Summary
Este artigo descreve protocolos de avaliação da resposta Tfh e GC B no modelo de camundongos de infecção por vírus influenza.
Abstract
As células T Follicular Helper (Tfh) são um subconjunto independente de células CD4+ T especializado em fornecer ajuda para o desenvolvimento do centro germinal (GC) e geração de anticorpos de alta afinidade. Na infecção pelo vírus da gripe, respostas robustas de células Tfh e GC B são induzidas para facilitar a erradicação eficaz do vírus, o que confere um modelo de camundongo qualificado para o estudo associado ao Tfh. Neste artigo, descrevemos protocolos na detecção de resposta imune básica associada ao Tfh durante a infecção pelo vírus da gripe em camundongos. Estes protocolos incluem: inoculação intranasal do vírus da gripe; coloração e análise da citometria de fluxo de células Tfh policlonais e antígenos, células GC B e células plasmáticas; detecção de imunofluorescência de GCs; ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) de anticorpo específico do vírus da influenza no soro. Esses ensaios basicamente quantificam a diferenciação e função das células Tfh na infecção pelo vírus da gripe, fornecendo ajuda para estudos em mecanismo de diferenciação e estratégia de manipulação.
Introduction
Na última década, inúmeros estudos foram focados no recém-identificado subconjunto de células CD4+ T, subconjunto de células Tfh, por suas funções essenciais no desenvolvimento do Centro Germinal (GC) B. Linfoma de célula B 6 (Bcl6), que é considerado principalmente como um repressor genético, é o fator definidor de linhagem das células Tfh para a evidência de que a expressão ectópica de Bcl6 é suficiente para impulsionar a diferenciação de Tfh enquanto a deficiência de Bcl6 resulta na diferenciação Tfh desaparecida1,2,3. Ao contrário de outros subconjuntos de ajuda CD4+ T que executam sua função de efeitos por migração para os locais de inflamação, as células Tfh fornecem ajuda da célula B principalmente na zona folicular de células B de baço e linfonodo. Moléculas co-estimulatórias ICOS e CD40L, desempenham papéis significativos na interação entre as células Tfh e GC B. Durante a diferenciação do Tfh, o ICOS transmite sinais necessários de células B coginadas e também atua como um receptor recebendo sinais de migração de células B espectadores para localização da zona de célula B4,5. CD40L é um mediador de sinais de células Tfh para proliferação e sobrevivência de células B6. Outro fator que desempenha o papel semelhante ao CD40L é o citocina IL21, que é principalmente secretado por células Tfh. O IL21 regula diretamente o desenvolvimento e a produção de células GC B de anticorpos de alta afinidade, mas seu papel na diferenciação do Tfh ainda é controverso7,8. PD-1 e CXCR5, que agora são mais utilizados na identificação de células Tfh na análise de citometria de fluxo, também desempenham papéis significativos na diferenciação e função deste subconjunto. CXCR5 é o receptor de quimiocina folicular de células B e media a localização de células Tfh em folículos de células B9. O PD-1 agora é identificado para não só ter a função de orientação folicular, mas também transmitir sinais críticos no processo de maturação de afinidade de afinidade de células GC B10. Com base nesses achados, avaliar a expressão dessas moléculas poderia basicamente refletir a maturação e função das células Tfh.
GC é uma estrutura microanatomical transitória induzida em órgãos linfoides secundários e altamente dependente das células Tfh, sendo assim uma leitura perfeita para avaliar a resposta Tfh. Em GC, após receber sinais mediados por citocinas e moléculas co-estimulantes, as células B estão sujeitas a troca de classe e hipermutação somática para gerar anticorpos de alta afinidade11. A troca diferencial da classe anticorpo ocorre no nicho diferencial de citocina, no qual il4 e IL21 induzem a troca de classe IgG1 enquanto IFNγ induz a comutação da classe IgG212. As células plasmáticas são os produtores de anticorpos secretos e são células terminais diferenciadas. Como as células Tfh, o desenvolvimento de células B em GC está associado à expressão dinâmica de muitas moléculas significativas. Com base no presente estudo, as células GC B podem ser identificadas como B220+PNA+Fas+ ou B220+GL7+Células Fas+ e células plasmáticas, em comparação com seus precursores, expressão de baixa regulação de B220 e expressão CD13813. Além disso, ambas as características podem ser detectadas na análise de citometria de fluxo e imunofluorescência, sendo assim a avaliação adequada da resposta gc.
Respostas celulares robustas e humorais são induzidas na infecção pelo vírus da gripe, com células Tfh e Th1 dominando a resposta celular CD4+ T14,o que o torna um modelo perfeito para o estudo de diferenciação de células Tfh. Influenza A/Porto Rico/8/34 H1N1(PR8), que é uma cepa comumente usada adaptado ao rato, é frequentemente utilizada neste estudo14,15,16. Aqui, descrevemos alguns protocolos básicos do ensaio relevante do estudo Tfh na infecção pelo vírus da gripe: 1) inoculação intranasal do vírus PR8; 2) células Tfh específicas de antígeno, células GC B e plasma e detecção de IL21 com citometria de fluxo; 3) visualização histológica de GC; 4) detecção de titulação de anticorpos específicas de antígeno em soro com ELISA. Esses protocolos fornecem as técnicas necessárias para novos pesquisadores no estudo associado ao Tfh.
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Protocol
Os experimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Institut Pasteur de Xangai, China. Todos os experimentos foram realizados com base nos protocolos de animais aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.
NOTA: A infecção por vírus de camundongos e o isolamento de órgãos devem ser realizadas sob a condição DE ABSL2.
1. Inoculação do vírus da influenza PR8 e registro do peso dos camundongos
- Prepare camundongos C57BL/6 masculinos de 8 semanas para infecção na sala ABSL2.
NOTA: Este protocolo também é adequado em experimentos com camundongos fêmeas. - Diluição do vírus PR8: retire o vírus do congelador -80 °C e incuba no gelo até derreter em líquido. Vortex o vírus de estoque completamente e dilui o vírus para 2 PFU/μL com soro fisiológico estéril tamponado de fosfato (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) em um tubo pré-refrigerado de 1,5 mL.
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Anesthetização de camundongos: pese cada rato e calcule o volume (4 vezes (μL) do peso do rato (g)) de pentobarbital de sódio (2 mg/mL) a ser utilizado. Injete o volume calculado de sódio pentobarbital intraperitoneal.
NOTA: Este passo é fazer com que os ratos respirem de forma constante e pacífica, para que o titulação preciso do vírus possa ser inoculado intranasamente. Batimentos cardíacos muito rápidos ou lentos indicam anestesia inadequada. Além disso, recomenda-se o uso de pomada veterinária para evitar o ressecamento dos olhos. - Inoculação intranasal: vórtice do vírus PR8 diluído completamente. Pipet 10 μL e realizar cuidadosamente a inoculação intranasal em um lado gota a gota. Depois de terminar a inoculação de todos os camundongos em uma gaiola (máximo 5 ratos) deste lado, repita a inoculação do outro lado (mantenha a respiração do rato pacífica e estável durante toda a inoculação). Cada camundongo está infectado com 40 PFU de vírus PR8 no total.
- Coloque os ratos em recumedência severa em gaiolas quentes para melhor reavivamento.
- Monitore o peso do mouse diariamente por 10 dias. (O dia da infecção é registrado como dia 0).
2. Isolamento de linfócitos de baço e linfonodo mediastinal (mLN)
- Eutanásia de rato: coloque os ratos em uma pequena câmara e eutanize os ratos bombeando para o CO2 pacificamente a partir do fundo da câmara. Leve os ratos para fora quando eles não se movem e realize a luxação cervical para garantir que os ratos morram completamente. Mergulhe os camundongos com 75% de etanol e transfira para o capô da biossegurança.
- Imobilize os camundongos com agulhas de dissecção na placa de espuma de dissecção absortória coberta de papel. Corte a pele ao longo da linha abdominal e as patas traseiras com uma tesoura de dissecção e estique a pele com pinças. Imobilize a pele esticada com agulhas de dissecção.
- Prepare dois pratos de 6 cm para cada rato e mantenha-os no gelo. Coloque um coador de células de 70 μm em cada prato e adicione 5 mL de DMEM suplementado com 1% de soro bovino fetal (DMEM (1% FBS))
- Isolamento do baço: corte o peritônio para expor a cavidade abdominal com uma tesoura de dissecção. Pegue o baço e coloque-o no prato preparado.
- isolamento mLN: corte o diafragma e o fundo da costela da gaiola até as proximidades do timo. Puxe a costela de lado e fixe-a com agulhas de dissecção para expor a cavidade torácica. Puxe o pulmão para o lado direito e use pinças para tomar mLN, sob o coração e perto do lado ventral da traqueia.
- Coloque o mLN no prato preparado.
- Obtenha as suspensões de célula única: misture o baço ou mLN suavemente com um êmbolo de 3 mL de seringa através do coador de células de 70 μm. Enxágüe o coador celular com 1 mL de DMEM fresco (1% FBS). Resuspengue a suspensão da célula e transfira para um tubo de centrífuga de 15 mL.
- Centrifugar a suspensão da célula a 350 x g por 6 min a 4 °C. Remova o supernasce e adicione 1 mL de DMEM (1% FBS).
- Resuspenda a pelota celular com 1 mL-pipeta completamente. Adicione 4 mL de DMEM (1% FBS) em suspensões de células de baço e mantenha-as no gelo para as seguintes operações.
NOTA: É necessário resuspensar a pelota celular com 1 mL de médio em primeiro lugar, não 5 mL, para isolar completamente as células únicas da pelota.
A partir deste passo, todas as operações podem ser realizadas no laboratório regular. -
Contagem de células de baço
- Resuspend células girando os tubos para cima e para baixo por várias vezes. Leve 10 μL em 90 μL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 155mM NH4Cl). Incubar à temperatura ambiente (RT) por 3 min e adicionar 900 μL de PBS frio para terminar a reação.
- Centrifugar a 400 x g por 6 min a 4 °C e remover supernadante. Resuspend com 100 μL de PBS frio. Leve 10 μL de células em 10 μL de 0,4% w/v trypan azul e tire 10 μL da mistura para contagem celular com o hemócito.
