Summary
本文描述了在流感病毒感染小鼠模型中评估Tfh和GC B反应的协议。
Abstract
T 卵泡帮助器 （Tfh） 细胞是一个独立的 CD4+ T 细胞子集，专门为细菌中心 （GC） 的发育和高亲和力抗体的生成提供帮助。在流感病毒感染中，诱导强大的Tfh和GC B细胞反应，以促进有效的病毒根除，这为Tfh相关研究提供了合格的鼠标模型。在本文中，我们描述了在小鼠感染流感病毒期间检测与Tfh相关的基本免疫反应的协议。这些协议包括：流感病毒的鼻内接种：流细胞染色和多克隆和抗原特异性Tfh细胞、GC B细胞和血浆细胞的分析：GC的免疫荧光检测;血清中流感病毒特异性抗体的酶相关免疫体检测（ELISA）。这些检测方法基本量化了Tfh细胞在流感病毒感染中的分化和功能，从而有助于研究区分机制和操作策略。
Introduction
近十年来，许多研究都集中在新发现的CD4+T细胞子集Tfh细胞子集上，因为它在胚芽中心（GC）B发育中的重要作用。B细胞淋巴瘤6（Bcl6），主要被认为是一种基因抑制剂，是Tfh细胞的血统定义因子，以证明Bcl6的异位表达足以驱动Tfh分化，而Bcl6的缺乏导致Tfh分化1，2，3消失。与其他CD4+T助剂子集通过迁移到炎症部位来发挥其作用或功能不同，Tfh细胞主要在脾脏和淋巴结的B细胞卵泡区提供B细胞帮助。共刺激分子 ICOS 和 CD40L 在 Tfh 和 GC B 细胞之间的相互作用中起着重要作用。在Tfh分化过程中，ICOS从认知B细胞传输必要的信号，并充当接收来自旁观者B细胞的迁移信号的受体，用于B细胞区域定位4、5。CD40L是来自Tfh细胞的信号的调停器，用于B细胞增殖和生存6。与CD40L扮演类似角色的另一个因素是细胞因子IL21，它主要由Tfh细胞分泌。IL21直接调节GC B细胞的高亲和力抗体的开发和生产，但它在Tfh分化中的作用仍有争议。PD-1 和 CXCR5 现在最常用于识别流细胞学分析中的 Tfh 细胞，它们也在这个子集的分化和功能中发挥着重要作用。CXCR5是B细胞卵泡化学素的受体，并调解Tbh细胞在B细胞卵泡9的本地化。PD-1现已确定不仅具有卵泡导引功能，而且在GC B细胞亲和力成熟10的过程中传输临界信号。基于这些发现，评估这些分子的表达基本上可以反映Tfh细胞的成熟和功能。
GC 是继发淋巴器官中的诱导瞬态微解剖结构，高度依赖 Tfh 细胞，因此是评估 Tfh 反应的完美读出。在GC中，在接收细胞因子和共刺激分子调停的信号后，B细胞受到类开关和体细胞多造，以产生高亲和力抗体11。差异抗体类切换发生在差异细胞因子利基，其中IL4和IL21诱导IgG1类切换，而IFNγ诱导IgG2类开关12。等离子体细胞是分泌抗体的产生者，是最终分化的细胞。与Tfh细胞一样，GC中B细胞的发展与许多重要分子的动态表达有关。根据目前的研究，GC B细胞可以识别为B220+PNA+Fas+或B220+GL7+Fas+细胞和等离子体细胞，与其前体相比，B220的低调节表达和向上调节CD138表达13。此外，这两种特征都可以在流动细胞学和免疫荧光分析中检测出来，从而对GC反应进行适当的评估。
在流感病毒感染中诱导强大的细胞和幽默反应，Tfh和Th1细胞主导CD4+T细胞反应14，这使得它成为Tfh细胞分化研究的完美模型。甲型流感/波多黎各/8/34 H1N1（PR8），这是一种常用的适应鼠标的菌株，在这项研究中经常使用14，15，16。在这里，我们描述了流感病毒感染中Tfh研究相关检测的一些基本方案：1）PR8病毒的鼻内接种：2） 抗原特异性Tfh细胞、GC B和血浆细胞以及IL21检测与流细胞学：3） GC的组织学可视化：4） 检测抗原特异性抗体滴度在血清与 ELISA.这些协议为与Tfh相关的研究中的新研究人员提供了必要的技术。
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Protocol
动物实验得到了中国上海巴斯德学院动物护理和使用委员会的批准。所有实验都是根据机构动物护理和使用委员会批准的动物议定书进行的。
注：小鼠病毒感染和器官分离应在ABSL2条件下进行。
1. 接种PR8流感病毒和记录小鼠体重
- 准备8周大的雄性C57BL/6小鼠感染ABSL2室。
注：此协议也适用于雌性小鼠的实验。 - PR8病毒的稀释：从-80°C冰柜中取出病毒，在冰上孵化，直到它融化成液体。将股票病毒彻底循环，用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS、135 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO 4、1.8 mMKH 2 PO 4）在预冷1.5mL管中稀释病毒至2 PFU/μL。
-
小鼠麻醉： 称量每只小鼠，并计算鼠标重量（4倍（μL）的五巴比妥钠（2毫克/mL）的体积。在腹内注射五巴比妥钠的计算体积。
注：这一步骤是让小鼠稳定、平静地呼吸，以便准确滴答作响的病毒可以在体内接种。心跳过快或速度过慢表示麻醉不当。此外，建议使用兽医软膏，以避免眼干。 - 鼻内接种：彻底使稀释的PR8病毒漩涡。管道 10 μL，并仔细执行一侧一滴一滴的鼻内接种。在完成一个笼子中所有小鼠（最多5只小鼠）的接种后，在另一侧重复接种（通过接种保持小鼠的呼吸平静和稳定）。每只小鼠总共感染了40个PFU的PR8病毒。
- 将老鼠放在温暖的笼子里，以便更好地恢复。
- 每天监测鼠标重量10天。（感染日记录为第 0 天）。
2. 从脾脏和介质淋巴结中分离淋巴细胞 （mLN）
- 老鼠安乐死：把老鼠放在一个小房间里，从腔底和平地 泵入二氧化碳，对老鼠实施安乐死。当老鼠不动的时候，把老鼠拿出来，进行颈椎脱位，以确保老鼠完全死亡。用75%的乙醇浸入小鼠，并转移到生物安全罩。
- 用解剖针将小鼠固定在吸和纸覆盖的解剖泡沫板上。用解剖剪刀切开腹部中线和后腿的皮肤，用钳子伸展皮肤。用解剖针固定拉伸的皮肤。
- 为每只老鼠准备两个6厘米的菜，并把它们放在冰上。在每道菜中放入 70μm 细胞过滤器，并添加 5 毫升的 DMEM 补充 1% 胎儿牛血清 （DMEM （1% FBS））
- 脾脏隔离：切开腹膜，用解剖剪刀露出腹腔。拿脾脏放在准备的菜里。
- mln 隔离： 将隔膜和笼肋骨底部切到胸腺附近。把肋骨拉到一边，用解剖针固定，露出胸腔。将肺拉到右侧，用钳子取mLN，在心脏下面和气管的腹侧附近。
- 将mLN放入准备好的菜中。
- 获得单细胞悬架：通过 70μm 细胞过滤器用 3 mL 注射器轻轻网格脾脏或 mLN。用1毫升新鲜DMEM（1%FBS）冲洗细胞过滤器。重新悬浮细胞悬架并转移到 15 mL 离心管中。
- 离心细胞悬架在350 x g 6分钟在4°C。 删除超强剂并添加 1 毫升 DMEM （1% FBS）。
- 用 1 mL 移液器彻底重新悬念细胞颗粒。将 4 mL 的 DMEM （1% FBS） 添加到脾脏细胞悬架中，并将其保留在冰上以进行以下操作。
注：首先，需要用1mL的介质（而不是5mL）重新悬息细胞颗粒，以完全隔离单细胞与颗粒。
从此以后，所有操作都可以在常规实验室中执行。 -
脾细胞计数
- 通过将管子向上和向下转动数次来重新悬念细胞。将 10 μL 放入 90μL 的红血球 （RBC） 裂解缓冲区 （10 m M 特里斯 - Hcl pH 7.5， 155m NH4Cl）。在室温 （RT） 下孵化 3 分钟，并添加 900μL 的冷 PBS 以终止反应。
- 离心机在400 x g 6分钟在4°C和删除超纳坦。用 100μL 的冷 PBS 重新悬念。将 10 μL 的细胞放入 10 μL 的 0.4% w/v 试盘蓝色中，并从混合物中取出 10 μL，用于使用血细胞计进行细胞计数。
- 计算：将细胞计算为常规方法。简言之，在血小球仪上的两个对角形方块中计算细胞数，每个角方块获得 N1、N2。5mL细胞悬浮液的细胞浓度应计算为（N1+N2）/2 x 10 4/mL。
3. PD-1和CXCR5多克隆Tfh细胞的免疫
- 染色与生物素抗CXCR5抗体。
- 通过上下转动管子来重新悬浮细胞悬架。将 2 x 106 个细胞放入 FACS 管中，并添加 2 mL 的染色缓冲区（PBS（1% FBS，1 mM EDTA）。在涡流振荡装置上通过漩涡清洗。
