تصف هذه الورقة بروتوكولات تقييم استجابة تفه و GC B في نموذج الماوس للعدوى بفيروس الإنفلونزا.
T مُساعد الجريب (Tfh) الخلايا هي مجموعة فرعية مستقلة من الخلايا CD4+ T متخصصة في تقديم المساعدة لتطوير مركز الجراثيم (GC) وتوليد الأجسام المضادة عالية التقارب. وفي عدوى فيروس الأنفلونزا، يتم حث استجابات خلايا تفه وGC B القوية لتسهيل القضاء الفعال على الفيروس، مما يمنح نموذج فأر مؤهل للدراسة المرتبطة بـ Tfh. في هذه الورقة، وصفنا البروتوكولات في الكشف عن الاستجابة المناعية الأساسية المرتبطة بـ Tfh أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا لدى الفئران. وتشمل هذه البروتوكولات: تلقيح فيروس الأنفلونزا داخل الأنف؛ ولقاح فيروس الأنفلونزا؛ ولقاح فيروس الأنفلونزا؛ واللقاحات واللقاحات؛ واللقاحات واللقاحات؛ تدفق التلطخات للخلايا وتحليل خلايا التفح الفارقة البولي كلينال ومضاد خاص, GC B الخلايا والخلايا البلازما; الكشف المناعي من الفلوروس؛ إنزيم مرتبط بالمناعة (ELISA) من الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا في المصل. هذه المقايسة أساسا كمي التمايز و وظيفة خلايا تف في عدوى فيروس الأنفلونزا، وبالتالي توفير المساعدة للدراسات في توضيح آلية التمايز واستراتيجية التلاعب.
في العقد الأخير، ركزت العديد من الدراسات على مجموعة CD4+ T الخلية الفرعية التي تم تحديدها حديثًا، مجموعة الخلايا Tfh الفرعية، لأدوارها الأساسية في تطوير مركز الجراثيم (GC) B. B سرطان الغدد الليمفاوية الخلية 6 (Bcl6), الذي يعتبر أساسا ككبوت الجينات, هو عامل تحديد النسب من خلايا تف للدليل على أن التعبير خارج الرحم من Bcl6 كافية لدفع التمايز تف بينما نقص Bcl6 النتائج في التمايز تف اختفت1,2,3. على عكس مجموعات فرعية أخرى من المساعد CD4+ T تؤدي وظيفتها المؤثرة عن طريق الترحيل إلى مواقع الالتهاب ، توفر خلايا التف خلية B المساعدة بشكل رئيسي في منطقة الخلية B الجريبة من الطحال والعقدة الليمفاوية. الجزيئات المشتركة المحفزة ICOS و CD40L، تلعب أدوارا هامة في التفاعل بين خلايا Tfh و GC B. خلال التمايز Tfh، ICOS ينقل الإشارات الضرورية من الخلايا B cognate وأيضا بمثابة مستقبل استقبال إشارات الهجرة من خلايا المارة B لتوطين منطقة الخلية B4،5. CD40L هو وسيط من الإشارات من خلايا Tfh لتكاثر الخلايا B والبقاء6. عامل آخر يلعب دور مماثل كما CD40L هو cytokine IL21، الذي يفرز أساسا من قبل خلايا تف. IL21 ينظم مباشرة GC B تطوير الخلايا وإنتاج الأجسام المضادة عالية التقارب، ولكن دورها في التمايز Tfh لا يزال مثيرا للجدل7،8. PD-1 و CXCR5، والتي هي الآن الأكثر استخداما في تحديد خلايا تف في تحليل تدفق الخلايا، كما تلعب أدوارا هامة في التمييز وظيفة هذه المجموعة الفرعية. CXCR5 هو مستقبلات من B الخلية chemokine الجريب ويتوسط توطين خلايا تف في بصيلات الخلية B9. تم تحديد PD-1 الآن ليس فقط أن يكون لها وظيفة التوجيه الجريب ولكن أيضا إرسال إشارات حاسمة في عملية GC B خلايا تقارب النضج10. وبناء على هذه النتائج، فإن تقييم التعبير عن هذه الجزيئات يمكن أن يعكس أساسا نضوج ووظيفة خلايا التف.
