В настоящем документе описаны протоколы оценки tfh и GC B ответ в мышиной модели инфекции вируса гриппа.
T Фолликулярный помощник (Tfh) клетки являются независимымиCD4 и Т-клеток подмножество специализируется на оказании помощи для развития гермызного центра (GC) и генерации антител высокого сродства. При инфицировании вирусом гриппа для содействия эффективному искоренению вируса индуцируются надежные ответные меры Tfh и GC B, что дает квалифицированную модель мыши для исследования, связанного с Tfh. В этом документе мы описали протоколы в обнаружении основных Tfh связанных иммунного ответа во время инфекции вируса гриппа у мышей. Эти протоколы включают: интраназальная прививка от вируса гриппа; окрашивание цитометрии потока и анализ поликлональных и антиген-специфических клеток Tfh, клеток GC B и плазменных клеток; иммунофлуоресценция обнаружения ДК; связанный с ферментом иммуносорбентный анализ (ELISA) специфических антител вируса гриппа в сыворотке крови. Эти анализы в основном количественно дифференциации и функции Tfh клеток в инфекции вируса гриппа, тем самым предоставляя помощь для исследований в выяснении механизма дифференциации и стратегии манипуляции.
В последнее десятилетие, многочисленные исследования были сосредоточены на недавно выявленныхCD4 И Т-клеток подмножество, Tfh ячейки подмножество, за его основные роли в зародышевой центр (GC) B развития. B-клеточная лимфома 6 (Bcl6), которая в основном рассматривается как репрессор генов, является определяющим фактором линии клеток Tfh для доказательстватого,что эктопическое выражение Bcl6достаточно,чтобы управлять дифференциацией Tfh, в то время как дефицит Bcl6 приводит к исчезновению дифференциации Tfh1,2,3. В отличие от другихподмножества CD4 и T-помощников, выполняющих свою функцию эффектора путем миграции в места воспаления, tfh-клетки оказывают помощь клеткам группы В в основном в фолликулярной зоне В-клеточной селезенки и лимфатического узла. Состимуляторные молекулы ICOS и CD40L играют значительную роль во взаимодействии между Tfh и GC B-клеток. Во время дифференциации Tfh, ICOS передает необходимые сигналы от cognate B клеток, а также выступает в качестве рецептора, принимающего миграционные сигналы от случайных прохожих В-клетокдля локализации В-клеточной зоны 4,5. CD40L является посредником сигналов от Tfh клеток для распространения В-клеток и выживания6. Другим фактором, играющим аналогичную роль CD40L, является цитокин IL21, который в основном выделяется клетками Tfh. IL21 непосредственно регулирует развитие клеток GC B и выработку антител высокого сродства, но его роль в дифференциации Tfh по-прежнемупротиворечива 7,8. PD-1 и CXCR5, которые в настоящее время наиболее часто используются при выявлении клеток Tfh в анализе цитометрии потока, также играют значительную роль в дифференциации и функции этого подмножества. CXCR5 является рецептором В-клеточного фолликулярного хемокина и опосредует локализацию клеток Tfh в В-клеточных фолликулах9. PD-1 в настоящее время определены не только имеют фолликулярную функцию наведения, но и передавать критические сигналы в процессе сродства клеток GC Bсозревания 10. Основываясь на этих выводах, оценка экспрессии этих молекул может в основном отражать созревание и функцию клеток Tfh.
GC является индуцированной переходной микроанатомической структуры во вторичных лимфоидных органов и сильно зависит от Tfh клеток, таким образом, является идеальным считывания для оценки Tfh ответ. В GC, после получения сигналов, опосредовающихся цитокинами и состимуляторными молекулами, В-клетки подвержены классу переключения и соматической гипермутации для генерации антителвысокого сродства 11. Переключение дифференциального класса антител происходит в дифференцированной нише цитокинов, в которой IL4 и IL21 индуцирует переключение класса IgG1, в то время как ИФНЗ индуцирует переключениекласса IgG2 12. Плазменные клетки являются производителями секретных антител и являются неизлечимо дифференцированными клетками. Как и tfh клетки, развитие В-клеток в GC связано с динамическим выражением многих значительных молекул. Основываясь на текущем исследовании, клетки GC Bмогут быть идентифицированы как B220 – PNA–Fas– или B220–GL7–Fas– клетки и плазменные клетки, по сравнению с их предшественниками, downregulate выражение B220 и upregulate CD138выражение 13. Более того, обе эти характеристики могут быть обнаружены в цитометрии потока и иммунофторесценции анализа, таким образом, является надлежащей оценкой реакции ГК.
Надежные клеточные и гуморальные реакции индуцируются при заражении вирусом гриппа, с Tfh и Th1 клетки доминирующейCD4 T-клеток ответ 14, что делает его идеальной моделью для Tfh клетки дифференциации исследования. Грипп A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8), который является широко используемым штаммом, адаптированным к мыши, часто используется вданном исследовании 14,15,16. Здесь мы описываем некоторые основные протоколы Tfh исследования соответствующих анализ в инфекции вируса гриппа: 1) интраназальной прививки от вируса PR8; 2) антиген-специфические клетки Tfh, клетки GC B и плазмы и обнаружение IL21 с цитометрией потока; 3) гистологическая визуализация ГК; 4) обнаружение антиген-специфических антител титр в сыворотке крови с ELISA. Эти протоколы обеспечивают необходимые методы для новых исследователей в Tfh связанных исследований.
Из-за специализированных ролей в предоставлении B-клеточной помощи для генерации антител высокого сродства, Tfh клетки были широко изучены в механизмах дифференциации и манипуляции, чтобы обеспечить новые стратегии для разработки вакцины. Инфекция вирусом гриппа вызывает энергичные о?…
The authors have nothing to disclose.
Благодарим сотрудников предприятия по цитометрии потока, объекта ABSL2 и животноводского комплекса SPF Института Пастера в Шанхае за техническую помощь и консультации. Эта работа была поддержана следующими грантами: Стратегическая приоритетная исследовательская программа Китайской академии наук (XDB29030103), Национальная ключевая программа НИОКР Китая (2016YFA0502202), Национальный фонд естественных наук Китая (31570886).
Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
Intracelluar staining of IL21 | |||
37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
ionomycin | Sigma | I0634 | |
Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
PMA | Sigma | P1585 | |
Saponin | MP | 102855 | |
GC B and plasma cells staining | |||
B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
PNA FITC | Sigma | L7381 | |
Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
BSA | SSBC | ||
Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
Histology | |||
Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |