Summary
تصف هذه الورقة بروتوكولات تقييم استجابة تفه و GC B في نموذج الماوس للعدوى بفيروس الإنفلونزا.
Abstract
T مُساعد الجريب (Tfh) الخلايا هي مجموعة فرعية مستقلة من الخلايا CD4+ T متخصصة في تقديم المساعدة لتطوير مركز الجراثيم (GC) وتوليد الأجسام المضادة عالية التقارب. وفي عدوى فيروس الأنفلونزا، يتم حث استجابات خلايا تفه وGC B القوية لتسهيل القضاء الفعال على الفيروس، مما يمنح نموذج فأر مؤهل للدراسة المرتبطة بـ Tfh. في هذه الورقة، وصفنا البروتوكولات في الكشف عن الاستجابة المناعية الأساسية المرتبطة بـ Tfh أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا لدى الفئران. وتشمل هذه البروتوكولات: تلقيح فيروس الأنفلونزا داخل الأنف؛ ولقاح فيروس الأنفلونزا؛ ولقاح فيروس الأنفلونزا؛ واللقاحات واللقاحات؛ واللقاحات واللقاحات؛ تدفق التلطخات للخلايا وتحليل خلايا التفح الفارقة البولي كلينال ومضاد خاص, GC B الخلايا والخلايا البلازما; الكشف المناعي من الفلوروس؛ إنزيم مرتبط بالمناعة (ELISA) من الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا في المصل. هذه المقايسة أساسا كمي التمايز و وظيفة خلايا تف في عدوى فيروس الأنفلونزا، وبالتالي توفير المساعدة للدراسات في توضيح آلية التمايز واستراتيجية التلاعب.
Introduction
في العقد الأخير، ركزت العديد من الدراسات على مجموعة CD4+ T الخلية الفرعية التي تم تحديدها حديثًا، مجموعة الخلايا Tfh الفرعية، لأدوارها الأساسية في تطوير مركز الجراثيم (GC) B. B سرطان الغدد الليمفاوية الخلية 6 (Bcl6), الذي يعتبر أساسا ككبوت الجينات, هو عامل تحديد النسب من خلايا تف للدليل على أن التعبير خارج الرحم من Bcl6 كافية لدفع التمايز تف بينما نقص Bcl6 النتائج في التمايز تف اختفت1,2,3. على عكس مجموعات فرعية أخرى من المساعد CD4+ T تؤدي وظيفتها المؤثرة عن طريق الترحيل إلى مواقع الالتهاب ، توفر خلايا التف خلية B المساعدة بشكل رئيسي في منطقة الخلية B الجريبة من الطحال والعقدة الليمفاوية. الجزيئات المشتركة المحفزة ICOS و CD40L، تلعب أدوارا هامة في التفاعل بين خلايا Tfh و GC B. خلال التمايز Tfh، ICOS ينقل الإشارات الضرورية من الخلايا B cognate وأيضا بمثابة مستقبل استقبال إشارات الهجرة من خلايا المارة B لتوطين منطقة الخلية B4،5. CD40L هو وسيط من الإشارات من خلايا Tfh لتكاثر الخلايا B والبقاء6. عامل آخر يلعب دور مماثل كما CD40L هو cytokine IL21، الذي يفرز أساسا من قبل خلايا تف. IL21 ينظم مباشرة GC B تطوير الخلايا وإنتاج الأجسام المضادة عالية التقارب، ولكن دورها في التمايز Tfh لا يزال مثيرا للجدل7،8. PD-1 و CXCR5، والتي هي الآن الأكثر استخداما في تحديد خلايا تف في تحليل تدفق الخلايا، كما تلعب أدوارا هامة في التمييز وظيفة هذه المجموعة الفرعية. CXCR5 هو مستقبلات من B الخلية chemokine الجريب ويتوسط توطين خلايا تف في بصيلات الخلية B9. تم تحديد PD-1 الآن ليس فقط أن يكون لها وظيفة التوجيه الجريب ولكن أيضا إرسال إشارات حاسمة في عملية GC B خلايا تقارب النضج10. وبناء على هذه النتائج، فإن تقييم التعبير عن هذه الجزيئات يمكن أن يعكس أساسا نضوج ووظيفة خلايا التف.