- Cálculo: calcular células como método regular. Resumindo, conte números de células em dois quadrados de canto diagonal no hemócito e obtenha N1, N2 para cada quadrado de canto. A concentração celular da suspensão celular de 5 mL deve ser calculada como (N1+N2)/2 x 104 /mL.
3. Imunostaining de células Tfh Policlonal com PD-1 e CXCR5
- Manchando com anticorpo biotina-anti-CXCR5.
- Resuspend suspensões celulares girando o tubo para cima e para baixo. Leve 2 x 106 células para o tubo FACS e adicione 2 mL de tampão de coloração (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). Lave por vórtice no dispositivo de oscilação do vórtice.
- Centrifugar a 350 x g para 6 min a 4 °C. Descarte o supernatante derramando o líquido e mergulhe a boca do tubo no papel absorvente duas vezes.
- Solte a pelota celular com o líquido de resíduo tocando o fundo do tubo. Coloque o tubo no suporte do tubo no gelo.
NOTA: O volume de líquido de resíduo é de aproximadamente 25 μL. - Adicione 0,2 μL de CD16/CD32 anti-mouse (bloqueador de receptor de fc) para cada tubo. Vórtice tocando o fundo do tubo suavemente e incubando no gelo por 10 minutos.
NOTA: Prepare a mistura de anticorpos para várias amostras por diluição com 5μL de tampão de coloração para cada tubo. A receita para a mistura deve ser preparada por diluir (n/10+1) x 0,2 μL Bloqueador de receptor de fc em (n/10+1) x 5 μL tampão de coloração e adicionar 5,2 μL de mistura em cada tubo. - Adicione 0,3 μL de biotina-anti-rato CXCR5 no resíduo 30 μL de tampão de coloração para cada tubo e vórtice tocando no fundo do tubo.
NOTA: Prepare a mistura conforme descrito na etapa 3.1.4. - Incubar no gelo por 1h com células de resusu de si suavemente, tocando o tubo a 30 min.
NOTA: O vórtice a 30 min é para evitar agregados celulares para melhor coloração. - Adicione 2 mL de tampão de coloração e vórtice no dispositivo de oscilação do vórtice. Centrifugar a 350 x g por 6 min a 4 °C e descartar o supernaspeso como descrito na etapa 3.1.2. Vórtice tocando o tubo e incubando no gelo para posterior coloração.
- Manchando com outros marcadores de superfície.
- Prepare a mistura de anticorpos(Tabela 1)conforme descrito na etapa 3.1.4.
- Adicione mistura de anticorpos em cada tubo. Vórtice tocando o fundo do tubo e incubando no gelo por 30 minutos.
- Lave as células com 2 mL de tampão de coloração. Centrifugar a 350 x g para 6 min a 4 °C.
- Descarte o supernatante e adicione 400 μL de tampão de coloração. Vórtice o tubo no dispositivo de oscilação do vórtice e manter o tubo no escuro até a análise da citometria de fluxo.
4. Imunostaining de células Tfh específicas do vírus da influenza PR8
NOTA: Este protocolo de coloração de células Tfh específicas do PN é de estudos anteriores15,17.
- Realize a coloração biotina-CXCR5 conforme descrito na etapa 3.1, exceto que o número de células tomadas para coloração é 3 x 106 para que células específicas de antígeno suficientes sejam registradas na citometria de fluxo.
- Adicione 0,3 μL de APC-conjugado-IAbNP311-325 MHC classe II (NP311-325) tetramer no tubo de 3.1.7. Prepare a mistura para várias amostras como na etapa 3.1.4
NOTA: É importante colorição de tetramer antes da adição de anticorpo anti-CD4, pois a ligação entre o anticorpo CD4 e anti-CD4 interferiria na coloração ótima do tetramer. - Resuspenque a mistura celular tocando suavemente o tubo e incubar no escuro em RT por 30 minutos.
NOTA: Cubra um papel molhado na boca dos tubos para diminuir a evaporação - Adicione a mistura de outros marcadores de superfície(Tabela 1) e continue a incubação em RT por 30 minutos.
- Lavar e resuspendar células conforme descrito nas etapas 3.2.3 e 3.2.4.
5. Imunostaining de Bcl6 em células Tfh policlonais
- Executar marcadores de superfície(Tabela 2) manchas conforme descrito na seção 3, exceto que a última lavagem com 2 mL de PBS, em vez de tampão de coloração.
- Centrifugar a 350 x g para 6 min a 4 °C. Descarte as pelotas de células supernascidas e resuspendas tocando suavemente o fundo do tubo.
- Adicione 300 μL de solução de formaldeído de 3,7% (diluída de 37% de formaldeído com PBS) no tubo para fixação celular. Vórtice no dispositivo de oscilação do vórtice e incubar em RT por 20 minutos.
- Adicione 2 mL de tampão de coloração para lavagem e centrífuga a 500 x g por 6 min a 4 °C. Descarte as células supernascidas e resuspendas tocando suavemente o tubo.
- Adicione 300 μL de 0,2% Triton-X 100 e células resusgasinas por vórtice no dispositivo de oscilação do vórtice. Incubar na RT por 15 minutos.
