Summary
Dette papir beskriver protokoller for evaluering af Tfh og GC B respons i mus model af influenzavirus infektion.
Abstract
T Follicular Helper (Tfh) celler er en uafhængig CD4+ T celle delmængde specialiseret i at yde hjælp til germinal center (GC) udvikling og produktion af høj-affinitet antistoffer. I influenzavirusinfektion induceres robuste Tfh- og GC B-celleresponser for at lette effektiv virusudryddelse, hvilket giver en kvalificeret musemodel til Tfh-associeret undersøgelse. I dette papir beskrev vi protokoller til påvisning af grundlæggende Tfh-associeret immunrespons under influenzavirusinfektion hos mus. Disse protokoller omfatter: intranasal podning af influenzavirus; cytometribejdning og analyse af polyklonale og antigenspecifikke Tfh-celler, GC B-celler og plasmaceller påvisning af immunfluorescens i GC'er enzymrelateret immunosorbentanalyse (ELISA) af influenzavirusspecifikt antistof i serum. Disse assays dybest set kvantificere differentiering og funktion af Tfh celler i influenzavirus infektion, hvilket giver hjælp til undersøgelser i belyse differentiering mekanisme og manipulation strategi.
Introduction
I det seneste årti har adskillige undersøgelser været fokuseret på den nyligt identificerede CD4+ T celle delmængde, Tfh celle delmængde, for sine væsentlige roller i germinal center (GC) B udvikling. B celle lymfom 6 (Bcl6), som hovedsagelig betragtes som et gen repressor, er afstamning-definerende faktor Tfh celler for beviser for, at ektopisk udtryk for Bcl6 er tilstrækkelig til at drive Tfh differentiering, mens mangel på Bcl6 resulterer i forsvundet Tfh differentiering1,2,3. I modsætning til andre CD4+ T hjælper delmængder udfører deres effector funktion ved migration til de steder af inflammation, Tfh celler giver B-celle hjælp primært i B celle follikulær zone milt og lymfeknude. Co-stimulerende molekyler ICOS og CD40L, spiller en væsentlig rolle i samspillet mellem Tfh og GC B celler. Under Tfh differentiering, ICOS sender nødvendige signaler fra cognate B-celler og fungerer også som en receptor modtager migration signaler fra tilskuer B-celler til B cellezone lokalisering4,5. CD40L er en mediator af signaler fra Tfh celler til B-celler spredning og overlevelse6. En anden faktor, der spiller den lignende rolle som CD40L, er cytokinEN IL21, som hovedsageligt udskilles af Tfh-celler. IL21 regulerer direkte GC B-cellers udvikling og produktion af antistoffer med høj affinitet, men dets rolle i Tfh-differentiering er stadig kontroversiel7,8. PD-1 og CXCR5, som nu hyppigst anvendes til at identificere Tfh-celler i flowcytometrianalyse, spiller også en væsentlig rolle i differentieringen og funktionen af denne delmængde. CXCR5 er receptoren af B-celle follikulært kemokin og formidler lokaliseringen af Tfh-celler i B-cellesække9. PD-1 er nu identificeret til ikke kun at have follikulær vejledning funktion, men også sende kritiske signaler i processen med GC B celler affinitet modning10. Baseret på disse fund kunne evaluering af ekspressionen af disse molekyler dybest set afspejle modningen og funktionen af Tfh-celler.
GC er en induceret forbigående mikroanatomisk struktur i sekundære lymfoide organer og meget afhængig af Tfh-celler, hvilket er en perfekt udlæsning til at evaluere Tfh-respons. I GC, efter at have modtaget signaler medieret af cytokiner og co-stimulerende molekyler, er B-celler underlagt klasseskift og somatisk hypermutation for at generere antistoffer med høj affinitet11. Differential antistof klasseskift forekommer i differentialcytokin niche, hvor IL4 og IL21 fremkaldeR IgG1 klasseskift, mens IFNγ inducerer IgG2 klasseskift12. Plasmaceller er producenter af udskillede antistoffer og er uhelbredeligt differentierede celler. Ligesom Tfh celler, udvikling af B-celler i GC er forbundet med dynamisk udtryk for mange væsentlige molekyler. Baseret på den aktuelle undersøgelse kan GC B-celler identificeres som B220+PNA+Fas+ eller B220+GL7+Fas+ celler og plasmaceller sammenlignet med deres prækursorer, nedregulerer ekspressionen af B220 og opregulerer CD138-udtryk13. Desuden kan begge disse egenskaber påvises i flowcytometry- og immunfluorescensanalyse, hvilket er en passende evaluering af GC-respons.
Robust cellulære og humoristiske reaktioner er induceret i influenzavirus infektion, med Tfh og Th1 celler dominerer CD4+ T cellerespons14, hvilket gør det til en perfekt model for Tfh celler differentiering undersøgelse. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), som er en almindeligt anvendt musetilpasset stamme, anvendes ofte i denne undersøgelse14,15,16. Her beskriver vi nogle grundlæggende protokoller for Tfh-undersøgelsesrelevant analyse i influenzavirusinfektion: 1) intranasal podning af PR8-virus; 2) antigenspecifikke Tfh-celler, GC B- og plasmaceller og IL21-detektion med flowcytometri 3) histologisk visualisering af GC; 4) påvisning af antigenspecifik antistoftitler i serum med ELISA. Disse protokoller giver de nødvendige teknikker til nye forskere i Tfh-associeret undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Institut Pasteur i Shanghai, Kina. Alle forsøgene blev udført på grundlag af de institutionelle dyrepleje- og brugskomitégodkendte dyreprotokoller.
BEMÆRK: Virusinfektion hos mus og isolering af organer skal udføres under ABSL2-tilstand.
1. Podning af PR8-influenzavirus og registrering af muss vægt
- Forbered 8 uger gamle mandlige C57BL/6 mus til infektion på ABSL2 værelse.
BEMÆRK: Denne protokol er også velegnet til forsøg med hunmus. - Fortynding af PR8-virus: Tag viruset ud af fryseren -80 °C og inkuber på is, indtil det smelter i væske. Bestanden virus grundigt og fortynde virus til 2 PFU/μL med steril fosfat-buffered saltvand (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) i en forkølet 1,5 mL rør.
-
Musbedøvelse: Vej hver mus og beregn det volumen (4 gange (μL) musens vægt (g)) af natriumpentobarbital (2 mg/mL), der skal anvendes. Det beregnede volumen af natriumpentobarbital intraperitonealt indsprøjtes.
BEMÆRK: Dette trin er at få mus til at trække vejret stabilt og fredeligt, så nøjagtig titer af virus kan vaccineres intranasalt. For hurtige eller langsomme hjerteslag indikerer upassende bedøvelse. Derudover anbefales det at bruge dyrlægesstoffet for at undgå øjentørhed. - Intranasal podning: vortex den fortyndede PR8 virus grundigt. Rør 10 μL og udfør forsigtigt intranasal podning på den ene side dråbe for dråbe. Efter endt podning af alle mus i et bur (højst 5 mus) på denne side, gentag podning på den anden side (hold vejrtrækningen af musen fredelig og stabil gennem hele podning). Hver mus er inficeret med 40 PFU af PR8 virus i alt.
- Placer musene i sternal recumbency i varme bure for bedre genoplivning.
- Overvåg musens vægt dagligt i 10 dage. (Infektionsdagen registreres som Dag 0).
2. Isolering af lymfocytter fra milt og mediastinal lymfeknude (mLN)
- Museaflivning: Sæt musene i et lille kammer og aflive musene ved at pumpe ind i CO2 fredeligt fra bunden af kammeret. Tag mus ud, når de ikke bevæger sig og udfører cervikal dislokation for at sikre, at mus dør helt. Dyp musene med 75% ethanol og overfør til biosikkerhedshætten.
- Immobiliser musene med dissektionsnåle på den absorberende papirdækkede dissektionsskumplade. Skær huden langs abdominal midterlinjen og bagbenene med dissektion saks og strække huden med pincet. Immobiliser den strakte hud med dissektionsnåle.
- Forbered to 6 cm retter til hver mus og hold dem på isen. Sæt en 70-μm celle si i hver skål og tilsæt 5 mL DMEM suppleret med 1% føtal kvæg serum (DMEM (1% FBS))
- Miltisolering: Skær bughinden for at udsætte bughulen med dissektionssaks. Tag milten og læg den i den forberedte skål.
- mLN isolation: skær mellemgulvet og bunden af buret ribben til nærheden af thymus. Træk ribbenet til side og pin det med dissektion nåle til at afsløre brysthulen. Træk lungen til side til højre side og bruge pincet til at tage mLN, under hjertet og i nærheden af ventral side af luftrøret.
- Sæt mLN i den forberedte skål.
- Anskaf enkeltcelleaffjedringerne: Milten eller mLN'en skal forsigtigt maskeres med et stempel på 3 mL sprøjte gennem 70-μm cellesien. Cellesien skylles med 1 mL frisk DMEM (1% FBS). Genbrug celleaffjedringen og overfør til et 15 mL centrifugerør.
- Celleaffjedringen centrifuges ved 350 x g i 6 min. ved 4 °C. Fjern supernatant og tilsæt 1 mL DMEM (1% FBS).
- Resuspend celle pellet med 1 mL-pipette grundigt. Tilsæt 4 mL DMEM (1% FBS) i miltcelleaffjedring og hold dem på is til følgende operationer.
BEMÆRK: Det er nødvendigt at genbruge cellepillen med 1 mL medium først, ikke 5 mL, til fuldstændig isolering af enkelte celler fra pellet.
Fra dette trin og fremefter kan alle operationer udføres i det almindelige laboratorium. -
Spleen celleoptælling
- Resuspend celler ved at dreje rørene op og ned i flere gange. Der hældes 10 μL i 90 μL lysis buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 155mM NH4Cl). Inkuber ved stuetemperatur (RT) i 3 min og tilsæt 900 μL kold PBS for at afslutte reaktionen.
- Centrifuge ved 400 x g i 6 min ved 4 °C og fjern supernatant. Resuspend med 100 μL kold PBS. Der hældes 10 μL celler i 10 μL på 0,4% w/v trypanblå og tages 10 μL ud af blandingen til celletælling med hæmocytometeret.
