Summary
Cet article décrit les protocoles d’évaluation de la réponse de Tfh et de GC B dans le modèle murin de l’infection par le virus de la grippe.
Abstract
Les cellules T Follicular Helper (Tfh) sont un sous-ensemble indépendant de cellules CD4+ T spécialisé dans le développement du centre germinal (GC) et la génération d’anticorps à haute affinité. Dans l’infection par le virus de la grippe, des réponses robustes des cellules Tfh et GC B sont induites pour faciliter l’éradication efficace du virus, ce qui confère un modèle de souris qualifié pour l’étude associée à Tfh. Dans cet article, nous avons décrit des protocoles dans la détection de la réponse immunitaire tfh-associée de base pendant l’infection de virus de grippe chez les souris. Ces protocoles comprennent : l’inoculation intranasale du virus grippal; coloration et analyse de cytométrie d’écoulement des cellules polyclonales et antigène-spécifiques de Tfh, des cellules de GC B et des cellules de plasma ; détection de l’immunofluorescence des PG; test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) de l’anticorps spécifique au virus de la grippe dans le sérum. Ces analyses quantifient essentiellement la différenciation et la fonction des cellules tfh dans l’infection par le virus de la grippe, fournissant ainsi une aide pour des études dans l’élucidation du mécanisme de différenciation et de la stratégie de manipulation.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, de nombreuses études ont été axées sur le sous-ensemble de cellules CD4+ T nouvellement identifié, sous-ensemble de cellules Tfh, pour ses rôles essentiels dans le développement du centre germinal (GC) B. Le lymphome à cellules B 6 (Bcl6), qui est principalement considéré comme un répresseur génétique, est le facteur déterminant de la lignée des cellules tfh pour la preuve que l’expression ectopique de Bcl6 est suffisante pour conduire la différenciation de Tfh tandis que l’insuffisance de Bcl6 entraîne la disparition de la différenciation tfh1,2,3. Contrairement à d’autres sous-ensembles CD4+ T helper effectuant leur fonction effectrice par migration vers les sites de l’inflammation, les cellules Tfh fournissent l’aide de la cellule B principalement dans la zone folliculaire de la cellule B de la rate et du ganglion lymphatique. Les molécules co-stimulantes ICOS et CD40L jouent un rôle important dans l’interaction entre les cellules Tfh et GC B. Au cours de la différenciation tfh, l’ICOS transmet les signaux nécessaires des cellules B cognées et agit également comme un récepteur recevant des signaux de migration des cellules B du spectateur pour la localisation de la zone cellulaire B4,5. CD40L est un médiateur des signaux des cellules tfh pour la prolifération des cellules B et la survie6. Un autre facteur jouant le même rôle que CD40L est la cytokine IL21, qui est principalement sécrété par les cellules tfh. IL21 régule directement le développement et la production d’anticorps à haute affinité par les cellules GC B, mais son rôle dans la différenciation de Tfhest encore controversé 7,8. Pd-1 et CXCR5, qui sont maintenant les plus fréquemment utilisés dans l’identification des cellules tfh dans l’analyse de cytométrie de flux, jouent également un rôle important dans la différenciation et la fonction de ce sous-ensemble. CXCR5 est le récepteur de la chimiokine folliculaire à cellules B et médie la localisation des cellules tfh dans les follicules cellulaires B9. PD-1 est maintenant identifié non seulement pour avoir la fonction de guidage folliculaire, mais aussi transmettre des signaux critiques dans le processus de maturation d’affinité des cellules GC B10. Sur la base de ces résultats, l’évaluation de l’expression de ces molécules pourrait essentiellement refléter la maturation et la fonction des cellules tfh.
Gc est une structure microanatomique transitoire induite dans les organes lymphoïdes secondaires et fortement dépendante des cellules de Tfh, étant ainsi une lecture parfaite pour évaluer la réponse de Tfh. Dans GC, après réception des signaux 2010 par des cytokines et des molécules co-stimulantes, les cellules B sont soumises à la commutation de classe et à l’hypermutation somatique pour générer des anticorps à haute affinité11. La commutation différentielle de classe d’anticorps se produit dans le créneau différentiel de cytokine, dans lequel IL4 et IL21 induisent le commutation de classe IgG1 tandis que IFNγ induit le commutation de classe IgG212. Les cellules plasmatiques sont les producteurs d’anticorps sécrétés et sont des cellules différenciées en phase terminale. Comme les cellules Tfh, le développement de cellules B dans GC est associé à l’expression dynamique de nombreuses molécules significatives. Selon l’étude actuelle, les cellules GC B peuvent être identifiées comme B220+PNA+Fas+ ou B220+GL7 + Fas+celluleset cellules plasmatiques, par rapport à leurs précurseurs, l’expression downregulate de B220 et upregulate CD138 expression13. Qui plus est, ces deux caractéristiques peuvent être détectées dans l’analyse de cytométrie de flux et d’immunofluorescence, étant ainsi l’évaluation appropriée de la réponse de GC.
Des réponses cellulaires et humoristiques robustes sont induites dans l’infection par le virus de la grippe, les cellules Tfh et Th1 dominant la réponse des cellules CD4+ T14,ce qui en fait un modèle parfait pour l’étude de différenciation des cellules Tfh. La grippe A/Porto Rico/8/34 H1N1(PR8), qui est une souche couramment utilisée adaptée à la souris, est fréquemment utilisée dans cetteétude 14,15,16. Ici, nous décrivons quelques protocoles de base de l’essai tfh étude pertinente dans l’infection par le virus de la grippe: 1) l’inoculation intranasale du virus PR8; 2) cellules tfh spécifiques aux antigènes, cellules GC B et plasma et détection IL21 avec cytométrie d’écoulement; 3) visualisation histologique de GC ; 4) détection du titer d’anticorps antigène-spécifique dans le sérum avec ELISA. Ces protocoles fournissent les techniques nécessaires aux nouveaux chercheurs dans l’étude associée à Tfh.
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Protocol
Les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Institut Pasteur de Shanghai, en Chine. Toutes les expériences ont été réalisées sur la base des protocoles sur les animaux approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
REMARQUE : L’infection virale des souris et l’isolement des organes doivent être effectués dans un état ABSL2.
1. Inoculation du virus de la grippe PR8 et enregistrement du poids des souris
- Préparez des souris C57BL/6 mâles de 8 semaines pour l’infection à la salle ABSL2.
REMARQUE : Ce protocole convient également aux expériences avec des souris femelles. - Dilution du virus PR8: sortir le virus du congélateur -80 °C et l’incuber sur la glace jusqu’à ce qu’il fonde dans le liquide. Vortex le virus stock à fond et diluer le virus à 2 PFU / μL avec stérile phosphate tamponné saline (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4) dans un tube pré-réfrigéré de 1,5 mL.
-
Anesthésie souris : peser chaque souris et calculer le volume (4 fois (μL) du poids de la souris (g)) du pentobarbital de sodium (2 mg/mL) à utiliser. Injecter le volume calculé de pentobarbital de sodium intraperitoneally.
REMARQUE : Cette étape consiste à faire respirer les souris de façon constante et pacifique, afin que le titer précis du virus puisse être inoculé intranasally. Des battements cardiaques trop rapides ou lents indiquent une anesthésie inappropriée. En outre, l’utilisation de pommade vétérinaire est recommandée pour éviter la sécheresse oculaire. - Inoculation intranasale: vortex du virus PR8 dilué à fond. Pipet 10 μL et effectuer soigneusement l’inoculation intranasale sur un côté goutte par goutte. Après avoir terminé l’inoculation de toutes les souris dans une cage (maximum 5 souris) de ce côté, répéter l’inoculation de l’autre côté (garder la respiration de la souris paisible et stable tout au long de l’inoculation). Chaque souris est infectée par 40 PFU du virus PR8 au total.
- Placez les souris dans la récumbence sternale dans des cages chaudes pour une meilleure renaissance.
- Surveillez le poids de la souris tous les jours pendant 10 jours. (Le jour de l’infection est enregistré comme jour 0).
2. Isolement des lymphocytes de la rate et du ganglion lymphatique médiastinien (MLN)
- Euthanasie de souris :mettre les souris dans une petite chambre et euthanasier les souris en pompant pacifiquement dans le CO2 à partir du fond de la chambre. Sortez les souris lorsqu’elles ne bougent pas et n’effectuez pas de dislocation cervicale pour s’assurer que les souris meurent complètement. Tremper les souris avec 75% d’éthanol et transférer sur le capot de biosécurité.
- Immobiliser les souris avec des aiguilles de dissection sur la plaque absorbante en mousse de dissection recouverte de papier. Couper la peau le long de la ligne médiane abdominale et les pattes postérieures avec des ciseaux de dissection et étirer la peau avec des pinces à épiler. Immobiliser la peau tendue avec des aiguilles de dissection.
- Préparer deux plats de 6 cm pour chaque souris et les garder sur la glace. Mettre une passoire cellulaire de 70 μm dans chaque plat et ajouter 5 mL de DMEM complété par 1 % de sérum bovin fœtal (DMEM (1 % de FBS))
- Isolement de rate : coupez le péritoine pour exposer la cavité abdominale avec des ciseaux de dissection. Prendre la rate et la mettre dans le plat préparé.
- isolement mLN : couper le diaphragma et le fond de la nervure de la cage à proximité du thymus. Tirez la côte de côté et épinglez-la avec des aiguilles de dissection pour exposer la cavité thoracique. Tirez le poumon de côté vers le côté droit et utilisez des pinces à épiler pour prendre le mLN, sous le cœur et près du côté ventral de la trachée.
- Mettre le mLN dans le plat préparé.
- Obtenez les suspensions à cellule unique : maillez doucement la rate ou le mLN à l’aide d’un piston de seringue de 3 mL à travers la passoire cellulaire de 70 μm. Rincer la passoire cellulaire avec 1 mL de DMEM frais (1% FBS). Resuspendez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
- Centrifugeuse de la suspension cellulaire à 350 x g pendant 6 min à 4 °C. Retirer le supernatant et ajouter 1 mL de DMEM (1% FBS).
- Resuspendez la pastille cellulaire avec 1 mL-pipette à fond. Ajouter 4 mL de DMEM (1 % de FBS) dans les suspensions cellulaires de la rate et les garder sur la glace pour les opérations suivantes.
REMARQUE: Il est nécessaire de résuspendre la pastille cellulaire avec 1 mL de milieu d’abord, pas 5 mL, pour isoler complètement les cellules individuelles de granulés.
À partir de cette étape, toutes les opérations peuvent être effectuées dans le laboratoire régulier. -
Comptage des cellules de la rate
- Resuspendez les cellules en tournant les tubes de haut en bas pendant plusieurs fois. Prendre 10 μL dans 90 μL de tampon de lyse des globules rouges (RBC) (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 155mM NH4Cl). Incuber à température ambiante (RT) pendant 3 min et ajouter 900 μL de PBS froid pour mettre fin à la réaction.
- Centrifugeuse à 400 x g pendant 6 min à 4 °C et enlever le supernatant. Resuspendez avec 100 μL de PBS froid. Prendre 10 μL de cellules dans 10 μL de 0,4% w/v trypan bleu et prendre 10 μL du mélange pour le comptage cellulaire avec l’hémomètre.
- Calcul : calculer les cellules comme méthode régulière. En bref, comptez les numéros de cellules dans deux carrés d’angle diagonales sur l’hémocytomètre et obtenez N1, N2 pour chaque carré d’angle. La concentration cellulaire de la suspension cellulaire de 5 mL doit être calculée comme (N1+N2)/2 x 10 4/mL.
3. Immunostaining des cellules polyclonales de Tfh avec PD-1 et CXCR5
- Coloration avec l’anticorps biotin-anti-CXCR5.
- Resuspendez les suspensions cellulaires en tournant le tube de haut en bas. Prendre 2 x 106 cellules dans le tube FACS et ajouter 2 mL de tampon de coloration (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). Laver par vortex sur le dispositif d’oscillation vortex.
- Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez le surnatant en versant le liquide et trempez la bouche du tube sur le papier absorbant deux fois.
- Desserrer la pastille cellulaire avec le liquide résidu en tapant le fond du tube. Mettre le tube dans le support du tube sur la glace.
REMARQUE : Le volume de liquide résidu est d’environ 25 μL. - Ajouter 0,2 μL de CD16/CD32 anti-souris (bloqueur de récepteurs Fc) pour chaque tube. Vortex en tapant doucement le fond du tube et en incuber sur la glace pendant 10 min.
REMARQUE : Préparer le mélange d’anticorps pour plusieurs échantillons par dilution avec 5μL de tampon de coloration pour chaque tube. La recette du mélange doit être préparée en diluant (n/10+1) x 0,2 μL de bloqueur de récepteurs Fc en (n/10+1) x 5 tampon de coloration μL et ajouter 5,2 μL de mélange dans chaque tube. - Ajouter 0,3 μL de biotine-anti souris CXCR5 dans le résidu de 30 μL de tampon de coloration pour chaque tube et vortex en appuyant sur le fond du tube.
REMARQUE : Préparer le mélange tel que décrit à l’étape 3.1.4. - Incuber sur la glace pendant 1 h avec des cellules doucement résuspendantes en tapant le tube à 30 min.
REMARQUE: Vortex à 30 min est d’éviter les agrégats cellulaires pour une meilleure coloration. - Ajouter 2 mL de tampon de coloration et vortex sur le dispositif d’oscillation vortex. Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C et jeter le supernatant tel que décrit à l’étape 3.1.2. Vortex en tapant sur le tube et incuber sur la glace pour la coloration ultérieure.
- Coloration avec d’autres marqueurs de surface.
- Préparer le mélange d’anticorps (tableau 1) tel que décrit à l’étape 3.1.4.
- Ajouter le mélange d’anticorps dans chaque tube. Vortex en tapant le fond du tube et incuber sur la glace pendant 30 min.
- Laver les cellules avec 2 mL de tampon de coloration. Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C.
- Jetez le supernatant et ajoutez 400 μL de tampon de coloration. Vortex le tube sur le dispositif d’oscillation vortex et de garder le tube dans l’analyse de cytométrie du débit de till sombre.
4. Immunostaining des cellules tfh spécifiques au virus de la grippe PR8
REMARQUE : Ce protocole de coloration des cellules Tfh spécifiques à la PN est isoth des étudesprécédentes 15,17.
- Effectuez la coloration biotine-CXCR5 décrite à l’étape 3.1, sauf que le numéro de cellule pris pour la coloration est de 3 x 106 pour que suffisamment de cellules spécifiques aux antigènes soient enregistrées dans la cytométrie du débit.
- Ajouter 0,3 μL de tétramer APC-conjugué-IAbNP311-325 MHC (NP311-325)dans le tube à partir de 3,1,7. Préparer le mélange pour plusieurs échantillons comme à l’étape 3.1.4
REMARQUE : Il est important de tacher le tétramer avant l’ajout d’anticorps anti-CD4 car la liaison entre le CD4 et l’anticorps anti-CD4 interférerait avec la coloration optimale du tétramer. - Resuspendez le mélange cellulaire en tapant doucement sur le tube et incubez dans l’obscurité à RT pendant 30 min.
REMARQUE : Couvrir un papier humide sur la bouche des tubes pour diminuer l’évaporation - Ajouter le mélange d’autres marqueurs de surface (tableau 1) et poursuivre l’incubation à RT pendant 30 min.
- Laver et résuspendre les cellules telles que décrites dans les étapes 3.2.3 et 3.2.4.
5. Immunostaining de Bcl6 dans les cellules polyclonales de Tfh
- Effectuer des marqueurs de surface (Tableau 2) coloration comme décrit dans la section 3, sauf que le dernier lavage avec 2 mL de PBS, au lieu de tacher tampon.
- Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez le supernatant et resuspendez les granulés cellulaires en appuyant doucement sur le fond du tube.
- Ajouter 300 μL de solution de formaldéhyde à 3,7 % (diluée à partir de 37 % de formaldéhyde avec PBS) dans le tube pour la fixation cellulaire. Vortex sur le dispositif d’oscillation vortex et incuber à RT pendant 20 min.
- Ajouter 2 mL de tampon de coloration pour le lavage et la centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules en tapant doucement sur le tube.
- Ajouter 300 μL de 0,2 % de Triton-X 100 et resuspendre les cellules par vortex sur le dispositif d’oscillation vortex. Incuber à RT pendant 15 min.
- Ajouter 2 mL de tampon de coloration pour le lavage. Centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez les cellules supernatantes et résuspendantes en appuyant doucement sur le fond du tube.
- Ajouter 1,5 μL d’anticorps PE-anti-Bcl6 pour chaque tube. Tapoter doucement le fond du tube pour résusquer le mélange et incuber à RT pendant 2 h en tapant doucement sur le tube toutes les 30 minutes.
REMARQUE : Couvrir un papier humide sur la bouche des tubes pour diminuer l’évaporation du mélange. - Ajouter 2 mL de PBS complété par 0,01% Triton-X 100 dans le tube. Vortex et centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min à 4 °C.
- Répétez le lavage à l’étape 5.8. Resuspendez les cellules avec 400 μL de tampon de coloration. Gardez les cellules dans l’obscurité sur la glace jusqu’à l’analyse de cytométrie d’écoulement.
6. Coloration intracellulaire de l’IL21
- Stimulez les cellules avec pma (phorbol 12-myristate 13-acétate) et ionomycine.
- Prendre 2 x 106 cellules de suspension cellulaire splénique et centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez la pastille cellulaire supernatante et résuspendante avec 500 μL de milieu complet des cellules T. Transférer les cellules dans la plaque de 24 puits.
- Ajouter 20 nmol PMA et 2 μmol ionomycine dans 500 μL demilieu complet 18 et bien mélanger en pipetting de haut en bas.
- Ajouter la solution préparée à l’étape 6.2 dans la suspension cellulaire dans la plaque de 24 puits et mélanger en secouant la plaque. Configurer le contrôle non formulé en ajoutant 500 μL de milieu complet des cellules T sans ajout de PMA et d’ionomycine dans les cellules. Incuber dans un incubateur de CO2 à 37°C pendant 4 h.
- Ajouter 10 μmol BFA (Brefeldin A, dissous avec du méthanol) dans chaque puits pour bloquer le transport des protéines golgi. Remettre la plaque à l’incubateur cellulaire et incuber pendant 2 h.
- Effectuez la coloration des marqueurs de surface cellulaire.
- Resuspendez les cellules en pipetting doucement de haut en bas et transférez les cellules dans un tube FACS. Ajouter 1 mL de tampon de coloration dans le tube et la centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C.
- Effectuez la coloration du bloqueur de récepteurs Fc comme étape 3.1.4.
- Effectuer des marqueurs de surface cellulaire souiller (Tableau 3) tel que décrit dans les étapes 3.2.1 à 3.2.3 sauf les cellules de lavage avec 2 mL de PBS.
- Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C. Jetez les cellules supernatantes et résuspendantes en tapant sur le fond du tube.
- Ajouter 0,2 μL de réagençant du kit de coloration Fixeur Vivant/Mort Aqua Dead Cell et incuber le tube dans l’obscurité à RT pendant 10 min pour effectuer la coloration des cellules mortes.
- Ajouter 2 mL de PBS dans le tube et vortex sur le dispositif d’oscillation vortex. Centrifugeuse à 350 x g pendant 6 min à 4 °C et jeter le supernatant.
- Effectuez la fixation cellulaire décrite dans les étapes 5.3 et 5.4.
- Ajouter 300 μL de tampon de coloration pour resuspendre les cellules et conserver les tubes dans le réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit. Centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min à 4 °C pour enlever le supernatant.
REMARQUE : Cette étape pourrait être omise et continuer à marcher 6,7 directement après l’étape 6.5. - Ajouter 1 mL de tampon saponine (tampon de coloration complété par 0,2%(w/v) saponine) dans le tube et vortex sur le dispositif d’oscillation vortex. Incuber sur la glace pendant 20 min pour effectuer la perméabilisation cellulaire.
- Centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min à 4 °C et jeter le supernatant.
- Ajouter 0,5 μL de récepteur fc-IL21 humain dans chaque tube. Préparer le mélange d’anticorps pour plusieurs comme étape 3.1.4 sauf que diluer l’anticorps avec tampon de saponine au lieu de colorer tampon.
- Incuber à RT pendant 1 h en appuyant doucement sur le fond du tube pour réutiliser les cellules à 30 min.
- Ajouter 2 mL de tampon de saponine pour laver les cellules et la centrifugeuse à 500 x g pendant 6 min. Jeter le surnatant et répéter le lavage une fois.
- Ajouter 0,1 μL d’Ig (H+L) anti-humain APC dans chaque tube. Préparer le mélange pour plusieurs échantillons comme étape 3.1.4 sauf que diluer l’anticorps avec tampon de saponine au lieu de souinage tampon.
- Incuber les échantillons sur la glace pendant 30 minutes et laver à l’étape 6.11.
- Resuspendez les cellules avec 400 μL de tampon de coloration. Gardez l’échantillon dans l’obscurité sur la glace jusqu’à l’analyse de cytométrie d’écoulement.
7. GC B et cellules plasmatiques soudant
- Prenez des cellules et effectuez la coloration anti-fc-récepteur d’anticorps comme étapes de 3.1.1 à 3.1.4.
- Effectuer des marqueurs de surface tacher (Tableau 4) comme étapes de 3,1,5 à 3,1,7, sauf que le temps d’incubation est de 30 min au lieu de 1 h.
- Resuspendez les cellules avec 400 μL de tampon de coloration. Gardez les échantillons dans l’obscurité sur la glace jusqu’à l’analyse de cytométrie d’écoulement.
8. Isolement du sérum du sang
- Le jour 14 après l’infection (d.p.i 14), recueillir le sang de la veine faciale et garder des échantillons de sang dans un réfrigérateur de 4 °C pendant la nuit.
REMARQUE : Effectuez la collecte de sang à l’état d’ABSL2 et à partir de cette étape toutes les procédures pourraient être exécutées dans le laboratoire régulier. - Centrifugeuse du sang à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Isoler soigneusement le sérum avec la pipette de 200 μL pour éviter la pollution des globules rouges. Aliquot en 3 tubes pour chaque échantillon et les stocker à -80°C.
9. Analyse du titer d’anticorps ha-spécifique avec ELISA
- Enrober les assiettes ELISA de 50 μL de solution protéique HA de 2 μg/mL par puits et les incuber au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit.
- Laver trois fois avec 200 μL d’interpolation diluée par PBS de 0,05 % (PBST). Ajouter 100 μL de lait écrémé dilué PBST à 5 % dans chaque puits et incuber à RT pendant 2 h pour bloquer la liaison non spécifique.
- Dilution et incubation du sérum : préparez 3 % de BSA dans PBS comme tampon de dilution. Diluer le sérum dans le tampon de dilution comme 1:50, 1:150, 1:450, ...... à 1:36450 (la dilution en série 3 fois est recommandée). Ajouter 50 μL de sérum dilué à chaque puits et incuber au réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit.
- Jetez le sérum et lavez rapidement les puits une fois en ajoutant 200 μL de PBST dans chaque puits (secouez-le doucement, puis jetez-le). Ensuite, lavez lentement les assiettes sur shaker avec 200 μL de PBST trois fois pendant 5 min chacune.
- Ajouter 100 μL d’anticorps secondaires étiquetés HRP spécifiques à l’IgG total, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, dilué avec PBST) et incuber à RT pendant 1 h. Laver les assiettes par PBST tel que décrit dans 9.4.
- Sortez le volume égal du tampon A et du tampon B (TMB) à partir de 4 °C de stockage et réchauffez-vous pendant au moins 30 minutes à RT avant utilisation. Mélanger A et B et ajouter 100 μL de TMB dans chaque puits et les incuber pendant 10-30 minutes à RT en secouant doucement.
REMARQUE : Il s’agit d’une brève description du manuel de l’ensemble de reagents de substrat TMB (BD,555214). - Pipette 100 μL de 2M H2SO4 dans chaque puits pour mettre fin à la réaction. Lisez la valeur OD450 à l’instrument.
- Analyse des données : obtenez la valeur finale de l’OD450 en soustrayant le signal d’arrière-plan (valeur OD450 du puits vide). Dessinez la courbe correspondant à un isotype d’anticorps de chaque échantillon avec le facteur de dilution sur l’axe X et la valeur OD450 sur l’axe Y.
10. Histologie
- Isoler la rate à d.p.i 10. Fixez-les dans la solution de formaldéhyde de 3,7% pendant 1 h à RT. Jetez le tampon de fixation et lavez-les avec PBS pendant 5 min sur le shaker pendant trois fois.
- Déshydratez les rates en PBS (10% saccharose) à 4°C pendant 1 h, puis déshydratez-les en PBS (30% saccharose) à 4°C en secouant doucement jusqu’à ce que la rate coule au fond du tube de 15 mL.
- Sortez les rates déshydratées, intégriez-les dans le composé optimal de température de coupe et cryosectioned.
- Pré-refroidir l’acétone à -20°C. Incuber les sections tissulaires avec de l’acétone pré-réfrigérée pendant 10 min. Laver les tissus avec du PBS trois fois.
- Perméabiliser les sections tissulaires avec PBS contenant 0,2% Triton X-100 pendant 20 min et les laver pendant trois fois avec PBS.
- Bloquez la liaison non spécifique avec pbs contenant 10% sérum normal de chèvre (tampon de blocage) pendant 1 h à RT et lavez les sections de tissu avec PBS une fois.
- Bloquez la liaison non spécifique avec le kit de blocage STREPTAVIDIN/BIOTIN.
REMARQUE : Ne laissez pas sécher les échantillons à partir de cette étape. - Coloration avec l’anticorps primaire : ajouter le biotine-PNA dilué tampon bloquant (25 μg/mL) et l’IgD anti-souris de rat (2.5 μg/mL) sur les sections de tissu soigneusement. Incuber les sections tissulaires dans la chambre humide dans le congélateur de 4 °C pendant la nuit.
- Lavez rapidement les sections de tissu avec PBST une fois. Lavez rapidement les sections tissulaires du PBST en secouant lentement pendant 5 min. Répéter le lavage trois fois.
- Diluer Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) et Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG (1:500) anticorps avec tampon de blocage et les ajouter sur les sections tissulaires soigneusement
- Incuber à RT pendant 1 h.
- Lavez les sections de tissu comme étape 10.8 et montez soigneusement avec la solution de prolongation. Couvrez soigneusement le tissu avec des coverslips et gardez-les dans l’obscurité à 4°C jusqu’à l’analyse confoccale.
- Analyser l’ampleur de la réaction gc en comptant les nombres de GC par taille de zone.
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Representative Results
Caractérisation de la morbidité des souris dans l’infection par le virus de la grippe
Après l’infection par le virus de la grippe, les souris sont moins actives et anorexiques en raison d’une maladie, qui se reflète par une perte de poids grave, un symptôme couramment utilisé pour surveiller la morbidité dela souris 19. Comme le montre la figure 1a, les souris infectées par le virus PR8 ont commencé à perdre du poids le jour 6, ont atteint le niveau de perte le plus élevé le jour 8 et sont revenues au niveau initial le jour 10. Comme prévu, la perte de poids n’a pas été observée tout au long de la période chez les souris témoins traitées par PBS. Pour les symptômes in vivo, l’infection virale conduit à l’expansion robuste des lymphocytes dans le ganglion lymphatique drainant, mLN dans ce cas. Par conséquent, une taille significativement plus grande de mNL a été observée chez les souris infectées par le virus PR8 que chez les souris témoins (figure 1b). Prises ensemble, ces souris ont toutes montré des symptômes prévus et ont été qualifiées pour l’étude suivante de réponse immunisée tfh-associée.