GC هو بنية ميكرو مجهرية مستحثة في الأعضاء اللمفاوية الثانوية وتعتمد بشكل كبير على خلايا التنفّس، وبالتالي كونها قراءة مثالية لتقييم استجابة Tfh. في GC، بعد تلقي إشارات بوساطة السيتوكينات والجزيئات المشتركة المحفزة، تخضع الخلايا B لتحول الطبقة والتبدل الجسدي لتوليد أجسام مضادة عالية التقارب11. يحدث تبديل فئة الأجسام المضادة التفاضلية في مكانة السيتوكين التفاضلية ، والتي IL4 و IL21 تحفز IgG1 فئة التبديل بينما IFNγ يدفع IgG2 فئة التبديل12. خلايا البلازما هي منتجي الأجسام المضادة المفرزة وخلايا متمايزة بشكل نهائي. مثل خلايا تف، ويرتبط تطوير الخلايا B في GC مع التعبير الديناميكي من العديد من الجزيئات الهامة. استنادا إلى الدراسة الحالية، يمكن التعرف على خلايا GC B كما B220+السلطة الوطنية الفلسطينية+فاس+ أو B220+GL7+فاس+ الخلايا والخلايا البلازما، بالمقارنة مع السلائف، والتعبير downregulate من B220 و upregulate CD138 التعبير13. والأكثر من ذلك، يمكن اكتشاف كل من هذه الخصائص في تحليل قياس تدفق التحاليل والتحاليل المناعية، وبالتالي يتم التقييم المناسب لاستجابة GC.
يتم حث الردود الخلوية والخلطية القوية في عدوى فيروس الأنفلونزا ، مع خلايا Tfh وTh1 التي تهيمن على CD4+ T الخليةاستجابة 14، مما يجعلها نموذجًا مثاليًا لدراسة تمايز خلايا Tfh. الأنفلونزا A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8)، وهي سلالة يشيع استخدامها في استخدام الماوس، وكثيرا ما تستخدم في هذه الدراسة14،15،16. هنا، نحن وصف بعض البروتوكولات الأساسية من فحص دراسة تف ذات الصلة في عدوى فيروس الأنفلونزا: 1) التلقيح داخل الأنف من فيروس PR8; 2) الخلايا Tfh مستضد محددة، GC B وخلايا البلازما والكشف IL21 مع تدفق الخلايا الجذعية؛ 3) التصور النسيجي للGC؛ 4) الكشف عن الأجسام المضادة للجسم المستضد محددة في مصل الدم مع ELISA. وتوفر هذه البروتوكولات التقنيات اللازمة للباحثين الجدد في الدراسة المرتبطة بـ Tfh.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات التابعة لـ Institut Pasteur في شنغهاي بالصين على التجارب على الحيوانات. وقد أجريت جميع التجارب استنادا إلى بروتوكولات رعاية الحيوان المؤسسية واستخدامها التي وافقت عليها لجنة.
ملاحظة: ينبغي أن يتم تنفيذ العدوى الفيروسية الفئران وعزل الأعضاء تحت شرط ABSL2.
1. تلقيح فيروس انفلونزا PR8 وتسجيل وزن الفئران
- إعداد 8 أسابيع الذكور C57BL/6 الفئران للعدوى في غرفة ABSL2.
ملاحظة: هذا البروتوكول هو أيضا مناسبة في التجارب مع الفئران الإناث. - تخفيف فيروس PR8: إخراج الفيروس من -80 درجة مئوية الفريزر واحتضان على الجليد حتى يذوب في السائل. دوامة فيروس المخزون جيدا وتمييع الفيروس إلى 2 PFU / μL مع المالحة المعقمة الفوسفات المخزن (PBS، 135 mM NaCl، 2.7 mM KCl، 10 mM Na2HPO4، 1.8 mM KH2PO4) في أنبوب 1.5 مل ما قبل المبردة.
-
ازن الماوس تخدير: وزن كل فأرة وحساب حجم (4 أضعاف (μL) وزن الفأرة (ز)) من بينتوبربيتال الصوديوم (2 ملغ / مل) لاستخدامها. حقن الحجم المحسوب من بينتوباربيتال الصوديوم intraperitoneally.
ملاحظة: هذه الخطوة هي جعل الفئران تتنفس باطراد وسلمي، بحيث يمكن تلقيح تتر دقيق للفيروس داخل الفم. تشير ضربات القلب السريعة أو البطيئة إلى تخدير غير مناسب. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى باستخدام مرهم الطبيب البيطري لتجنب جفاف العين. - التلقيح داخل الأنف: دوامة فيروس PR8 المخفف بدقة. Pipet 10 μL وأداء بعناية التلقيح داخل الأنف على جانب واحد قطرة قطرة. بعد الانتهاء من التطعيم من جميع الفئران في قفص واحد (الحد الأقصى 5 الفئران) على هذا الجانب، وتكرار التطعيم على الجانب الآخر (الحفاظ على التنفس من الماوس السلمية وثابتة من خلال التطعيم). يصاب كل فأرة مع 40 PFU من فيروس PR8 في المجموع.