- Beregning: Beregn celler som almindelig metode. Kort sagt, tælle cellenumre i to diagonale hjørne firkanter på hæmocytometeret og få N1, N2 for hvert hjørne firkantet. Cellekoncentrationen af 5-mL celleophænget skal beregnes som (N1+N2)/2 x 104 /mL.
3. Immunostaining af polyklonale Tfh-celler med PD-1 og CXCR5
- Farvning med biotin-anti-CXCR5 antistof.
- Resuspend celle suspensioner ved at dreje røret op og ned. Tag 2 x 106 celler ind i FACS-røret og tilsæt 2 mL farvningsbuffer (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). Vask ved hvirvelstrøm på hvirvelsvingningsenheden.
- Centrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C. Kassér supernatanten ved at hælde væsken ud og dyppe rørmunden på det absorberende papir to gange.
- Løsn cellepillen med restvæsken ved at trykke på bunden af røret. Sæt røret i rørholderen på is.
BEMÆRK: Mængden af restvæske er ca. 25 μL. - Der tilsættes 0,2 μL antimus-CD16/CD32 (Fc-receptor blocker) for hvert rør. Vortex ved at trykke på røret bunden forsigtigt og inkubere på is i 10 min.
BEMÆRK: Forbered antistofblanding til flere prøver ved fortynding med 5μL farvningsbuffer for hvert rør. Opskriften på blanding skal fremstilles ved fortynding (n/10+1) x 0,2 μL Fc-receptorblokker i (n/10+1) x 5 μL farvningsbuffer og tilsættes 5,2 μL blanding i hvert rør. - Der tilsættes 0,3 μL biotin-antimus CXCR5 i restkoncentrationen 30 μL farvningsbuffer for hvert rør og hvirvelstrøm ved at trykke på rørbunden.
BEMÆRK: Forbered blandingen som beskrevet i trin 3.1.4. - Inkuber på is i 1 time med forsigtigt genanvendelige celler ved at trykke på røret ved 30 min.
BEMÆRK: Vortex på 30 min er at undgå celle aggregater for bedre farvning. - Der tilsættes 2 mL farvningsbuffer og hvirvelstrøm på hvirvelsvingningsenheden. Centrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C og kassér supernatanten som beskrevet i trin 3.1.2. Vortex ved at trykke på røret og inkubere på is til efterfølgende farvning.
- Farvning med andre overflademarkører.
- Antistofblandingen (tabel 1) fremstilles som beskrevet i trin 3.1.4.
- Tilsæt antistofblanding i hvert rør. Vortex ved at trykke på røret bunden og inkubere på is i 30 min.
- Vask celler med 2 mL farvningsbuffer. Centrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C.
- Supernatanten kasseres, og der tilsættes 400 μL farvningsbuffer. Vortex røret på vortex oscillation enhed og holde røret i mørke indtil flow cytometry analyse.
4. Immunostaining af PR8 influenzavirus NP-specifikke Tfh-celler
BEMÆRK: Denne protokol til farvning af NP-specifikke Tfh-celler er fra tidligere undersøgelser15,17.
- Der udføres biotin-CXCR5-farvning som beskrevet i trin 3.1, bortset fra at det cellenummer, der er taget til farvning, er 3 x 106 for tilstrækkeligt antigenspecifikke celler til at blive registreret i flowcytometry.
- Der tilsættes 0,3 μL APC-konjugeret-IAbNP311-325 MHC klasse II (NP311-325) tetramer i røret fra 3.1.7. Forbered blanding til flere prøver som i trin 3.1.4
BEMÆRK: Det er vigtigt at plette tetramer før tilsætning af anti-CD4 antistof, da bindingen mellem CD4 og anti-CD4 antistof ville forstyrre den optimale tetramer farvning. - Genbrug celleblandingen ved forsigtigt at trykke på røret og inkubere i mørke ved RT i 30 minutter.
BEMÆRK: Dæk et vådt papir på rørenes mund for at mindske fordampningen - Blandingen af andre overflademarkører (tabel 1) tilsættes, og inkubationen fortsættes ved RT i 30 min.
- Celler, der vaskes og genbruges som beskrevet i trin 3.2.3 og 3.2.4.
5. Immunostaining af Bcl6 i polyklonale Tfh-celler
- Udfør overflademarkører (tabel 2) farvning som beskrevet i punkt 3, bortset fra at den sidste vask med 2 mL PBS i stedet for farvningsbuffer.
- Centrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C. Kassér supernatanten og genbrugte cellepiller ved forsigtigt at trykke på rørets bund.
- Der tilsættes 300 μL 3,7% formaldehydopløsning (fortyndet fra 37% formaldehyd med PBS) i røret til cellefiksering. Vortex på vortex svingning enhed og inkubere på RT i 20 min.
- Der tilsættes 2 mL farvningsbuffer til vask og centrifuge ved 500 x g i 6 min ved 4 °C. Kassér supernatanten og genbrugte celler ved forsigtigt at trykke på røret.
- Tilsæt 300 μL på 0,2% Triton-X 100 og resuspend celler ved vortex på vortex svingningsenheden. Inkuber på RT i 15 min.
- Der tilsættes 2 mL farvningsbuffer til vask. Centrifuge ved 500 x g i 6 min ved 4 °C. Kassér supernatant og resuspend celler ved forsigtigt at trykke på røret bunden.
- Der tilsættes 1,5 μL PE-anti-Bcl6-antistof for hvert rør. Bank forsigtigt på rørets bund for at genbruge blandingen og inkuberes ved RT i 2 timer med forsigtigt at trykke på røret hvert 30. minut.
BEMÆRK: Dæk et vådt papir på munden af rør for at mindske blandingens fordampning. - Der tilsættes 2 mL PBS suppleret med 0,01% Triton-X 100 i røret. Hvirvelstrøm og centrifuge ved 500 x g i 6 min ved 4 °C.
- Gentag vask som trin 5.8. Genanvendelige celler med 400 μL farvningsbuffer. Hold cellerne i mørke på isen indtil flowcytometrianalysen.
6. Intracellulær farvning af IL21
- Stimulere celler med PMA (phorbol 12-myristate 13-acetat) og ionomycin.
- Tag 2 x 106 celler fra miltcelleaffjedring og centrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C. Supernatanten kasseres, og cellepillen genbruges med 500 μL komplet T-cellemedium. Overfør cellerne til 24-brøndspladen.
- Der tilsættes 20 nmol PMA og 2 μmol ionomycin til 500 μL komplet medium18 og blandes grundigt ved at pipette op og ned.
- Der tilsættes en opløsning, der er fremstillet i trin 6.2, i celleophænget i 24-brøndspladen og blandes ved at ryste pladen. Konfigurer det ikke-formulerede kontrolelement ved at tilføje 500 μL komplet T-cellemedium uden tilsætning af PMA og ionomycin i cellerne. Inkuber i en CO2-inkubator ved 37°C i 4 timer.
- Der tilsættes 10 μmol BFA (Brefeldin A, opløst med methanol) i hver brønd for at blokere Golgi-apparatets medierede proteintransport. Sæt pladen tilbage til celleinkubatoren og inkubat i 2 timer.
- Udfør farvning af celleoverflademarkør.
- Resuspend celler ved forsigtigt pipetter op og ned og overføre cellerne i en FACS rør. Der tilsættes 1 mL farvningsbuffer i røret og centrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C.
- Udfør fc-receptor blocker farvning som trin 3.1.4.
- Der udføres celleoverflademarkeringer , der pletter (tabel 3) som beskrevet i trin 3.2.1 til 3.2.3, undtagen vaskeceller med 2 mL PBS.
- Centrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C. Kassér supernatanten og genbrugte celler ved at trykke på rørets bund.
- Der tilsættes 0,2 μL reagens fra Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell-farvningssættet, og røret inkuberes i mørke ved RT i 10 minutter for at udføre farvning af døde celler.
- Der tilsættes 2 mL PBS i røret og hvirvlen på hvirvelsvingningsenheden. Centrifuge ved 350 x g i 6 min ved 4 °C og kassér supernatanten.
- Udfør cellerettelsen som beskrevet i trin 5.3 og 5.4.
- Der tilsættes 300 μL farvningsbuffer for at genbruge cellerne og opbevare rørene i køleskabet på 4 °C natten over. Centrifuge ved 500 x g i 6 min ved 4 °C for at fjerne supernatanten.
BEMÆRK: Dette trin kan udelades og fortsætte til trin 6.7 direkte efter trin 6.5. - Der tilsættes 1 mL saponinbuffer (farvningsbuffer suppleret med 0,2% (w/v) saponin) i røret og hvirvlen på hvirvelsvingningsenheden. Inkuber på is i 20 minutter for at udføre cellepermebilisering.
- Centrifuge ved 500 x g i 6 min ved 4 °C og kassér supernatant.
- Der tilsættes 0,5 μL af den menneskelige FC-IL21-receptor til hvert rør. Der fremstilles antistofblanding til flere som trin 3.1.4, bortset fra at der fortyndes antistof med saponinbuffer i stedet for farvningsbuffer.
- Inkuber ved RT i 1 time med forsigtigt at trykke på røret bunden for at genbruge celler på 30 min.
- Tilsæt 2 mL saponin buffer til at vaske celler og centrifuge ved 500 x g i 6 min. Kassér supernatant og gentag vask én gang.
- Der tilsættes 0,1 μL APC-anti-human Ig(H+L) i hvert rør. Forbered blandingen til flere prøver som trin 3.1.4 bortset fra at fortynde antistof med saponin buffer i stedet for farvning buffer.
- Prøverne inkuberes på is i 30 min. og vaskes som trin 6.11.
- Genanvendelige celler med 400 μL farvningsbuffer. Hold prøven i mørke på is, indtil flowcytometrianalysen.
7. GC B og plasmaceller farvning
- Tag celler og udfør anti-Fc-receptor antistof farvning som trin fra 3.1.1 til 3.1.4.
- Overflademarkørers farvning (tabel 4) udføres som trin fra 3.1.5 til 3.1.7, bortset fra at inkubationstiden er 30 min. i stedet for 1 time.
- Genanvendelige celler med 400 μL farvningsbuffer. Hold prøverne i mørke på isen indtil flowcytometrianalysen.
8. Isolering af serum fra blod
- På dag 14 efter infektion (d.p.i 14) indsamles blodet fra ansigtsåren, og blodprøverne opbevares i køleskab på 4 °C natten over.
BEMÆRK: Udfør blodopsamling ved ABSL2-tilstand, og fra dette trin og fremefter kan alle procedurer udføres i det almindelige laboratorium. - Blodet centrifuges ved 400 x g i 10 min ved 4 °C. Serummet isoleres omhyggeligt med 200 μL pipetten for at undgå forurening af røde celler. Aliquot i 3 rør for hver prøve og opbevar dem ved -80 °C.
9. Analyse af HA-specifik antistoftitler med ELISA
- Coat ELISA plader med 50 μL på 2 μg/mL HA proteinopløsning pr. brønd og inkuber dem i køleskabet på 4 °C natten over.
- Vask tre gange med 200 μL PBS-fortyndet 0,05% tween (PBST). Der tilsættes 100 μL PBST-fortyndet 5% skummetmælk i hver brønd og inkuberes ved RT i 2 timer for at blokere den ikke-specifikke binding.
- Serumfortynding og inkubation: 3% BSA fremstilles i PBS som fortyndingsbuffer. Fortynd serumet i fortyndingsbufferen som 1:50, 1:150, 1:450, ...... til 1:36450 (3 gange seriel fortynding anbefales). Der tilsættes 50 μL fortyndet serum til hver brønd og inkuberes i 4°C køleskabet natten over.
- Serummet kasseres, og brøndene vaskes hurtigt én gang ved at tilsætte 200 μL PBST til hver brønd (ryst det blødt, og kassér det derefter). Derefter vaskes pladerne langsomt på shaker med 200 μL PBST tre gange i 5 min hver.
- Der tilsættes 100 μL sekundært BISTOF med HRP-mærket for det samlede IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, fortyndet med PBST) og inkuberes ved RT i 1 time. Pladerne vaskes af PBST som beskrevet i 9.4.
- Tag lige stor mængde buffer A og buffer B (TMB) ud fra 4 °C-opbevaring, og varm op i mindst 30 minutter ved RT før brug. Bland A og B og tilsæt 100 μL TMB i hver brønd og inkuber dem i 10-30 minutter ved RT ved at ryste blødt.
BEMÆRK: Dette er en kort beskrivelse af TMB Substrat Reagens Set (BD, 555214) manual. - Pipette 100 μL på 2M H2SO4 ind i hver brønd for at afslutte reaktionen. Læs OD450-værdien via instrumentet.
- Dataanalyse: Få den endelige OD450-værdi ved at trække baggrundssignalet fra (OD450-værdien af tom brønd). Tegn kurven svarende til en antistofisotype for hver prøve med fortyndingsfaktoren på X-aksen og OD450-værdien på Y-aksen.
10. Histologi
- Isoler milterne ved d.p.i 10. Fastgør dem i 3,7% formaldehydopløsning i 1 time ved RT. Kassér fikseringsbufferen og vask med PBS i 5 minutter på shakeren i tre gange.
- Milten dehydreres i PBS (10% saccharose) ved 4°C i 1 time og dehydrerer dem derefter i PBS (30% saccharose) ved 4°C ved omrystning blødt, indtil milten synker til bunden af 15 mL røret.
- Tag de dehydrerede milt ud, indlejr dem i optimal skæretemperaturblanding og kryosectioned.
- Forkøl acetonen ved -20°C. Inkuber vævssektionerne med forkølet acetone i 10 minutter. Vask vævet med PBS tre gange.
- Gennemtræng vævssektionerne med PBS, der indeholder 0,2% Triton X-100 i 20 minutter, og vask dem tre gange med PBS.
- Bloker den ikke-specifikke binding med PBS, der indeholder 10% normalt gedeserum (blokeringsbuffer) i 1 time ved RT, og vask vævssektionerne med PBS én gang.
- Bloker den ikke-specifikke binding med STREPTAVIDIN/BIOTIN-blokeringssæt.
BEMÆRK: Lad ikke prøverne tørre fra dette trin og fremefter. - Farvning med primært antistof: Der tilsættes blokerende bufferfortyndet biotin-PNA (25 μg/mL) og rotte-antimus-IgD (2,5 μg/mL) forsigtigt på vævssektionerne. Vævssektionerne i det våde kammer inkuberes i 4 °C-fryseren natten over.
- Vask hurtigt vævssektionerne med PBST én gang. Vask hurtigt vævssektionerne i PBST med at ryste langsomt i 5 minutter. Gentag vask i tre gange.
- Fortynd Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) og Alexa Fluor 555-Goat-anti rotte IgG (1:500) antistoffer med blokering buffer og tilsæt dem på væv sektioner omhyggeligt
- Inkuber på RT i 1 time.
- Vask vævssektionerne som trin 10.8 og monter forsigtigt med forlængeopløsningen. Dæk vævet med coverslips omhyggeligt og hold dem i mørke ved 4 °C indtil konfokal analyse.
- Analyser størrelsen af GC-reaktionen ved at tælle GC-numrene pr. områdestørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering af mus sygelighed i influenzavirus infektion
Efter influenzavirusinfektion er mus mindre aktive og anorektiske på grund af sygdom, hvilket afspejles af alvorligt vægttab, et almindeligt anvendt symptom til at overvåge musens sygelighed19. Som vist i figur 1abegyndte PR8-virusinficerede mus at tabe sig på dag 6, nåede det højeste tabsniveau på dag 8 og vendte tilbage til det oprindelige niveau på dag 10. Som forventet blev vægttabet ikke observeret gennem hele perioden hos PBS-behandlede kontrolmus. For in vivo symptomer, virusinfektion fører til robuste lymfocytter ekspansion i dræning lymfeknude, mLN i dette tilfælde. Derfor blev der observeret betydeligt større størrelse af mLN'er hos PR8-virusinficerede mus end hos kontrolmus (Figur 1b). Tilsammen viste disse mus alle forventede symptomer og var kvalificeret til den efterfølgende Tfh-associerede immunresponsundersøgelse.
Påvisning af Tfh differentiering og funktionsrelaterede molekyler
For at analysere Tfh differentiering, mus blev ofret på dag 5, 7, 10 og 14 efter infektion og mLNs eller milt blev isoleret for flow cytometry analyse. Figur 2a og figur 2b viser Tfh-populationens gating-strategi, hvor Tfh er indhegnet som PD-1hi CXCR5hi-celler og ikke-Tfh som PD-1laveCXCR5-lavceller. Med denne gating strategi, kinetik Tfh differentiering under influenzavirus infektion blev analyseret. Som det fremgår af figur 2c, paraferede Tfh differentieringen på dag 5 og toppede på dag 10. Så vi tog prøver af dag 10 til yderligere analyse. Som det fremgår af figur 3a, blev der induceret robust Tfh-celledifferentiering hos influenzavirusinficerede mus sammenlignet med kontrolmus. For at analysere influenzavirusspecifikke Tfh-celler blev der tilsat fluorchrommærkede IAbNP311-325 MHC-klasse II-tetramere (NP311-325)i polyklonale Tfh-cellers farvningspanel (tabel 1). Både i mLN'er og milter fra influenzavirusinficerede mus blev NP311-325-specifikkeCD4+ T-celler signifikant induceret, og NP311-325-specifikkeTfh-celler kunne analyseres ved tilsætning af PD-1 og CXCR5 til analyse(Figur 3e). På grund af Bcl6's væsentlige roller i Tfh-differentieringen kan Bcl6+CXCR5+ celler også repræsentere Tfh-populationen. Konsekvent blev Tfh-celler, der var identificeret med denne strategi, også induceret robust (figur 3b). Vi analyserede yderligere udtryk for Bcl6 i Tfh- og ikke-Tfh-celler. Som vist i figur 3cangiver højere ekspression af Bcl6 i Tfh-celler end i ikke-Tfh-celler vellykket Bcl6-farvning. Med lignende strategi, ICOS, blev et andet Tfh-associeret molekyle også analyseret (Figur 3d). På grund af Tfh-cellernes specialiserede rolle i at yde hjælp til B-celler kunne analysen af udtrykket af IL21, som hovedsagelig udskilles af Tfh-celler og demonstreres for direkte at regulere B-cellers overlevelse og spredning, afsløre Tfh-cellers funktion til en vis grad. Som vist i figur 3f, intracellulær farvning af IL21 viste, at PR8-infektion induceret betydeligt højere produktion af denne cytokin, med unstimulated celler som gating kontrol. Tilsammen kunne disse assays afspejle grundlæggende oplysninger om Tfh differentiering og give indsigt i B celle-hjælp evne.
Påvisning af GC B- og plasmacellers udvikling og influenzavirusspecifikke antistoffer i serum
Tfh-cellernes hovedfunktion er at give B-cellehjælp i GCs, hvor antistofklasseskift og affinitetsmodning forekommer. Så GC B udvikling indirekte kunne afspejle differentiering og funktion af Tfh celler. GC B-celler kan gated som B220+PNA+Fas+ celler (Figur 2d). Gennem denne gating strategi, analyserede vi kinetik GC B celle respons og fandt, at GC B svar startede på dag 10 og fortsatte med at stige på dag 14 (Figur 2e). Sammenligningen mellem PR8-virusinficerede og kontrolmus viste, at robust GC B blev induceret både i mLN og milt efter influenzavirusinfektion, hvilket er i overensstemmelse med den inducerede Tfh-differentiering hos PRB-virusinficerede mus. Derudover giver Immunofluorescens farvning med IgD og PNA visualiserede billeder, der angiver induceret GC-reaktion (grønne områder) hos PR8-virusinficerede mus (Figur 4d). Plasmaceller, identificeret som IgDlavCD138+ celler (Figur 2d), blev også genereret i PR8 virus-inficerede mus (Figur 4b). Tidligere undersøgelser har vist, at IFNƳ og IL21 kunne udskilles fra både Th1- og Tfh-celler i virusinfektion og fremkalde IgG2- og IgG1-klasseskift, henholdsvis20. Figur 4c viser generering af influenzavirusspecifikt antistof ved ELISA-analyse af HA-specifik IgM, total IgG, IgG1, IgG2b og IgG2C. Sammen afspejler alle disse assays de Tfh-associerede B-celleresponser i influenzavirusinfektion.
Figur 1: Karakterisering af mus sygelighed. 8 uger gamle mandlige mus blev smittet med 40 PFU af PR8 influenzavirus ved intranasal podning. Mus blev vejet dagligt i 10 dage (a) og mLN'er blev isoleret på d.p.i 10 (b). Fejllinjerne i (a) repræsenterer middelværdien ± SD. n = 4 mus pr. gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Gating strategi Tfh celler og GC B celler. (a) Lymfocytter defineres af FSC-A og SSC-A, og cellesingler er indhegnet med FSC-A, FSC-H og SSC-A, SSC-W. (b) Efter indsnævring i CD4+ T-celler anvendes overflademarkører CD62L og CD444 til at skelne mellem de naive T-celler (CD44loCD62Lhi) og aktiverede T-celler (CD44hiCD62Llo). Polyklonale Tfh-celler kan gates fra aktiverede T-celler som PD-1hi CXCR5hi population, omvendt, ikke-Tfh celler som PD-1lavCXCR5lav. PR8-virusspecifikke Tfh-celler defineres som CD4+CD44+ NP311-325 tetramer+PD-1hi CXCR5hi celler. c,e) Kinetik af Tfh frekvens i aktiverede celler (c) og GC B frekvens i B220+ celler (e). (d) GC B-celler er indhegnet som B220+ PNA+FAS+ celler, og plasmaceller er IgD-CD138+ celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Analyse af Tfh-differentiering hos PR8-virusinficerede mus. Mus blev ofret på d.p.i 10 og mLNs og milt blev isoleret for Tfh differentiering analyse. (a) Tfh procent i mLN'er og milt i PR8-virusinficerede mus og PBS-behandlede mus (overpanelet). Statistikken over Tfh-celler (nederste panel). (b) Intracellulær farvning af Bcl6 i CD4+CD44hi T-celler (overpanelet). Statistikken over Bcl6+CXCR5+ celler (nederste panel). ( c) Bcl6- og (d) ICOS-udtryk i Tfh-celler (linjerøde) og ikke-Tfh-celler (massivt gråt). (e) Gating af NP311-325-specifikkeCD4+ T-celler i mLN'er og milt af PR8-virusinficerede og PBS-behandlede mus (venstre panel). Procentdelen af PR8-virusspecifikke Tfh-celler i mLN'er og milt (mellempanel). "Isotype" indikerer farvning med irrelevant tetramerkontrol. Statistikken over NP311-325-specifikkeCD4+ T-celler (højre panel). f) Intracellulær farvning af IL-21 i milt-CD4+ T-celler fra PR8-virusinficerede og PBS-behandlede mus, den unstimulation, der er vist som kontrol (venstre). Statistikken over IL-21 farvning (højre). **P < 0,01, ***P < 0,001 og **** P < 0,0001 (tosidet Student's t-test). Fejllinjerne repræsenterer middelværdien ± SD. n = 3 mus pr. gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Analyse af GC B-cellerelateret respons hos PR8-virusinficerede mus. Mus blev ofret på d.p.i 10 og mLN'er og milt blev isoleret til analyse. (a) Procentdelen af GC B-celler (øverste panel). Statistikken over GC B-celler (nederste panel). (b) Procentdelen af plasmaceller (øverste panel). Statistikken over plasmaceller (nederste panel). c) Kvantificering af PR8-virus HA-specifik IgG, IgM, IgG1, IgG2b og IgG2c i serum (d.p.i 14) af PR8-virusinficerede mus og PBS-behandlede mus. d) Confocal-mikroskopi af B-cellesække (IgD+, Rød) og GCs (PNA+, Green) i miltprøverne af PR8-virusinficerede mus og PBS-behandlede mus (d.p.i 10). *P < 0,5, **P < 0,01, og ***P < 0,001 (tosidet Student's t-test). Fejllinjerne repræsenterer middelværdien ± SD. n = 3 mus pr. gruppe. Klik her for at se en større version af dette tal.
| overflademarkør | fluorokrom | Klon | volumen pr. prøve(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | eVolve 605 | IM7 | 0.2 |
| CD62L | FITC | MEL-14 | 0.2 |
| Icos | BV421 | 7E.17G9 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidin | Pe | 0.2 |
Tabel 1: Overflademarkør (undtagen CXCR5) antistofpanel til farvning af Tfh-celler (PD-1hiCXCR5hi).
| overflademarkør | fluorokrom | Klon | volumen pr. prøve(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | IM7 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidin | BV421 | 0.5 |
Tabel 2: Overflademarkørantistoffer (undtagen CXCR5) til farvning af Bcl6 i Tfh-celler.
| overflademarkør | fluorokrom | Klon | volumen pr. prøve(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | IM7 | 0.2 |
Tabel 3: Overflademarkeringsantistofpanel til intracellulær farvning af IL21.
| overflademarkør | fluorokrom | Klon | volumen pr. prøve(ul) |
| B220 | Apc | RA3-6B2 | 0.2 |
| Igd | eFluor 450 | 11-26c | 0.2 |
| CD95 | PE/Cy7 | Jo2 | 0.3 |
| Pna | FITC | 0.3 | |
| CD138 | Pe | 281-2 | 0.2 |
Tabel 4: Overflademarkeringsantistofpanel til farvning af GC B- og plasma B-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af specialiserede roller i at give B-celle hjælp til at generere høj-affinitet antistoffer, Tfh celler er blevet grundigt undersøgt i mekanismerne for differentiering og manipulation til at give nye strategier for vaccine design. Influenzavirusinfektion fremkalder kraftige Tfh- og GC B-celler, hvilket er en passende model for dette forskningsområde. I dette papir beskrev vi protokoller for influenzavirusinfektion ved intranasal inokulering, evaluering af Tfh-associeret respons ved flowcytometry, immunfluorescens og ELISA. Disse assays vil lette påvisning af Tfh differentiering, GC B udvikling og influenza virus-specifikke antistoffer og hjælpe forskere udforske og identificere nye afgørende molekyler i immunresponset.
I undersøgelser med influenzavirus-inficerede mus modeller, vægttab er en almindeligt anvendt indikator for musen sygelighed. Den forventede vægtændring kinetik hos influenzavirusinficerede mus er som beskrevet i figur 1a, som afspejler det passende immunrespons, der fremkaldes hos musene. Der vil dog regelmæssigt forekomme unormale tilfælde, hvor musene mister deres vægt eller ikke viser nogen vægtfald gennem hele observationsperioden. Ifølge vores erfaringer ville disse mus for det meste bære unormal lavere eller højere immunrespons og dermed forstyrre eksperimentresultaterne. For at undgå sådanne variationer bør for det første mus, der anvendes i forsøget, være sex- og aldersmatchede for at sikre den samme reaktionsevne over for virus. Konsekvent virus titer for hver mus er også vigtigt21. Den virustiker, der bruges i denne protokol, er 40 PFU. Virustitleren, der fremkalder passende vægtændringskinetik i hvert laboratorium, kan dog være variabel på grund af inkonsekvensen i virustitlerevalueringsproceduren og de musestammer, der anvendes i forsøget. Så vi anbefaler titrering af virustiker til infektion er nødvendig før immunrespons-relevant undersøgelse.
I denne protokol identificerede vi Tfh-celler med ofte anvendte markører PD-1, CXCR5 og den væsentlige transskriberingsfaktor Bcl6. Selv om både PD-1hiCXCR5hi og Bcl6+CXCR5+ celler kunne betegnes som Tfh celler, de repræsenterer forskellige population og ikke har forløberen-afkom forholdet baseret på det faktum, at ikke alle PD-1hiCXCR5hi celler er Bcl6+ og ikke alle Bcl6+CXCR5hi celler er PD-1hiCXCR5hi. Denne fænotype kan forklares ved Bcl6-udtrykkets heterogenitet i Tfh-celler22. ICOS, et kritisk molekyle for både Tfh differentiering og migration bør også indgå i analysen af Tfh differentiering. Derudover bør andre funktionsrelaterede co-stimulatoriske molekyler, såsom OX40 og CD40L, også påvises for deres udtryksniveau, men ikke inkluderet i denne protokol. IL21 og IL4 er begge Tfh-udskilles cytokiner spille roller i at fremkalde IgG1 klasse skifte. Protokol til registrering af IL21-udtryk er beskrevet i dette papir. På grund af vanskelighederne med at detektering af IL4 i Tfh-celler blev il4-GFP-reportermus imidlertid anvendt i tidligere undersøgelser23. I denne protokol brugte vi også fluorochrom-mærkede NP-tetramere til at detektere NP311-325-specifikkeTfh-celler. Ikke desto mindre giver grænsen i mængden af NP311-325-specifikkeTfh-celler vanskeligheden ved yderligere analyse. Derfor er adoptivoverførselseksperiment af influenza hemagglutinin specifikke TCR transgene (Tg) CD4+ (TS-1) T-celler, som kunne isoleres fra TS-1 mus, en alternativ strategi til løsning af dette problem24.
Her identificerede vi GC B som B220+PNA+Fas+ celler i flow cytometri farvning. En alternativ markør kombination strategi for at definere GC B som GL7hiFashi celler bruges også i andre papirer14,16. Vi bruger også immunfluorescens til at visualisere GCs med kombination af anti-IgD og PNA. Heri kan tilsætning af CD3-antistof hjælpe med at visualisere Tfh-celler, hvilket gør det muligt at studere samspillet mellem disse to celletyper10.
Givet differentiering af Tfh celler er en multistage og multifaktoriel proces, yderligere analyse af andre væsentlige molekyler på flere tidspunkter er nødvendig for at belyse mere detaljeret mekanisme i Tfh differentiering. Derudover er parametre, der opdages her, også almindeligt anvendt i andre modeller18. Derfor, udover i influenzavirusinfektion, kan protokoller beskrevet her, især immunostainingdelen, også give instruktioner i Tfh-associeret undersøgelse med andre modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker stabe flow cytometry facilitet, ABSL2 facilitet og SPF dyrefacilitet institut Pasteur i Shanghai for deres tekniske hjælp og rådgivning. Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud: Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key R&D Program of China (2016YFA0502202), National Natural Science Foundation of China (31570886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