Détection de la différenciation tfh et des molécules associées à la fonction
Pour analyser la différenciation de Tfh, des souris ont été sacrifiées les jours 5, 7, 10 et 14 après infection et mLNs ou rates ont été isolés pour l’analyse de cytométrie de flux. Figure 2a et figure 2b montrent la stratégie de gating population Tfh, avec Tfh gated comme PD-1salut CXCR5cellules hi et non-Tfh comme PD-1faibleCXCR5cellules basses. Avec cette stratégie de gating, la cinétique de la différenciation de Tfh pendant l’infection de virus de grippe ont été apaisé. Comme le montre la figure 2c, la différenciation de Tfh a paraméfié au jour 5 et a atteint un sommet au jour 10. Nous avons donc prélevé des échantillons du jour 10 pour une analyse plus approfondie. Comme le montre la figure 3a, la différenciation robuste des cellules tfh a été induite chez les souris infectées par le virus grippal par rapport aux souris témoins. Pour analyser les cellules Tfh spécifiques au virus de la grippe, des tétramers de classe II de classe II du MHC (NP311-325)étiquetés fluorochrome ont été ajoutés dans le panneau de coloration polyclonal des cellules tfh (tableau 1). Tant chez les MLC que chez les rates provenant de souris infectées par le virus grippal, les lymphocytes CD4+ T spécifiques au NP311-325ont été induits de manière significative et les cellules Tfh spécifiques au NP311-325ont pu être analysées par l’ajout de PD-1 et de CXCR5 dans l’analyse (figure 3e). En raison des rôles essentiels de Bcl6 dans la différenciation tfh, bcl6+CXCR5+ cellules peuvent également représenter la population tfh. De façon constante, les cellules tfh identifiées à cette stratégie ont également été induites de façon robuste( figure 3b). Nous avons analysé davantage l’expression de Bcl6 dans les cellules tfh et non tfh. Comme le montre la figure 3c, l’expression plus élevée de Bcl6 dans les cellules tfh que dans les cellules non tfh indique une coloration bcl6 réussie. Avec une stratégie similaire, iCOS, une autre molécule associée à Tfh a également été analysée( Figure 3d). En raison du rôle spécialisé des cellules tfh dans l’aide aux cellules B, l’analyse de l’expression de l’IL21, qui est sécrété principalement par les cellules tfh et démontré pour réguler directement la survie et la prolifération des cellules B, pourrait révéler la fonction des cellules Tfh dans une certaine mesure. Comme indiqué dans la figure 3f, la coloration intracellulaire d’IL21 a indiqué que l’infection de PR8 a induit la production sensiblement plus élevée de cette cytokine, avec des cellules non simulées comme contrôle de gating. Pris ensemble, ces analyses pourraient refléter les informations de base de la différenciation tfh et fournir les aperçus de la capacité d’aide cellulaire B.
Détection du développement des cellules GC B et plasmatiques et des anticorps spécifiques au virus de la grippe dans le sérum
La fonction principale des cellules de Tfh est de fournir l’aide de cellules de B dans les IC, dans lesquels le commutation de classe d’anticorps et la maturation d’affinité se produisent. Ainsi, le développement du GC B pourrait indirectement refléter la différenciation et la fonction des cellules tfh. Les cellules GC B peuvent être activées sous forme de cellules B220+PNA+Fas+ cells (Figure 2d). Grâce à cette stratégie de gating, nous avons testé la cinétique de la réponse cellulaire gc B et constaté que la réponse gc B a commencé au jour 10 et a continué d’augmenter au jour 14 (Figure 2e). La comparaison entre les souris infectées par le virus PR8 et les souris témoins a montré que le GC B robuste a été induit à la fois dans le MLN et la rate après l’infection par le virus de la grippe (figure 4a), ce qui est compatible avec la différenciation induite par Tfh chez les souris infectées par le virus PRB. De plus, la coloration par immunofluorescence avec IgD et PNA fournit des images visualisées indiquant une réaction induite au GC (zones vertes) chez les souris infectées par le virus PR8 (figure 4d). Des cellules plasmatiques, identifiées comme étant descellulesCD138 +faibles en IgD (figure 2d), ont également été générées chez des souris infectées par le virus PR8 (figure 4b). Des études antérieures ont identifié que IFNƳ et IL21 pourraient être sécrétés à partir des cellules Th1 et Tfh dans l’infection virale et induire igG2 et IgG1 changement de classe,respectivement 20. La figure 4c illustre la génération d’anticorps spécifiques au virus de la grippe par l’analyse ELISA de l’IgM spécifique à l’HA, de l’IgG total, de l’IgG1, de l’IgG2b et de l’IgG2C. Ensemble, tous ces analyses reflètent les réponses des cellules B associées à Tfh dans l’infection par le virus de la grippe.