- وضع الفئران في إعادة شغل القص في أقفاص دافئة لإحياء أفضل.
- مراقبة وزن الماوس يوميا لمدة 10 أيام. (يتم تسجيل يوم العدوى كـ اليوم 0).
2. عزل الخلايا الليمفاوية من الطحال والعقدة الليمفاوية الوسيطة (mLN)
- القتل الرحيم الماوس: وضع الفئران في غرفة صغيرة والقتل الرحيم الفئران عن طريق ضخ في CO2 سلميا من الجزء السفلي من الغرفة. إخراج الفئران عندما لا تتحرك وتؤدي خلع عنق الرحم لضمان وفاة الفئران تماما. تراجع الفئران مع 75٪ الإيثانول ونقلها إلى غطاء محرك السيارة السلامة البيولوجية.
- قم بشل حركة الفئران بإبر تشريح على لوحة رغوة التشريح المغطى بالرق الماصة. قطع الجلد على طول خط الوسط البطني والساقين الخلفيتين مع مقص تشريح وتمتد الجلد مع ملاقط. شل حركة الجلد الممدد بإبر تشريح.
- إعداد اثنين من أطباق 6 سم لكل فأرة والاحتفاظ بها على الجليد. وضع مصفاة 70-μm خلية في كل طبق وإضافة 5 مل من DMEM تكملها مع 1٪ مصل الأبقار الجنين (DMEM (1٪ FBS))
- العزل الطحال: قطع الصفاق لفضح تجويف البطن مع مقص تشريح. خذ الطحال وضعه في الطبق المعد.
- mLN العزلة: قطع الحجاب الحاجز والجزء السفلي من القفص الضلع إلى محيط الغدة الصعترية. سحب الضلع جانبا ودبابيس مع الإبر تشريح لفضح تجويف الصدر. اسحب الرئة جانباً إلى الجانب الأيمن واستخدم ملاقط لأخذ mLN، تحت القلب وبالقرب من الجانب البطني من القصبة الهوائية.
- وضع mLN في طبق المعدة.
- الحصول على تعليق خلية واحدة: شبكة الطحال أو mLN بلطف مع المكبس من حقنة 3 مل من خلال مصفاة خلية 70-μm. شطف مصفاة الخلية مع 1 مل من DMEM الطازجة (1٪ FBS). إعادة تعليق الخلية ونقلها إلى أنبوب جهاز طرد مركزي 15 مل.
- جهاز طرد مركزي تعليق الخلية في 350 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية. إزالة فائقة وإضافة 1 مل من DMEM (1٪ FBS).
- Resuspend بيليه الخلية مع 1 مل ماصة بدقة. إضافة 4 مل من DMEM (1٪ FBS) في تعليق خلية الطحال والاحتفاظ بها على الجليد للعمليات التالية.
ملاحظة: من الضروري إعادة تعليق بيليه الخلية مع 1 مل من المتوسط أولا، وليس 5 مل، لعزل الخلايا الفردية تماما من بيليه.
من هذه الخطوة فصاعدا، يمكن تنفيذ جميع العمليات في المختبر العادي. -
عد خلية الطحال
- خلايا إعادة الانتفير عن طريق تحويل الأنابيب صعودا وهبوطا لعدة مرات. خذ 10 ميكرولتر إلى 90 ميكرولتر من خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العازلة (10 mM تريس-HH 7.5، 155m NH4Cl). احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 3 دقائق وإضافة 900 μL من برنامج تلفزيوني الباردة لإنهاء التفاعل.
- جهاز طرد مركزي في 400 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية وإزالة فائقة. Resuspend مع 100 μL من برنامج تلفزيوني الباردة. تأخذ 10 ميكرولتر من الخلايا إلى 10 ميكرولتر من 0.4٪ ث / v trypan الأزرق واتخاذ 10 ميكرولتر من الخليط لعد الخلايا مع قياس الهيموسيت.