- Adicione 2 mL de tampão de coloração para lavagem. Centrifugar a 500 x g para 6 min a 4 °C. Descarte células supernascidas e resuspendas tocando suavemente o fundo do tubo.
- Adicione 1,5 μL de anticorpo PE-anti-Bcl6 para cada tubo. Bata suavemente o fundo do tubo para resuspensar a mistura e incubar no RT por 2h com tocar suavemente o tubo a cada 30 minutos.
NOTA: Cubra um papel molhado na boca dos tubos para diminuir a evaporação da mistura. - Adicione 2 mL de PBS suplementado com 0,01% Triton-X 100 no tubo. Vórtice e centrífuga a 500 x g por 6 min a 4 °C.
- Repita a lavagem como passo 5.8. Células resuspendas com 400 μL de tampão de coloração. Mantenha as células no gelo até a análise da citometria de fluxo.
6. Coloração intracelular de IL21
- Estimular células com PMA (phorbol 12-myristate 13-acetato) e ionomicina.
- Pegue 2 x 106 células de suspensão de células esplênicas e centrífuga a 350 x g por 6 min a 4 °C. Descarte a pelota de célula supernascida e resuspend com 500 μL de meio de célula T completa. Transfira as células para a placa de 24 poços.
- Adicione 20 nmol PMA e 2 μmol ionomicina em 500 μL de meio completo18 e misture bem por pipetar para cima e para baixo.
- Adicione a solução preparada na etapa 6.2 na suspensão celular na placa de 24 poços e misture sacudindo a placa. Configure o controle não estimulado adicionando 500 μL meio de célula T completo sem adição de PMA e ionomicina nas células. Incubar em uma incubadora de CO2 a 37°C por 4 h.
- Adicione 10 μmol BFA (Brefeldin A, dissolvido com metanol) em cada poço para bloquear o transporte de proteína mediada do aparelho Golgi. Coloque a placa de volta na incubadora celular e incubar por 2h.
- Executar a coloração do marcador de superfície celular.
- Resuspend células por tubos suavemente para cima e para baixo e transferir as células para um tubo FACS. Adicione 1 mL de tampão de coloração no tubo e centrífuga a 350 x g por 6 min a 4 °C.
- Execute a coloração do bloqueador de receptores fc como etapa 3.1.4.
- Realizar a coloração dos marcadores de superfície celular(Tabela 3)conforme descrito nas etapas 3.2.1 a 3.2.3 exceto células de lavagem com 2 mL de PBS.
- Centrifugar a 350 x g para 6 min a 4 °C. Descarte as células supernascidas e resuspendas tocando o fundo do tubo.
- Adicione 0,2 μL de reagente do kit de coloração aqua dead cell vivo/morto e incubar o tubo no escuro em RT por 10 minutos para realizar a coloração de células mortas.
- Adicione 2 mL de PBS no tubo e vórtice no dispositivo de oscilação do vórtice. Centrifugar a 350 x g por 6 min a 4 °C e descartar o supernaspe.
- Realize a fixação celular conforme descrito nas etapas 5.3 e 5.4.
- Adicione 300 μL de tampão de coloração para resuspendular as células e armazene os tubos na geladeira de 4 °C durante a noite. Centrifugar a 500 x g por 6 min a 4 °C para remover o supernaspe.
NOTA: Esta etapa pode ser omitida e continuar a passo 6.7 diretamente após a etapa 6.5. - Adicione 1 mL de tampão de saponina (tampão de coloração suplementado com saponina de 0,2%(w/v) no tubo e vórtice no dispositivo de oscilação do vórtice. Incubar no gelo por 20 minutos para realizar a permeabilização celular.
- Centrifugar a 500 x g por 6 min a 4 °C e descartar supernadante.
- Adicione 0,5 μL de receptor fc-IL21 humano em cada tubo. Prepare a mistura de anticorpos para múltiplos como etapa 3.1.4 exceto que diluir anticorpo com tampão de saponina em vez de tampão de coloração.
- Incubar em RT por 1h com tocar suavemente o fundo do tubo para resuspend células a 30 min.
- Adicione 2 mL de tampão de saponina para lavar células e centrífuga a 500 x g por 6 min. Descarte o supernaspeito e repita a lavagem uma vez.
- Adicione 0,1 μL de Ig anti-humano APC(H+L) em cada tubo. Prepare a mistura para várias amostras como etapa 3.1.4 exceto que o anticorpo diluído com tampão de saponina em vez de tampão de coloração.
- Incubar as amostras no gelo por 30 minutos e lavar como etapa 6.11.
- Células resuspendas com 400 μL de tampão de coloração. Mantenha a amostra no escuro no gelo até a análise da citometria de fluxo.
7. GC B e células plasmáticas colorindo
- Pegue as células e realize a coloração de anticorpos anti-Receptor como passos de 3.1.1 para 3.1.4.
- Realizar a coloração dos marcadores de superfície(Tabela 4) como passos de 3.1.5 para 3.1.7 exceto que o tempo de incubação é de 30 minutos em vez de 1h.
- Células resuspendas com 400 μL de tampão de coloração. Mantenha as amostras no gelo até a análise da citometria de fluxo.
8. Isolamento do soro do sangue
- No dia 14 pós-infecção (d.p.i 14), coletar o sangue da veia facial e manter amostras de sangue em uma geladeira de 4 °C durante a noite.
NOTA: Realizar coleta de sangue na condição ABSL2 e a partir desta etapa todos os procedimentos poderiam ser realizados no laboratório regular. - Centrifugar o sangue a 400 x g por 10 min a 4 °C. Isole o soro com a pipeta de 200 μL cuidadosamente para evitar a poluição das células vermelhas. Alíquota em 3 tubos para cada amostra e armazene-os a -80°C.
9. Ensaio de titulante de anticorpos específicos ha com ELISA
- Cubra as placas ELISA com 50 μL de 2 μg/mL HA solução de proteína por poço e incuba-as na geladeira de 4 °C durante a noite.
- Lave três vezes com 200 μL de PBS diluído 0,05% de interpolação (PBST). Adicione 100 μL de leite diluído 5% em cada poço e incubar em RT por 2h para bloquear a ligação inespecífica.
- Diluição e incubação do soro: prepare 3% de BSA em PBS como tampão de diluição. Diluir o soro no tampão de diluição como 1:50, 1:150, 1:450, ...... a 1:36450 (recomenda-se diluição serial de 3 vezes). Adicione 50 μL de soro diluído a cada poço e incubar na geladeira de 4°C durante a noite.
- Descarte o soro e lave rapidamente os poços uma vez adicionando 200 μL de PBST em cada poço (agite-o suavemente, depois descarte). Em seguida, lave lentamente as placas no shaker com 200 μL de PBST três vezes por 5 minutos cada.
- Adicione 100 μL de anticorpo secundário rotulado hrp específico para IgG total, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c, IgG2c (1:5000, diluído com PBST) e incubar na RT por 1 h. Lave as placas pela PBST conforme descrito em 9.4.
- Retire o volume igual de Buffer A e Buffer B (TMB) a partir do armazenamento de 4 °C e aqueça por pelo menos 30 minutos no RT antes de usar. Misture A e B e adicione 100 μL de TMB em cada poço e incuba-os por 10-30 minutos no RT, tremendo suavemente.
NOTA: Esta é uma breve descrição do manual TMB Substrate Reagent Set (BD,555214). - Pipeta 100 μL de 2M H2SO4 em cada poço para terminar a reação. Leia o valor OD450 através do instrumento.
- Análise de Dados: obtenha o valor final de OD450 subtraindo o sinal de fundo (valor OD450 do poço vazio). Desenhe a curva correspondente a um isótipo de anticorpo de cada amostra com o fator de diluição no eixo X e o valor OD450 no eixo Y.
10. Histologia
- Isole os baços no D.P.I.10. Fixá-los em solução de formaldeído de 3,7% por 1h na RT. Descarte o tampão de fixação e lave com PBS por 5 minutos no shaker por três vezes.
- Desidratar os baços em PBS (10% de sacarose) a 4°C por 1h e depois desidratar-os em PBS (30% de sacarose) a 4°C com agitação suave até que os baços afundem até o fundo do tubo de 15 mL.
- Tire os baços desidratados, incorpore-os no composto de temperatura de corte ideal e criosectioned.
- Pré-esfrie a acetona a -20°C. Incubar as seções teciduais com acetona pré-refrigerada por 10 minutos. Lave o tecido com PBS por três vezes.
- Permeabilize as seções teciduais com PBS contendo 0,2% Triton X-100 por 20 min e lave-as por três vezes com PBS.
- Bloqueie a ligação não específica com PBS contendo soro de cabra 10% normal (tampão de bloqueio) por 1 h no RT e lave as seções de tecido com PBS uma vez.
- Bloqueie a ligação não específica com o kit de bloqueio STREPTAVIDIN/BIOTIN.
NOTA: Não deixe as amostras secarem a partir deste passo em diante. - Coloração com anticorpo primário: adicione o bloqueio de biotina-PNA diluído por buffer (25 μg/mL) e igD anti-rato de rato (2,5 μg/mL) nas seções teciduais cuidadosamente. Incubar as seções de tecido na câmara molhada no congelador de 4 °C durante a noite.
- Lave rapidamente as seções teciduais com PBST uma vez. Lave rapidamente as seções teciduais no PBST com agitação lenta por 5 minutos. Repita a lavagem por três vezes.
- Diluir alexa fluor 488-streptavidin (1:500) e Alexa Fluor 555-Cabra-anti rat IgG (1:500) anticorpos com tampão de bloqueio e adicioná-los nas seções teciduais cuidadosamente
- Incubar na RT por 1 h.
- Lave as seções teciduais como etapa 10.8 e monte cuidadosamente com a solução prolongar. Cubra o tecido com tampas e mantenha-os no escuro a 4°C até a análise confocal.
- Analise a magnitude da reação gc contando os números de GC por tamanho de área.
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Representative Results
Caracterização da morbidade do camundongo na infecção pelo vírus da gripe
Após a infecção pelo vírus da gripe, os camundongos são menos ativos e anoréxicos devido à doença, que se reflete na perda de peso grave, sintoma comumente utilizado para monitorar a morbidade do camundongo19. Como mostrado na Figura 1a , camundongos infectados pelo vírus PR8 começaram a perder peso no dia 6, atingiram o maior nível de perda no dia 8 e voltaram ao nível inicial no dia 10. Como esperado, a perda de peso não foi observada durante todo o período em camundongos de controle tratados com PBS. Para sintomas in vivo, a infecção por vírus leva à expansão robusta de linfócitos no linfonodo drenante, mLN neste caso. Portanto, foram observados tamanhos significativamente maiores de MLNs em camundongos infectados pelo vírus PR8 do que em camundongos de controle (Figura 1b). Juntos, todos esses camundongos apresentaram sintomas esperados e foram qualificados para o estudo subsequente de resposta imune associado ao Tfh.
Detecção de diferenciação Tfh e moléculas associadas à função
Para analisar a diferenciação do Tfh, os camundongos foram sacrificados nos dias 5, 7, 10 e 14 após infecção e mLNs ou baços foram isolados para análise de citometria de fluxo. Figura 2a e Figura 2b mostram a estratégia de gating populacional Tfh, com Tfh fechado como PD-1hi CXCR5hi cells e non-Tfh como PD-1baixasCXCR5células baixas. Com essa estratégia de gating, foram avaliadas a cinética da diferenciação de Tfh durante a infecção pelo vírus da gripe. Como mostrado na Figura 2c, diferenciação Tfh inicializada no dia 5 e atingiu o pico no dia 10. Então coletamos amostras do dia 10 para análise suplementar. Como mostrado na Figura 3a,a diferenciação robusta de células Tfh foi induzida em camundongos infectados pelo vírus da gripe em comparação com os camundongos de controle. Para analisar as células Tfh específicas do vírus influenza, as células Tfh com rótulo fluorocromo foramadicionadas no painel de coloração de células Tfh policlonais(Tabela 1). Tanto em mLNs quanto em baços de camundongos infectados pelo vírus da gripe, as células CD4+ T específicas do NP311-325foram significativamente induzidas e as células Tfh específicas do NP311-325poderiam ser analisadas por adição de células PD-1 e CXCR5 em análise(Figura 3e). Devido aos papéis essenciais do Bcl6 na diferenciação do Tfh, as células Bcl6+CXCR5+ também podem representar a população de Tfh. Consistentemente, as células Tfh identificadas com essa estratégia também foram induzidas robustamente(Figura 3b). Analisamos ainda a expressão de Bcl6 em células Tfh e não-Tfh. Como mostrado na Figura 3c, expressão mais alta de Bcl6 em células Tfh do que em células não-Tfh indica uma coloração bcl6 bem sucedida. Com estratégia semelhante, ICOS, outra molécula associada ao Tfh também foi analisada (Figura 3d). Devido ao papel especializado das células Tfh no fornecimento de ajuda para as células B, o ensaio da expressão de IL21, que é secretado principalmente pelas células Tfh e demonstrado para regular diretamente a sobrevivência e proliferação das células B, poderia revelar a função das células Tfh até certo ponto. Como mostrado na Figura 3f,a coloração intracelular do IL21 revelou que a infecção por PR8 induziu significativamente maior produção dessa citocina, com células não estimuladas como controle de gating. Juntos, esses ensaios poderiam refletir informações básicas da diferenciação do Tfh e fornecer os insights sobre a capacidade de ajuda celular B.
Detecção de GC B e desenvolvimento de células plasmáticas e anticorpos específicos do vírus da influenza no soro
A principal função das células Tfh é fornecer ajuda de células B em GCs, nos quais ocorrem a comutação de classe de anticorpos e a maturação da afinidade. Assim, o desenvolvimento do GC B poderia refletir indiretamente a diferenciação e a função das células Tfh. As células GC B poderiam ser fechadas como células B220+PNA+Fas+ (Figura 2d). Através dessa estratégia de gating, analisamos a cinética da resposta celular GC B e descobrimos que a resposta GC B começou no dia 10 e continuou a aumentar no dia 14 (Figura 2e). A comparação entre camundongos infectados pelo vírus PR8 e os camundongos de controle mostraram que o GC B robusto foi induzido tanto em mLN quanto no baço após a infecção pelo vírus da gripe(Figura 4a),que é consistente com a diferenciação induzida de Tfh em camundongos infectados pelo vírus PRB. Além disso, a coloração da imunofluorescência com IgD e PNA fornece imagens visualizadas indicando reação GC induzida (áreas verdes) em camundongos infectados pelo vírus PR8(Figura 4d). As células plasmáticas, identificadas como IgDlowCD138+ células(Figura 2d),também foram geradas em camundongos infectados pelo vírus PR8(Figura 4b). Estudos anteriores identificaram que IFNEs e IL21 poderiam ser secretados tanto de células Th1 quanto Tfh em infecção por vírus e induzir a troca de classe IgG2 e IgG1,respectivamente 20. A Figura 4c retrata a geração de anticorpos específicos do vírus da gripe por elisa ensaio de IgM específico ha, IgG total, IgG1, IgG2b e IgG2C. Juntos, todos esses ensaios refletem as respostas de células B associadas ao Tfh na infecção pelo vírus da gripe.