GC هو بنية ميكرو مجهرية مستحثة في الأعضاء اللمفاوية الثانوية وتعتمد بشكل كبير على خلايا التنفّس، وبالتالي كونها قراءة مثالية لتقييم استجابة Tfh. في GC، بعد تلقي إشارات بوساطة السيتوكينات والجزيئات المشتركة المحفزة، تخضع الخلايا B لتحول الطبقة والتبدل الجسدي لتوليد أجسام مضادة عالية التقارب11. يحدث تبديل فئة الأجسام المضادة التفاضلية في مكانة السيتوكين التفاضلية ، والتي IL4 و IL21 تحفز IgG1 فئة التبديل بينما IFNγ يدفع IgG2 فئة التبديل12. خلايا البلازما هي منتجي الأجسام المضادة المفرزة وخلايا متمايزة بشكل نهائي. مثل خلايا تف، ويرتبط تطوير الخلايا B في GC مع التعبير الديناميكي من العديد من الجزيئات الهامة. استنادا إلى الدراسة الحالية، يمكن التعرف على خلايا GC B كما B220+السلطة الوطنية الفلسطينية+فاس+ أو B220+GL7+فاس+ الخلايا والخلايا البلازما، بالمقارنة مع السلائف، والتعبير downregulate من B220 و upregulate CD138 التعبير13. والأكثر من ذلك، يمكن اكتشاف كل من هذه الخصائص في تحليل قياس تدفق التحاليل والتحاليل المناعية، وبالتالي يتم التقييم المناسب لاستجابة GC.
يتم حث الردود الخلوية والخلطية القوية في عدوى فيروس الأنفلونزا ، مع خلايا Tfh وTh1 التي تهيمن على CD4+ T الخليةاستجابة 14، مما يجعلها نموذجًا مثاليًا لدراسة تمايز خلايا Tfh. الأنفلونزا A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8)، وهي سلالة يشيع استخدامها في استخدام الماوس، وكثيرا ما تستخدم في هذه الدراسة14،15،16. هنا، نحن وصف بعض البروتوكولات الأساسية من فحص دراسة تف ذات الصلة في عدوى فيروس الأنفلونزا: 1) التلقيح داخل الأنف من فيروس PR8; 2) الخلايا Tfh مستضد محددة، GC B وخلايا البلازما والكشف IL21 مع تدفق الخلايا الجذعية؛ 3) التصور النسيجي للGC؛ 4) الكشف عن الأجسام المضادة للجسم المستضد محددة في مصل الدم مع ELISA. وتوفر هذه البروتوكولات التقنيات اللازمة للباحثين الجدد في الدراسة المرتبطة بـ Tfh.
ونظراً للأدوار المتخصصة في توفير المساعدة في الخلية ب لتوليد أجسام مضادة عالية التقارب، فقد تمت دراسة خلايا الت إفه على نطاق واسع في آليات التمايز والتلاعب لتوفير استراتيجيات جديدة لتصميم اللقاحات. إن عدوى فيروس الأنفلونزا تحفز استجابات خلايا تفه و GC B القوية، وبالتالي فهي نموذج مناسب له…
The authors have nothing to disclose.
نشكر موظفي مرفق تدفق استئصال الدراجات ، ومرفق ABSL2 ومرفق الحيوانات SPF من معهد باستور في شنغهاي على مساعدتهم التقنية والمشورة. وقد دعم هذا العمل المنح التالية: برنامج البحوث الاستراتيجية ذات الأولوية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDB29030103)، البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2016YFA0502202)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31570886).
Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
Intracelluar staining of IL21 | |||
37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
ionomycin | Sigma | I0634 | |
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
PMA | Sigma | P1585 | |
Saponin | MP | 102855 | |
GC B and plasma cells staining | |||
B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
PNA FITC | Sigma | L7381 | |
Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
BSA | SSBC | ||
Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
Histology | |||
Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |