברים נגועים בנגיף PR8. עכברים הוקרבו על d.p.i 10 ו mLNs וטחול היו מבודדים לניתוח. (a) אחוז תאי GC B (החלונית העליונה). הסטטיסטיקה של תאי GC B (הלוח התחתון). (ב)אחוז תאי הפלזמה (הלוח העליון). הסטטיסטיקה של תאי פלזמה (הלוח התחתון). (ג)כימות של וירוס PR8 HA ספציפי IgG, IgM, IgG1, IgG2b ו IgG2c בסרום (d.p.i 14) של עכברים נגועים בנגיף PR8 ועכברים שטופלו ב- PBS. (ד)מיקרוסקופיה קונפוקלית של זקיקי תא B (IgD+, אדום) ו- GCs (PNA+, ירוק) בדגימות הטחול של עכברים נגועים בנגיף PR8 ועכברים שטופלו ב- PBS (d.p.i 10). *P < 0.5, **P < 0.01 ו-***P < 0.001 (מבחן t דו-זנבי). קווי השגיאה מייצגים את הממוצע ± SD. n = 3 עכברים לכל קבוצה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| סמן פני שטח | פלואורוכרום | שיבוט | אמצעי אחסון לדגימה(ul) |
| תקליטור4 | פרקפ-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | eVolve 605 | הודעות מיידיות7 | 0.2 |
| CD62L | התאמה גופנית | מל-14 | 0.2 |
| עלות(ICOS) | BV421 | 7E.17G9 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| סטרפטבידין | Pe | 0.2 |
טבלה 1: סמן פני השטח (למעט CXCR5) לוח נוגדנים להכתמת תאי Tfh (PD-1הייCXCR5היי).
| סמן פני שטח | פלואורוכרום | שיבוט | אמצעי אחסון לדגימה(ul) |
| תקליטור4 | פרקפ-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | התאמה גופנית | הודעות מיידיות7 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| סטרפטבידין | BV421 | 0.5 |
טבלה 2: נוגדני סמן פני השטח (למעט CXCR5) פאנל להכתמת Bcl6 בתאי Tfh.
| סמן פני שטח | פלואורוכרום | שיבוט | אמצעי אחסון לדגימה(ul) |
| תקליטור4 | פרקפ-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | התאמה גופנית | הודעות מיידיות7 | 0.2 |
טבלה 3: לוח נוגדנים לסמן פני השטח לכתמים תאיים של IL21.
| סמן פני שטח | פלואורוכרום | שיבוט | אמצעי אחסון לדגימה(ul) |
| B220 | Apc | RA3-6B2 | 0.2 |
| IgD (IgD) | שפעת אלקטרונית 450 | 11-26c | 0.2 |
| CD95 | PE/Cy7 | ג'ו2 | 0.3 |
| תב"ת | התאמה גופנית | 0.3 | |
| CD138 | Pe | 281-2 | 0.2 |
טבלה 4: לוח נוגדנים סמן פני השטח להכתמת GC B ותאי פלזמה B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל תפקידים מיוחדים במתן עזרה בתאי B ליצירת נוגדנים בעלי זיקה גבוהה, תאי Tfh נחקרו בהרחבה במנגנוני הבידול והמניפולציה כדי לספק אסטרטגיות חדשות לעיצוב חיסונים. זיהום וירוס שפעת גורם תגובות נמרצות Tfh ו- GC B תאים, ובכך להיות מודל מתאים לתחום זה של מחקר. במאמר זה, תיארנו פרוטוקולים של זיהום וירוס שפעת על ידי חיסון תוך-אפי, הערכה של תגובה הקשורה Tfh על ידי cytometry זרימה, כשל חיסוני ELISA. מבחנים אלה יאפשרו זיהוי של בידול Tfh, פיתוח GC B ונוגדנים ספציפיים לנגיף שפעת ויסייעו לחוקרים לחקור ולזהות מולקולות חיוניות חדשות בתגובה החיסונית.