Figura 1: Caracterização da morbidade do rato. Camundongos machos de 8 semanas foram infectados com 40 PFU de vírus da influenza PR8 por inoculação intranasal. Os camundongos foram pesados diariamente por 10 dias(a)e as MLNs foram isoladas em d.p.i 10(b). As barras de erro em(a ) representam a média ± SD. n = 4 ratos por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estratégia de gating de células Tfh e células GC B. (a) Os linfócitos são definidos por FSC-A e SSC-A, e os singlets de células são fechados com FSC-A, FSC-H e SSC-A, SSC-W. (b) Após gating em células CD4+ T, marcadores de superfície CD62L e CD44 são usados para distinguir as células T ingênuas (CD44loCD62Lhi) e células T ativadas (CD44hiCD62Lrsrs). As células Tfh policlonais podem ser fechadas a partir de células T ativadas como PD-1hi CXCR5hi population, inversamente, células não-Tfh como PD-1baixoCXCR5baixo. As células Tfh específicas do vírus PR8 são definidas como células-o CD4+CD44+ NP311-325 tetramer +PD-1hi CXCR5hi cells. (c,e) Cinética da frequência Tfh em células ativadas(c) e frequência GC B em células B220+ (e). (d) As células B GC são fechadas como células B220+ PNA+FAS+ e as células plasmáticas são IgD-CD138+ células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise da diferenciação de Tfh em camundongos infectados pelo vírus PR8. Os camundongos foram sacrificados em d.p.i 10 e mLNs e baços foram isolados para análise de diferenciação Tfh. (a) Porcentagem de Tfh em mLNs e baços em camundongos infectados pelo vírus PR8 e camundongos tratados com PBS (painel superior). As estatísticas das células Tfh (painel inferior). (b) A coloração intracelular de Bcl6 em células CD4+CD44hi T (painel superior). As estatísticas das células Bcl6+CXCR5+ (painel inferior). (c) Expressão bcl6 e (d) ICOS em células Tfh (linha-vermelha) e não-Tfh (cinza-sólido). (e) Gating de células CD4+ T específicas de NP311-325em mLNs e baços de camundongos infectados pelo vírus PR8 e tratados com PBS (painel esquerdo). A porcentagem de células Tfh específicas do vírus PR8 em mLNs e baços (painel médio). "Isótipo" indica coloração com controle de tetramer irrelevante. As estatísticas de células NP311-325-específicas CD4+ T (painel direito). (f) Coloração intracelular de IL-21 em células BAçosas CD4+ T de camundongos infectados pelo vírus PR8 e tratados com PBS, a inestimulação mostrada como controle (esquerda). As estatísticas de coloração do IL-21 (à direita). **P < 0,01, ***P < 0,001 e **** P < 0,0001 (teste t-t do aluno de duas caudas). As barras de erro representam a média ± SD. n = 3 ratos por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Análise da resposta associada a células GC B em camundongos infectados pelo vírus PR8. Os camundongos foram sacrificados no D.P.I 10 e os mLNs e baços foram isolados para análise. aA porcentagem de células GC B (painel superior). As estatísticas das células GC B (painel inferior). (b) A porcentagem de células plasmáticas (painel superior). As estatísticas das células plasmáticas (painel inferior). (c) Quantificação do vírus PR8 HA-specific IgG, IgM, IgG1, IgG2b e IgG2c no soro (d.p.i 14) de camundongos infectados pelo vírus PR8 e camundongos tratados com PBS. (d) Microscopia confocrática de folículos de células B (IgD+, Vermelho) e GCs (PNA+, Verde) nas amostras de baço de camundongos infectados pelo vírus PR8 e camundongos tratados com PBS (d.p.i 10). *P < 0,5, **P < 0,01, e ***P < 0,001 (teste t-t do aluno de duas caudas). As barras de erro representam a média ± SD. n = 3 ratos por grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| marcador de superfície | Fluorochrome | clone | volume por amostra(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | eVolve 605 | IM7 | 0.2 |
| CD62L | FITC | MEL-14 | 0.2 |
| ICOS | BV421 | 7E.17G9 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidina | Pe | 0.2 |
Tabela 1: Painel de anticorpos de marcador de superfície (exceto CXCR5) para coloração de células Tfh (PD-1hiCXCR5hi).
| marcador de superfície | Fluorochrome | clone | volume por amostra(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | IM7 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidina | BV421 | 0.5 |
Tabela 2: Anticorpos marcadores de superfície (exceto CXCR5) painel para coloração Bcl6 em células Tfh.
| marcador de superfície | Fluorochrome | clone | volume por amostra(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | IM7 | 0.2 |
Tabela 3: Painel de anticorpos marcadores de superfície para coloração intracelular de IL21.
| marcador de superfície | Fluorochrome | clone | volume por amostra(ul) |
| B220 | Apc | RA3-6B2 | 0.2 |
| IgD | eFluor 450 | 11-26c | 0.2 |
| CD95 | PE/Cy7 | Rio Jo2 | 0.3 |
| Pna | FITC | 0.3 | |
| CD138 | Pe | 281-2 | 0.2 |
Tabela 4: Painel de anticorpos marcadores de superfície para coloração de células GC B e plasma B.
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Discussion
Devido a funções especializadas no fornecimento de ajuda de células B para a geração de anticorpos de alta afinidade, as células Tfh têm sido extensivamente estudadas nos mecanismos de diferenciação e manipulação para fornecer novas estratégias para o desenho da vacina. A infecção pelo vírus da influenza induz respostas vigorosas das células Tfh e GC B, sendo assim um modelo apropriado para este campo de pesquisa. Neste artigo, descrevemos protocolos de infecção pelo vírus da gripe por inoculação intranasal, avaliação da resposta associada ao Tfh por citometria de fluxo, imunofluorescência e ELISA. Esses ensaios facilitarão a detecção da diferenciação do Tfh, desenvolvimento de GC B e anticorpos específicos do vírus da gripe e ajudarão os pesquisadores a explorar e identificar novas moléculas cruciais na resposta imune.
Em estudos com modelos de camundongos infectados pelo vírus da gripe, a perda de peso é um indicador comumente usado de morbidade de camundongos. A cinética esperada para a mudança de peso em camundongos infectados pelo vírus da gripe é descrita na Figura 1a,que reflete a resposta imune apropriada induzida nos camundongos. No entanto, ocorreriam casos anormais regularmente, nos quais os camundongos perdem peso ou não apresentam qualquer declínio de peso durante todo o período de observação. De acordo com nossas experiências, esses camundongos teriam, em sua maioria, uma resposta imune anormal menor ou superior, interrompendo assim os resultados do experimento. Para evitar tais variações, em primeiro lugar, os camundongos usados no experimento devem ser sexo e idade compatível para garantir a capacidade responsiva semelhante ao vírus. O titulador de vírus consistente para cada rato também é importante21. O titulante do vírus usado neste protocolo é de 40 PFU. No entanto, o titulador do vírus para induzir cinética de mudança de peso apropriada em cada laboratório pode ser variável devido à inconsistência no procedimento de avaliação de tituladores de vírus e cepas de camundongos usadas no experimento. Por isso, aconselhamos que a titulação do tríemos para infecção seja necessária antes do estudo de resposta imune relevante.
Neste protocolo, identificamos células Tfh com marcadores frequentemente utilizados PD-1, CXCR5 e o fator de transcrição essencial Bcl6. Embora ambas as células PD-1hiCXCR5oi e Bcl6+CXCR5+ possam ser denotadas como células Tfh, elas representam população diferente e não têm a relação precursor-progênidade baseada no fato de que nem todas ascélulas hi PD-1hiCXCR5 são Bcl6+ e nem todas as célulashi Bcl6+CXCR5 são PD-1hiCX5 Este fenótipo poderia ser explicado pela heterogeneidade da expressão Bcl6 nas células Tfh22. ICOS, uma molécula crítica tanto para a diferenciação e migração do Tfh, também deve ser incluída na análise da diferenciação do Tfh. Além disso, outras moléculas co-estimulantes associadas à função, como OX40 e CD40L, também devem ser detectadas para seu nível de expressão, embora não incluídas neste protocolo. IL21 e IL4 são citocinas secretas pelo Tfh desempenhando papéis na indução da troca de classe IgG1. O protocolo de detecção da expressão IL21 está descrito neste artigo. No entanto, devido à dificuldade na detecção de IL4 em células Tfh, os ratos repórteres IL4-GFP foram usados em estudos anteriores23. Neste protocolo, também usamos tetramers NP com rótulo fluorocromo para detectar células Tfh específicas NP311-325. No entanto, o limite na quantidade de células Tfh específicas NP311-325confere a dificuldade em uma análise mais aprofundada. Portanto, o experimento de transferência adotiva de influenza hemagglutinina específica-TCR transgênica (Tg) CD4+ (TS-1) células T, que poderiam ser isoladas de camundongos TS-1, é uma estratégia alternativa para resolver este problema24.
Aqui identificamos GC B como B220+PNA+Fas+ células na coloração de citometria de fluxo. Uma estratégia alternativa de combinação de marcadores para definir GC B como GL7hiFashi cells também é usada em outros artigos14,16. Também usamos imunofluorescência para visualizar GCs com combinação de anti-IgD e PNA. A adição aqui de anticorpo CD3 pode ajudar a visualizar as células Tfh, possibilitando assim o estudo da interação entre esses dois tipos de células10.
Dada a diferenciação das células Tfh é um processo multiestágio e multifatorial, um ensaio adicional de outras moléculas significativas em vários pontos de tempo é necessário para elucidar mecanismo mais detalhado na diferenciação de Tfh. Além disso, os parâmetros detectados aqui também são comumente utilizados em outros modelos18. Portanto, além da infecção pelo vírus da gripe, os protocolos descritos aqui, especialmente a parte imunossulífica, também podem fornecer instruções no estudo associado ao Tfh com outros modelos.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos aos funcionários das instalações de citometria de fluxo, instalações ABSL2 e instalações de animais SPF do Institut Pasteur de Xangai por sua ajuda técnica e conselhos. Este trabalho foi apoiado pelas seguintes bolsas: Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências (XDB29030103), Programa Nacional de P&D da China (2016YFA0502202), Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31570886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
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