- 离心机在350 x g 6分钟在4°C。 倒出液体，将管口浸入吸水纸上两次，从而丢弃超纳坦。
- 点击管子底部，用残留液体松开细胞颗粒。把管子放在冰上的管架上。
注：残留液体的体积约为25微升。 - 为每根管子添加 0.2 μL 的反鼠标 CD16/CD32（Fc 受体阻滞剂）。通过轻轻敲击管底，在冰上孵育10分钟，使漩涡。
注：用每根管5μL的染色缓冲液稀释，为多个样品准备抗体混合物。混合物配方应通过稀释（n/10+1） x 0.2 μL Fc 受体阻滞剂放入 （n/10+1） x 5 μL 染色缓冲区，并在每个管子中加入 5.2 μL 混合物。 - 通过点击管底，将 0.3 μL 的生物素防鼠标 CXCR5 添加到每个管和漩涡的污渍缓冲区残留物 30 μL 中。
注：准备步骤 3.1.4 中描述的混合物。 - 在冰上孵育1小时，在30分钟内轻敲管子轻轻重新悬生细胞。
注：30 分钟的漩涡是为了避免细胞聚集物更好地染色。 - 在漩涡振荡装置上添加2mL的染色缓冲器和漩涡。离心机在350 x g 6分钟，在4°C，并丢弃在步骤3.1.2描述的超纳坦。通过敲击管子并在冰上孵化以进行后续染色，从而产生漩涡。
- 与其他表面标记染色。
- 准备抗体混合物（表1）如步骤3.1.4所述。
- 将抗体混合物加入每个管子中。通过敲击管底并在冰上孵育30分钟的漩涡。
- 用2mL的染色缓冲区清洗电池。离心机在350 x g 6分钟在4°C。
- 丢弃超纳坦，加入 400μL 的染色缓冲区。在涡旋振荡装置上对管子进行涡流，并将管子保持在黑暗中，直到进行流细胞学分析。
4. PR8流感病毒NP特异性Tfh细胞的免疫化
注：这个染色NP特异性Tfh细胞的协议是从以前的研究15，17。
- 执行第 3.1 步中描述的生物素-CXCR5 染色，但用于染色的细胞数为 3 x 106， 以便有足够的抗原特异性细胞记录在流细胞学中。
- 从 3.1.7 向管中添加 0.3 μL 的 APC 结合 IAbNP311-325 MHC II 类 （NP311-325）四重奏。为多个样品准备混合物，如步骤 3.1.4
注：在添加抗CD4抗体之前，必须先对四聚物进行污渍，因为CD4和抗CD4抗体之间的结合会干扰最佳的四聚体染色。 - 轻轻敲击管子，在RT的黑暗中孵育30分钟，从而重新悬生细胞混合物。
注：在管子口盖上湿纸以减少蒸发 - 加入其他表面标记（表1）的混合物，在RT继续孵育30分钟。
- 洗涤和重新悬念细胞，如步骤 3.2.3 和 3.2.4 中描述的。
5. 多克隆Tfh细胞中Bcl6的免疫化
- 执行第 3 节中描述的表面标记 （表 2） 染色，但最后用 2 mL PBS 清洗，而不是染色缓冲区。
- 离心机在350 x g 6分钟在4°C。 轻轻敲击管底，丢弃超纳坦和重新悬浮的细胞颗粒。
- 将 300 μL 的 3.7% 甲醛溶液（用 PBS 稀释为 37% 甲醛）放入管中进行细胞固定。涡旋振荡装置上的漩涡，在RT孵育20分钟。
- 在 4 °C 下以 500 x g 在 6 分钟内添加 2 mL 的染色缓冲区，用于清洗和离心机。 轻轻敲击管子，丢弃超纳坦和重新悬浮的细胞。
- 添加 300 μL 的 0.2% Triton-X 100，并通过涡旋振荡装置上的漩涡重新悬浮细胞。在RT孵化15分钟。
- 添加2 mL的染色缓冲区进行清洗。离心机在500 x g 6分钟在4°C。 轻轻敲击管底，丢弃超纳坦和悬浮细胞。
- 为每根管子添加 1.5 μL 的 PE 抗 Bcl6 抗体。轻轻敲击管底以重新悬念混合物，并在 RT 孵育 2 小时，每 30 分钟轻轻敲击一次管子。
注意：在管子口盖上湿纸，以减少混合物蒸发。 - 添加 2 mL 的 PBS 补充 0.01% 特里顿 X 100 到管子中。漩涡和离心机在500 x g 6分钟在4°C。
- 作为步骤 5.8 重复洗涤。带 400μL 染色缓冲器的重新悬念细胞。在冰上保持细胞黑暗，直到流细胞学分析。
6. IL21的细胞内染色
- 用PMA（磷12-肌酸13-醋酸盐）和离子霉素刺激细胞。