במחקרים עם מודלים עכברים נגועים בנגיף שפעת, ירידה במשקל היא אינדיקטור נפוץ של תחלואה בעכבר. השינוי הצפוי במשקל בעכברים הנגועים בנגיף השפעת הוא כמתואר באיור 1a, המשקף את התגובה החיסונית המתאימה הנגרמת בעכברים. עם זאת, מקרים חריגים יתרחשו באופן קבוע, שבו העכברים לרדת במשקל שלהם או לא מראים כל ירידה במשקל לאורך כל תקופת התצפית. על פי החוויות שלנו, עכברים אלה יישאו בעיקר תגובה חיסונית נמוכה או גבוהה יותר, ובכך לשבש את תוצאות הניסוי. כדי למנוע וריאציות כאלה, ראשית עכברים המשמשים בניסוי צריך להיות מין וגיל תואם כדי להבטיח את היכולת מגיב דומה וירוס. טיטר וירוס עקבי עבור כל עכבר הוא גם חשוב21. טיטר הווירוסים המשמש בפרוטוקול זה הוא 40 PFU. עם זאת, titer וירוס כדי לגרום קינטיקה שינוי משקל מתאים בכל מעבדה יכול להיות משתנה בשל חוסר עקביות בהליך הערכת titer וירוס זנים העכבר המשמש בניסוי. אז אנחנו מייעצים titration של titer וירוס לזיהום יש צורך לפני מחקר רלוונטי לתגובה חיסונית.
בפרוטוקול זה, זיהינו תאי Tfh עם סמנים הנמצאים בשימוש תכוף PD-1, CXCR5 וגורם שעתוק חיוני Bcl6. למרות שגם PD-1hiCXCR5hi ו- Bcl6+CXCR5+ תאים יכולים להיות מסומנים כתאי Tfh, הם מייצגים אוכלוסייה שונה ואין להם את מערכת היחסים של צאצאי קודמן בהתבסס על העובדה שלא כל תאיההיי PD-1hiCXCR5 הם Bcl6+ ולא כל תאי Bcl6+CXCR5hi הם PD-1hiCXCR5hi hi. פנוטיפ זה יכול להיות מוסבר על ידי ההטרוגניות של ביטוי Bcl6 בתאי Tfh22. ICOS, מולקולה קריטית עבור בידול Tfh והן הגירה צריך להיכלל גם בניתוח של בידול Tfh. בנוסף, מולקולות אחרות הקשורות לתפקוד גירוי משותף, כגון OX40 ו- CD40L צריך גם להיות מזוהה עבור רמת הביטוי שלהם, אם כי לא כלול בפרוטוקול זה. IL21 ו- IL4 הם שניהם ציטוקינים המופרשים על ידי Tfh הממלאים תפקידים בגרימת מיתוג כיתת IgG1. פרוטוקול של גילוי ביטוי IL21 מתואר במאמר זה. עם זאת, בשל הקושי באיתור IL4 בתאי Tfh, נעשה שימוש בעכברי כתב IL4-GFP במחקריםקודמים 23. בפרוטוקול זה, השתמשנו גם tetramers NP שכותרתו פלואורוכרום כדי לזהות NP311-325-ספציפי תאי Tfh. עם זאת, המגבלה בכמות תאי NP311-325-ספציפי Tfh מעניקה את הקושי בניתוח נוסף. לכן, ניסוי העברה מאמצת של שפעת hemagglutinin ספציפי-TCR מהונדס (Tg) CD4+ (TS-1) תאי T, אשר יכול להיות מבודד מעכברי TS-1, היא אסטרטגיה חלופית לפתרון בעיה זו24.
כאן זיהינו GC B כמו B220+PNA+Fas+ תאים בכתם cytometry זרימה. אסטרטגיה שילוב סמן חלופי להגדיר GC B כמו GL7הייפאסהיי תאים משמש גם ניירות אחרים14,16. אנו משתמשים גם בכשל חיסוני כדי לדמיין GCs עם שילוב של אנטי IgD ו PNA. תוספת להלן של נוגדן CD3 יכולה לעזור לדמיין תאי Tfh, ובכך לאפשר מחקר של האינטראקציה בין שני סוגי תאים אלה10.
בהינתן בידול של תאי Tfh הוא תהליך רב-שלבי ורב-תכליתי, יש צורך בהבחנה נוספת של מולקולות משמעותיות אחרות בנקודות זמן מרובות כדי להבהיר מנגנון מפורט יותר בהבחנה Tfh. בנוסף, פרמטרים שזוהו כאן משמשים בדרך כלל גם בדגמים אחרים18. לכן, מלבד זיהום בנגיף שפעת, פרוטוקולים המתוארים כאן, במיוחד החלק immunostaining, יכול גם לספק הוראות במחקר הקשורים Tfh עם מודלים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לצוותים של מתקן cytometry זרימה, מתקן ABSL2 ומתקן בעלי חיים SPF של מכון פסטר של שנגחאי על העזרה הטכנית שלהם וייעוץ. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: תוכנית מחקר בעדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDB29030103), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2016YFA0502202), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31570886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