Figure 1 : Caractérisation de la morbidité de la souris. Des souris mâles de 8 semaines ont été infectées par 40 PFU du virus de grippe PR8 par inoculation intranasale. Les souris ont été pesées quotidiennement pendant 10jours (a)et les mLN ont été isolés sur d.p.i 10 (b). Les barres d’erreurdans ( a) représentent la moyenne ± SD. n = 4 souris par groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Stratégie de gating des cellules tfh et des cellules GC B. a)Les lymphocytes sont définis par FSC-A et SSC-A, et les singlets cellulaires sont fermés avec FSC-A, FSC-H et SSC-A, SSC-W. b)Après avoir tété dans les cellules CD4+ T, les marqueurs de surface CD62L et CD44 sont utilisés pour distinguer les lymphocytes T naïfs (CD44loCD62Lhi)et les lymphocytes T activés (CD44hiCD62Llo). Polyclonal Tfh cellules peuvent être fermés à partir de cellules T activées comme PD-1salut CXCR5 salut population, inversement, les cellules non Tfh que PD-1 faible CXCR5faible. Pr8 virus spécifiques tfh cellules sont définies comme CD4+CD44+ NP311-325 tétramer+PD-1salut CXCR5cellules hi. c,e) Cinétique de la fréquence Tfh dans les cellules activées (c) et fréquence GC B dans B220+ cellules (e). (d) Les cellules GC B sont gated comme B220+ PNA+FAS+ cellules, et les cellules plasmatiques sont IgD-CD138+ cellules. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse de la différenciation de Tfh chez les souris infectées par le virus PR8. Des souris ont été sacrifiées sur d.p.i 10 et des mLNs et des rates ont été isolés pour l’analyse de différenciation de Tfh. a) Pourcentage de Tfh dans les mLN et les rate chez les souris infectées par le virus PR8 et les souris traitées par PBS (panneau supérieur). Les statistiques des cellules tfh (panneau inférieur). (b) La coloration intracellulaire de Bcl6 en CD4+CD44hi T cells (panneau supérieur). Les statistiques de Bcl6+CXCR5+ cellules (panneau inférieur). c) Bcl6 et (d) expression ICOS en tfh (rouge ligne) et cellules non Tfh (gris massif). (e) Gating de NP311-325-spécifique CD4+ lymphocytes T dans les mLNs et la rate des souris infectées par le virus PR8 et traitées par PBS (panneau gauche). Pourcentage de cellules Tfh spécifiques au virus PR8 dans les mLN et les rates (panneau intermédiaire). « Isotype » indique la coloration avec le contrôle non pertinent du tétramer. Les statistiques de NP311-325-spécifiques CD4+ lymphocytes T (panneau droit). f)Coloration intracellulaire de l’IL-21 dans les cellules CD4+ T spléniques des souris infectées par le virus PR8 et traitées par PBS, l’unstimulation indiquée comme contrôle (à gauche). Les statistiques de la coloration IL-21 (à droite). **P < 0,01, ***P < 0,001 et **** P < 0,0001 (t-test de l’étudiant à deux queues). Les barres d’erreur représentent la ± SD. n = 3 souris par groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Analyse de la réponse associée aux cellules du GC B chez les souris infectées par le virus PR8. Des souris ont été sacrifiées sur d.p.i 10 et les mLNs et les rates ont été isolés pour l’analyse. a)Le pourcentage de cellules GC B (panneau supérieur). Les statistiques des cellules GC B (panneau inférieur). b)Le pourcentage de cellules plasmatiques (panneau supérieur). Les statistiques des cellules plasmatiques (panneau inférieur). c) Quantification du virus PR8 IgG spécifique à l’HA, IgM, IgG1, IgG2b et IgG2c dans le sérum (d.p.i 14) des souris infectées par le virus PR8 et des souris traitées par PBS. d) microscopie confoccale de follicules cellulaires B (IgD+, Rouge) et de PG (PNA+, Vert) dans les échantillons de rate de souris infectées par le virus PR8 et de souris traitées par PBS (d.p.i 10). *P < 0.5, **P < 0.01, et ***P < 0.001 (t-test de l’étudiant à deux queues). Les barres d’erreur représentent la ± SD. n = 3 souris par groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| marqueur de surface | Fluorochrome | clone | volume par échantillon(ul) |
| CD4 (EN) | Percp-eFluor 710 Percp-eFluor 710 | GK1.5 (en) | 0.2 |
| CD44 (en) | eVolve 605 | IM7 (im7) | 0.2 |
| CD62L (EN) | FITC (fitc) | MEL-14 (en) | 0.2 |
| ICOS (ICOS) | BV421 (BV421) | 7E.17G9 | 0.2 |
| PD1 (PD1) | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidine ( Streptavidin ) | Pe | 0.2 |
Tableau 1 : Marqueur de surface (à l’exception du panneau d’anticorps CXCR5) pour tacher les cellules tfh (PD-1hiCXCR5hi).
| marqueur de surface | Fluorochrome | clone | volume par échantillon(ul) |
| CD4 (EN) | Percp-eFluor 710 Percp-eFluor 710 | GK1.5 (en) | 0.2 |
| CD44 (en) | FITC (fitc) | IM7 (im7) | 0.2 |
| PD1 (PD1) | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidine ( Streptavidin ) | BV421 (BV421) | 0.5 |
Tableau 2 : Panneau anticorps marqueur de surface (à l’exception de CXCR5) pour tacher bcl6 dans les cellules tfh.
| marqueur de surface | Fluorochrome | clone | volume par échantillon(ul) |
| CD4 (EN) | Percp-eFluor 710 Percp-eFluor 710 | GK1.5 (en) | 0.2 |
| CD44 (en) | FITC (fitc) | IM7 (im7) | 0.2 |
Tableau 3 : Panneau anticorps marqueur de surface pour la coloration intracellulaire d’IL21.
| marqueur de surface | Fluorochrome | clone | volume par échantillon(ul) |
| B220 (en) | Apc | RA3-6B2 | 0.2 |
| IgD (IgD) | eFluor 450 | 11-26c | 0.2 |
| CD95 (en) | PE/Cy7 | Jo2 Jo2 | 0.3 |
| Pna | FITC (fitc) | 0.3 | |
| CD138 (en) | Pe | 281-2 | 0.2 |
Tableau 4 : Panneau anticorps marqueur de surface pour tacher les cellules GC B et plasma B.
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Discussion
En raison de rôles spécialisés dans la fourniture d’aide à la cellule B pour la génération d’anticorps à haute affinité, les cellules tfh ont fait l’objet d’études approfondies dans les mécanismes de différenciation et de manipulation afin de fournir de nouvelles stratégies pour la conception du vaccin. L’infection par le virus grippal induit des réponses vigoureuses des cellules Tfh et GC B, ce qui est un modèle approprié pour ce domaine de recherche. Dans cet article, nous avons décrit des protocoles de l’infection de virus de grippe par inoculation intranasal, évaluation de la réponse tfh-associée par cytométrie de flux, immunofluorescence et ELISA. Ces analyses faciliteront la détection de la différenciation tfh, du développement du GC B et des anticorps spécifiques au virus grippal et aideront les chercheurs à explorer et à identifier de nouvelles molécules cruciales dans la réponse immunitaire.
Dans des études portant sur des modèles de souris infectées par le virus grippal, la perte de poids est un indicateur couramment utilisé de la morbidité des souris. Le changement de poids attendu cinétique chez les souris infectées par le virus de la grippe est tel que décrit dans la figure 1a, qui reflète la réponse immunitaire appropriée induite chez les souris. Cependant, des cas anormaux se produiraient régulièrement, dans lesquels les souris perdent leur poids ou ne montrent aucune baisse de poids tout au long de la période d’observation. Selon nos expériences, ces souris porteraient principalement une réponse immunitaire anormale inférieure ou supérieure, perturbant ainsi les résultats de l’expérience. Pour éviter de telles variations, tout d’abord les souris utilisées dans l’expérience devraient être le sexe et l’âge appariés pour garantir la capacité réactive similaire au virus. Le titer cohérent de virus pour chaque souris est également important21. Le titer de virus utilisé dans ce protocole est de 40 PFU. Cependant, le titer de virus pour induire la cinétique appropriée de changement de poids dans chaque laboratoire pourrait être variable en raison de l’incohérence dans la procédure d’évaluation de titer de virus et des souches de souris employées dans l’expérience. Ainsi, nous conseillons la titration du titer de virus pour l’infection est nécessaire avant l’étude de réponse immunitaire pertinente.
Dans ce protocole, nous avons identifié les cellules tfh avec des marqueurs fréquemment utilisés PD-1, CXCR5 et le facteur de transcription essentiel Bcl6. Bien que les deux PD-1salutCXCR5salut et Bcl6+CXCR5+ cellules pourraient être indiqués comme cellules Tfh, ils représentent une population différente et n’ont pas la relation précurseur-descendance basée sur le fait que pas tous les PD-1salutCXCR5cellules hi sont Bcl6 +et pas tous les Bcl6+CXCR5cellules hi sont PD-1salutCXCR5salut. Ce phénotype pourrait s’expliquer par l’hétérogénéité de l’expression bcl6 dans les cellules tfh22. L’ICOS, une molécule essentielle pour la différenciation et la migration de Tfh, devrait également être incluse dans l’analyse de la différenciation de Tfh. En outre, d’autres molécules co-stimulantes associées à la fonction, telles que OX40 et CD40L devraient également être détectées pour leur niveau d’expression, bien qu’elles ne soient pas incluses dans ce protocole. IL21 et IL4 sont tous deux des cytokines sécrètes par Tfh qui jouent un rôle en induisant le changement de classe IgG1. Le protocole de détection de l’expression IL21 est décrit dans cet article. Cependant, en raison de la difficulté dans la détection de l’IL4 dans les cellules de Tfh, il4-GFP souris reporter ont été utilisés dans des étudesprécédentes 23. Dans ce protocole, nous avons également utilisé des tétramers NP étiquetés fluorochrome pour détecter les cellules Tfh spécifiques au NP311-325. Néanmoins, la limite de la quantité de cellules Tfhspécifiques au PN 311-325confère la difficulté d’une analyse plus approfondie. Par conséquent, l’expérience de transfert adoptif des cellules T transgéniques spécifiques à l’hémagglutinine grippale (Tg) CD4+ (TS-1), qui pourraient être isolées des souris TS-1, est une stratégie alternative pour résoudre ce problème24.
Ici, nous avons identifié GC B comme B220+PNA+Fas+ cellules dans la coloration de cytométrie de flux. Une stratégie alternative de combinaison de marqueurs pour définir GC B comme GL7hiFashi cellules est également utilisé dans d’autresarticles 14,16. Nous utilisons également l’immunofluorescence pour visualiser les PG avec la combinaison de l’anti-IgD et de la PNA. Ici, en plus de l’anticorps CD3 peut aider à visualiser les cellules tfh, permettant ainsi l’étude de l’interaction entre ces deux types decellules 10.
Étant donné que la différenciation des cellules tfh est un processus multistage et multifactoriel, un essai supplémentaire d’autres molécules significatives à plusieurs moments est nécessaire pour élucider un mécanisme plus détaillé dans la différenciation de Tfh. En outre, les paramètres détectés ici sont également couramment utilisés dans d’autresmodèles 18. Par conséquent, outre dans l’infection par le virus de la grippe, les protocoles décrits ici, en particulier la partie immunostaining, peuvent également fournir des instructions dans l’étude associée à Tfh avec d’autres modèles.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions le personnel de l’installation de cytométrie de débit, de l’installation ABSL2 et de l’installation animale SPF de l’Institut Pasteur de Shanghai pour leur aide technique et leurs conseils. Ces travaux ont été soutenus par les subventions suivantes : Programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des sciences (XDB29030103), Programme national de R-D de la Chine (2016YFA0502202), Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (31570886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
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