- 以2 x 106 细胞从充血细胞悬浮和离心机在350 x g 6分钟在4°C。 用500μL的完整T细胞介质丢弃超纳坦和重新悬浮的细胞颗粒。将细胞转移到24井板中。
- 将 20 nmol PMA 和 2 μmol 离子霉素添加到 500 μL 的完整介质18 中，并通过上下管道彻底混合。
- 将步骤 6.2 中准备的解决方案添加到 24 井板中的单元格悬架中，并通过摇动板混合。通过在细胞中添加 500μL 完整 T 细胞介质而不添加 PMA 和离子霉素来设置未刺激的控制。在 37°C 的 CO2 孵化器中孵育 4 小时。
- 在每口井中加入10微米BFA（布雷费尔丁A，用甲醇溶解），以阻止高尔吉仪器介于蛋白质运输。将板放回细胞孵化器，孵育2小时。
- 执行细胞表面标记染色。
- 通过轻轻上下管道将细胞转移到 FACS 管中来重新悬浮细胞。在管子中加入 1 mL 的染色缓冲液，在 4 °C 下以 350 x g 将离心机加入 6 分钟。
- 执行 Fc 受体阻滞剂染色为步骤 3.1.4。
- 执行细胞表面标记染色（表3），如步骤3.2.1至3.2.3，但用2 mL PBS清洗细胞除外。
- 离心机在350 x g 6分钟在4°C。 通过点击管底丢弃超纳坦和重新悬浮的细胞。
- 从活/死可修复水死细胞染色套件中加入 0.2 μL 试剂，并在 RT 的黑暗中孵育管 10 分钟，以执行死细胞的染色。
- 在涡旋振荡装置的管子和漩涡中加入 2 mL 的 PBS。离心机在350 x g 6分钟在4°C和丢弃超纳坦。
- 执行步骤 5.3 和 5.4 中描述的单元格固定。
- 将 300μL 的染色缓冲器添加到重新悬架的电池中，并将管子存放在 4 °C 冰箱过夜。离心机在 500 x g 6 分钟在 4 °C 去除超纳坦。
注：此步骤可以省略，并继续紧跟第 6.5 步之后的步骤 6.7。 - 在涡旋振荡装置上的管子和漩涡中加入 1 mL 的皂素缓冲区（用 0.2% （w/v） 皂素补充的染色缓冲区。在冰上孵化20分钟，进行细胞渗透。
- 离心机在 500 x g 6 分钟在 4 °C 和丢弃超纳坦。
- 在每个管子中加入0.5μL的人类Fc-IL21受体。将抗体混合物准备多次作为步骤 3.1.4，但用皂素缓冲剂而不是染色缓冲区稀释抗体除外。
- 在 RT 孵化 1 小时，在 30 分钟内轻轻敲击管底以重新悬生细胞。
- 加入2 mL的皂素缓冲液，以500 x g的500 x g清洗电池和离心机6分钟。丢弃超纳坦，重复清洗一次。
- 在每个管子中添加 0.1 μL 的 APC 抗人 Ig （H+L）。作为步骤 3.1.4 为多个样品准备混合物，除非用皂素缓冲区而不是染色缓冲区稀释抗体。
- 在冰上孵化样品30分钟，作为步骤6.11清洗。
- 带 400μL 染色缓冲器的重新悬念细胞。将样品在冰上保持黑暗，直到流细胞学分析。
7. GC B 和血浆细胞染色
- 以细胞为例，执行抗Fc受体抗体染色，从3.1.1到3.1.4。
- 执行表面标记染色 （表 4）作为步骤从 3.1.5 到 3.1.7，但潜伏时间是 30 分钟而不是 1 小时。
- 带 400μL 染色缓冲器的重新悬念细胞。将样品在冰上保持黑暗，直到流细胞学分析。
8. 血清与血液的隔离
- 在感染后的第14天（d.p.i 14），从面部静脉收集血液，并将血液样本保存在4°C冰箱过夜。
注：在ABSL2条件下进行采血，从此以后，所有程序都可以在常规实验室进行。 - 在4°C下将血液在400 x g 的离心机中抽吸10分钟。 用 200 μL 移液器小心隔离血清，以避免红细胞污染。每个样品分为 3 个管子，并存储在 -80°C。
9. 与埃利萨一起检测 HA 特异性抗体滴度
- 每口井配有 50μL 的 2μg/mL HA 蛋白质溶液的涂层 ELISA 板，并在 4 °C 冰箱中孵育过夜。
- 用 200 μL 的 PBS 稀释 0.05% 补间 （PBST） 洗三次。将 100 μL 的 PBST 稀释的 5% 脱脂牛奶加入每个油井，并在 RT 孵育 2 小时，以阻止非特异性结合。
- 血清稀释和孵化：在PBS中准备3%的BSA作为稀释缓冲。稀释缓冲液中的血清稀释为 1：50、1：150、1：450。。。。。。至1：36450（建议进行3倍串行稀释）。将 50 μL 稀释的血清添加到每个油井中，并在 4°C 冰箱中孵育过夜。
- 丢弃血清，通过在每个油井中加入 200 μL 的 PBST 快速洗一次井（轻轻摇动，然后丢弃）。然后用 200μL 的 PBST 缓慢地在摇床上清洗盘子，每次 5 分钟。
- 添加 100 μL 的 HRP 标记的次要抗体，具体用于总 IgG、IgM、IgG1、IgG2b、IgG2c（1：5000，用 PBST 稀释），并在 RT 孵育 1 小时。按 9.4 中描述的 PBST 清洗板。
- 从 4 °C 存储中取出等量的缓冲区 A 和缓冲区 B （TMB），并在使用前在 RT 预热至少 30 分钟。混合 A 和 B，在每口井中加入 100 μL TMB，并通过轻柔摇动在 RT 孵育 10-30 分钟。
注：这是TMB基板试剂集（BD，555214）手册的简要说明。 - 派珀特 100 μL 的 2M H2SO4 进入每个井以终止反应。通过仪器阅读OD450值。
- 数据分析：通过减去背景信号（空井的OD450值）获得最终的OD450值。绘制与每个样品的抗体同型对应的曲线，X 轴上的稀释因子和 Y 轴上的 OD450 值。
10. 形而论
- 在d.p.i 10时隔离麻将。在 RT 中将甲醛溶液在 3.7% 中修复 1 小时。丢弃固定缓冲器，在摇床上用 PBS 清洗 5 分钟三次。
- 在 4°C 下将 PBS 中的黄素（10% 蔗糖）脱水 1 小时，然后在 4°C 的 PBS 中脱水（30% 蔗糖），轻轻摇晃，直到松果沉入 15 mL 管的底部。
- 取出脱水的孢子，嵌入最佳切割温度化合物和低温。
- 在 -20°C 前冷却丙酮。 用预冷丙酮孵育组织部分10分钟。用PBS清洗组织三次。
- 用 PBS 将含有 0.2% 三顿 X-100 的组织部分渗透 20 分钟，然后用 PBS 洗三次。
- 在 RT 中用含有 10% 正常山羊血清（阻塞缓冲区）的 PBS 阻止非特定结合 1 小时，然后用 PBS 洗一次组织部分。
- 用斯特里普塔维丁/生物素阻塞套件阻止非特定绑定。
注意：不要让样品从这一步开始干燥。 - 与原发性抗体染色：小心地在组织部位添加阻塞缓冲稀释生物素-PNA（25μg/mL）和大鼠抗鼠IgD（2.5μg/mL）。在4°C冰柜的湿室中孵育组织部分过夜。
- 用PBST快速清洗组织部分一次。快速洗涤PBST中的组织部分，缓慢摇晃5分钟。重复洗涤三次。
- 稀释亚历克萨氟488-链球菌（1：500）和亚历克萨氟555-山羊抗鼠IgG（1：500）抗体与阻塞缓冲区，并将其添加到组织部分仔细
- 在RT孵育1小时。
- 将组织部分作为步骤 10.8 清洗，并小心地用延长溶液安装。小心地用盖片盖住组织，并在4°C时将其保持在黑暗中，直到进行粘膜分析。
- 通过计算每个区域大小的 GC 数字来分析 GC 反应的大小。
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Representative Results
流感病毒感染中小鼠发病率的描述
流感病毒感染后，小鼠因疾病而不太活跃和厌食，这反映在严重的体重减轻上，这是监测小鼠发病率的常用症状19。如 图1a所示，PR8病毒感染的小鼠在第6天开始减肥，第8天达到最高损失水平，10日恢复到初始水平。不出所料，在PBS治疗的对照小鼠中，整个期间都没有观察到减肥。对于体内症状，病毒感染导致排水淋巴结（在这种情况下为 mLN）中强健的淋巴细胞扩张。因此，在PR8病毒感染小鼠中观察到的mLN比对照小鼠（图1b）大得多。综合起来，这些小鼠都表现出预期的症状，并有资格参加随后的Tfh相关免疫反应研究。
检测Tfh分化和功能相关分子
为了分析Tfh分化，小鼠在感染后的第5天、第7天、第10天和第14天被牺牲，mLN或孢子被隔离进行流细胞学分析。图2a和图2b显示了 Tfh 人口门控策略， Tfh 门控为 Pd - 1hi Cxcr5hi细胞， 非 Tfh 为 Pd - 1低Cxcr5低细胞。通过这种量子策略，对流感病毒感染期间Tfh分化的动能进行了检测。如图2c所示，Tfh 分化在第 5 天初始化，并在第 10 天达到峰值。因此，我们抽取了第10天的样本进行进一步分析。如图3a所示，与对照小鼠相比，流感病毒感染小鼠诱导了强大的Tfh细胞分化。为了分析流感病毒特异性Tfh细胞，在多克隆Tfh细胞染色板（表1）中添加了荧光标记的IAbNP311-325 MHC II类三聚酯（NP311-325）。在MLN和流感病毒感染小鼠的松鼠中，NP311-325-特异性CD4+T细胞都被显著诱导，NP311-325特异性Tfh细胞可以通过添加PD-1和CXCR5进行分析（图3e）进行分析。由于Bcl6在Tfh分化中的基本作用，Bcl6+CXCR5+细胞也可以代表Tfh种群。一直说来，通过这种策略识别的Tfh细胞也被有力地诱导（图3b）。我们进一步分析了在Tfh和非Tfh细胞中Bcl6的表达。如图3c所示，在 Tfh 细胞中 Bcl6 的表达比在非 Tfh 细胞中表达的更高表示成功的 Bcl6 染色。与类似的策略，ICOS，另一个Tfh相关的分子也被分析（图3d）。由于Tfh细胞在为B细胞提供帮助方面具有特殊作用，IL21的表达分析，主要由Tfh细胞分泌，并证明能直接调节B细胞的生存和增殖，可以在一定程度上揭示Tfh细胞的功能。如图3f所示，IL21的细胞内染色显示，PR8感染诱发这种细胞因子的产量显著增加，未刺激的细胞作为量子控制。综合起来，这些检测可以反映Tfh分化的基本信息，并提供对B细胞帮助能力的见解。
血清中GC B和 血浆细胞发育及流感病毒特异性抗体检测
Tfh细胞的主要功能是在GC中提供B细胞帮助，其中抗体类切换和亲和力成熟发生。因此，GC B的发展可以间接反映Tfh细胞的分化和功能。GC B细胞可以作为B220+PNA+法斯+细胞（图2d）。通过这种门感策略，我们检测了GC B细胞反应的动能，发现GC B响应从第10天开始，到第14天继续增加（图2e）。PR8病毒感染者与对照小鼠的比较显示，在流感病毒感染后，在mLN和脾脏中诱导了健壮的GC B（图4a），这与PRB病毒感染小鼠的诱导Tfh分化是一致的。此外，带有IgD和PNA的免疫荧光染色提供可视化图像，指示PR8病毒感染小鼠的诱导GC反应（绿色区域）（图4d）。血浆细胞，确定为IgD低CD138+细胞（图2d），也产生于PR8病毒感染的小鼠（图4b）。 先前的研究已经确定，IFNƳ和IL21可以分泌从Th1和Tfh细胞在病毒感染和诱导IgG2和IgG1类切换，分别20。图4c描绘了由ELISA检测的HA特异性IgM、总IgG、IgG1、Ig2b和IgG2C的流感病毒特异性抗体的生成。所有这些检测结果共同反映了流感病毒感染中与Tfh相关的B细胞反应。
图1：鼠标发病率的描述。 8周大的雄性小鼠通过鼻内接种感染了40种PFU的PR8流感病毒。老鼠每天称重10天（a），mLN在10号（b）被隔离。（a）中的误差条表示每组平均± SD= 4 个鼠标。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图2：Tfh细胞和GC B细胞的量形策略。（a） 淋巴细胞由 FSC-A 和 SSC-A 定义，细胞单体与 FSC-A、FSC-H 和 SSC-A、SSC-W 一起封闭。（b） 在CD4+T细胞中进行间断后，表面标记CD62L和CD44用于区分天真的T细胞（CD44loCD62Lhi）和激活的T细胞（CD44hiCD62Llo）。多克隆Tfh细胞可以从激活的T细胞作为PD-1hi CXCR5高人群，相反，非Tfh细胞作为PD-1低CXCR5低。PR8病毒特异性Tfh细胞被定义为CD4+CD44+NP311-325四重奏+PD-1喜CXCR5高细胞。（c，e）在B220+细胞中激活细胞（c）和GC B频率的Tfh频率的动能学（e）。（d） GC B细胞被封闭为B220+PNA+FAS+细胞，等离子体细胞是IgD-CD138+细胞。 请点击这里查看此数字的较大版本。
图3：PR8病毒感染小鼠Tfh分化分析。小鼠在 d. p. i 10 上被牺牲， mlns 和斯普伦被隔离进行 Tfh 分化分析。（a） PR8病毒感染小鼠和PBS治疗小鼠（上面板）的mLN和松鼠的Tfh百分比。Tfh细胞（下面板）的统计数据。（b） CD4+CD44hi T细胞（上面板）中Bcl6的细胞内染色。Bcl6+CXCR5+细胞（下面板）的统计数据。（c） Bcl6 和 （d） ICOS 表达在 Tfh （线红色） 和非 Tfh 细胞 （纯灰色） 。（e） 在MLN和PR8病毒感染和PBS治疗小鼠（左面板）的P8细胞中，对NP311-325特异性CD4+T细胞进行量位。PR8 病毒特异性 Tfh 细胞在 mlns 和松子 （中间面板） 中的百分比。"同型"表示与不相关的四聚体控制染色。NP311-325-特定CD4+T细胞（右面板）的统计数据。（f） 来自PR8病毒感染和PBS治疗的小鼠的Splenic CD4+T细胞中IL-21的细胞内染色，这种不刺激显示为对照（左）。IL-21染色统计（右）。**P = lt; 0.01， [P = lt; 0.001] P = lt; 0.0001 （双尾学生 t 测试） 。错误条表示每组平均±SD=3个鼠标。请点击这里查看此数字的较大版本。
图4：PR8病毒感染小鼠GC B细胞相关反应分析。 老鼠在 d. p. i 10 上被牺牲， mlns 和 spleens 被隔离进行分析。（a） GC B细胞（上面板）的百分比。GC B细胞（下面板）的统计数据。（b） 血浆细胞（上面板）的百分比。血浆细胞（下面板）的统计数据。（c） 在PR8病毒感染小鼠和PBS治疗小鼠的血清中量化PR8病毒HA特异性IgG、IgM、IgG1、IgG2b和IgG2c（ d.p.i 14）。（d） 在PR8病毒感染小鼠和PBS治疗小鼠的脾脏样本中，对B细胞卵泡（IgD+，红色）和GC（PNA+，绿色）进行分泌显微镜检查（d.p.i 10）。*P =lt; 0.5， **P = lt; 0.01， 和 ***P = lt; 0.001 （双尾学生 t 测试） 。错误条表示每组平均±SD=3个鼠标。 请点击这里查看此数字的较大版本。
| 表面标记 | 荧色素 | 克隆 | 每个样本的体积（ul） |
| CD4 | 佩尔佩-埃弗鲁尔 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | 电子伏605 | IM7 | 0.2 |
| CD62L | 菲特克 | 梅尔-14 | 0.2 |
| 伊科斯 | BV421 | 7E.17G9 | 0.2 |
| PD1 | 体育/赛7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| 斯特雷普塔维丁 | 体育 | 0.2 |
表1：表面标记（CXCR5除外）用于染色Tfh细胞的抗体面板（PD-1喜CXCR5hi）。
| 表面标记 | 荧色素 | 克隆 | 每个样本的体积（ul） |
| CD4 | 佩尔佩-埃弗鲁尔 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | 菲特克 | IM7 | 0.2 |
| PD1 | 体育/赛7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| 斯特雷普塔维丁 | BV421 | 0.5 |
表2：用于在Tfh细胞中染色Bcl6的表面标记抗体（CXCR5除外）面板。
| 表面标记 | 荧色素 | 克隆 | 每个样本的体积（ul） |
| CD4 | 佩尔佩-埃弗鲁尔 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | 菲特克 | IM7 | 0.2 |
表3：用于IL21细胞内染色的表面标记抗体面板。
| 表面标记 | 荧色素 | 克隆 | 每个样本的体积（ul） |
| B220 | APC | RA3-6B2 | 0.2 |
| 伊格德 | e 影响 450 | 11-26c | 0.2 |
| CD95 | 体育/赛7 | 跳 | 0.3 |
| 波纳 | 菲特克 | 0.3 | |
| CD138 | 体育 | 281-2 | 0.2 |
表4：用于染色GC B和等离子体B细胞的表面标记抗体面板。
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Discussion
由于在提供B细胞帮助产生高亲和力抗体方面具有特殊作用，Tbh细胞在分化和操纵机制方面进行了广泛的研究，为疫苗设计提供了新的策略。流感病毒感染诱发强大的Tfh和GC B细胞反应，因此是这一研究领域的一个适当模型。本文通过鼻内接种、流细胞学、免疫荧光和ELISA对Tfh相关反应的评价，描述了流感病毒感染的治疗方案。这些检测将有助于检测Tfh分化、GC B发育和流感病毒特异性抗体，并帮助研究人员探索和识别免疫反应中的新的关键分子。
在流感病毒感染小鼠模型的研究中，减肥是小鼠发病率的常用指标。流感病毒感染小鼠的预期体重变化动能如 图1a所述，它反映了在小鼠中诱导的适当的免疫反应。然而，异常病例会经常发生，其中小鼠在观察期间体重下降或没有出现任何体重下降。根据我们的经验，这些小鼠大多会产生异常的低或高免疫反应，从而破坏实验结果。为了避免这种变化，首先实验中使用的老鼠应该是性别和年龄匹配的，以保证对病毒的类似反应能力。每个鼠标的一致病毒滴定器也很重要21。此协议中使用的病毒滴定器为 40 PFU。然而，由于实验中使用的病毒滴定器评估程序和小鼠菌株不一致，因此每个实验室中诱导适当重量变化动能的病毒滴定器可能是可变的。因此，我们建议在免疫反应相关研究之前，有必要对病毒滴定器进行滴定感染。
在此协议中，我们识别了具有常用标记 PD-1、CXCR5 和基本转录因子 Bcl6 的 Tfh 细胞。虽然PD-1喜CXCR5喜和Bcl6+CXCR5+细胞可以表示为Tfh细胞， 他们代表不同的人口，并没有前体后代关系的基础上的事实，不是所有的PD-1喜CXCR5hi细胞是Bcl6+，而不是所有的Bcl6+CXCR5hi细胞是PD-1喜CXCR5喜。 这种表型可以解释为Btl6表达在Tfh细胞22的异质性。ICOS 是 Tfh 分化和迁移的关键分子，也应包含在 Tfh 分化分析中。此外，还应检测其他功能相关的共刺激分子，如OX40和CD40L，以检测其表达水平，但不包括在此协议中。IL21和IL4都是Tfh秘密细胞因子在诱导IgG1类切换中发挥作用。本文描述了检测IL21表达式的协议。然而，由于在Tfh细胞中检测IL4的困难，IL4-GFP记者小鼠在以前的研究23中使用。在此协议中，我们还使用荧色标记的 NP tetramers 检测 NP311-325特异性 Tfh 细胞。然而，NP311-325-特定Tfh细胞数量的限制使进一步分析困难重重。因此，采用流感血凝素特异性TCR转基因（Tg）CD4+（TS-1）T细胞的转移实验，可以从TS-1小鼠中分离出，是解决这一问题的替代策略。
在这里，我们确定GC B为B220+PNA+Fas+流细胞染色细胞。另一种标记组合策略，将GC B定义为GL7hiFashi细胞也用于其他论文14，16。我们还使用免疫荧光来可视化抗 IgD 和 PNA 组合的 GC。在此添加CD3抗体可以帮助可视化Tfh细胞，从而有助于研究这两种细胞类型10之间的相互作用。
鉴于Tfh细胞的分化是一个多阶段和多因素的过程，在多个时间点对其他重要分子进行额外的检测是必要的，以阐明Tfh分化中更详细的机制。此外，此处检测到的参数也常用于其他型号18。因此，除了流感病毒感染，这里描述的协议，特别是免疫污染部分，也可以提供指示在Tfh相关的研究与其他模型。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢上海巴斯德医院流动细胞学设施、ABSL2设施和SPF动物设施的工作人员提供的技术帮助和建议。这项工作得到了以下资助：中国科学院战略重点研究计划（XDB29030103）、中国国家重点研发计划（2016YFA0502202）、中国国家自然科学基金委员会（31570886）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
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