- الحساب: حساب الخلايا كطريقة عادية. باختصار، عد أرقام الخلايا في اثنين من المربعات الزاوية قطري على قياس ال hemocytometer والحصول على N1، N2 لكل مربع الزاوية. يجب حساب تركيز الخلية من تعليق الخلية 5 مل كما (N1 + N2) / 2 × 104 / مل.
3. المناعة من خلايا متعددة النخلة مع PD-1 و CXCR5
- تلطيخ مع الأجسام المضادة للبيوتين المضادة CXCR5.
- تعليق الخلية ريسوسينيد عن طريق تحويل أنبوب صعودا وهبوطا. خذ 2 × 106 خلايا في أنبوب FACS وأضف 2 مل من مخزن البقع (PBS (1٪ FBS، 1 mM EDTA)). غسلها من قبل دوامة على جهاز التذبذب دوامة.
- جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل الماحشة عن طريق صب السائل وتراجع أنبوب الفم على ورقة ماصة مرتين.
- تخفيف بيليه الخلية مع السائل بقايا عن طريق التنصت على الجزء السفلي من أنبوب. وضع أنبوب في حامل أنبوب على الجليد.
ملاحظة: حجم السائل بقايا حوالي 25 ميكرولتر. - إضافة 0.2 μL من المضادة للماوس CD16/CD32 (Fc-مستقبلات مانع) لكل أنبوب. دوامة عن طريق التنصت على أسفل أنبوب بلطف واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة.
ملاحظة: إعداد خليط الأجسام المضادة لعينات متعددة عن طريق التخفيف مع 5μL من مخزن البقع لكل أنبوب. وينبغي إعداد وصفة للخليط عن طريق تخفيف (n/10+1) × 0.2 ميكرولتر Fc-مستقبلات مانع في (n/10+1) × 5 ميكرولتر تلطيخ العازلة وإضافة 5.2 ميكرولتر المخلوط في كل أنبوب. - إضافة 0.3 μL من الماوس المضادة البيوتين CXCR5 في بقايا 30 ميكرولتر من تلطيخ العازلة لكل أنبوب ودوامة عن طريق التنصت على أسفل الأنبوب.
ملاحظة: تحضير الخليط كما هو موضح في الخطوة 3.1.4. - احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة مع خلايا resuspending بلطف عن طريق التنصت على أنبوب في 30 دقيقة.
ملاحظة: دوامة في 30 دقيقة هو لتجنب مجاميع الخلية لتلطيخ أفضل. - إضافة 2 مل من البقع العازلة ودوامة على جهاز تذبذب دوامة. أجهزة الطرد المركزي في 350 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من الفائق كما هو موضح في الخطوة 3.1.2. دوامة عن طريق التنصت على أنبوب واحتضان على الجليد لتلوين اللاحقة.
- تلطيخ مع علامات سطح أخرى.
- إعداد خليط الأجسام المضادة (الجدول 1) كما هو موضح في الخطوة 3-1-4.
- إضافة خليط الأجسام المضادة في كل أنبوب. دوامة عن طريق التنصت على أسفل أنبوب واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- غسل الخلايا مع 2 مل من البقع العازلة. جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- تجاهل عظمى وإضافة 400 ميكرولتر من البقع العازلة. دوامة الأنبوب على جهاز تذبذب دوامة والحفاظ على أنبوب في الظلام حتى تدفق تحليل القياسات.
4. المناعة من فيروس PR8 الأنفلونزا خلايا Tfh محددة NP
ملاحظة: هذا البروتوكول من تلطيخ خلايا Tfh NP محددة هو من الدراسات السابقة15,17.
- تنفيذ تلوين البيوتين-CXCR5 كما هو موضح في الخطوة 3.1 إلا أن عدد الخلايا التي اتخذت لتلطيخ هو 3 × 106 للخلايا المضادة الخاصة بما فيه الكفاية ليتم تسجيلها في تدفق القياس الخلوي.
- إضافة 0.3 ميكرولتر من APC-مترافق- IAbNP311-325 MHC الفئة II (NP311-325)رباعي في الأنبوب من 3.1.7. إعداد الخليط لعينات متعددة كما في الخطوة 3-1-4
ملاحظة: من المهم وصمة التترامير قبل إضافة الأجسام المضادة CD4 كما الربط بين الأجسام المضادة CD4 ومضادة لـ CD4 سوف تتداخل مع تلطيخ tetramer الأمثل. - Resuspend خليط الخلية عن طريق النقر بلطف على الأنبوب واحتضانه في الظلام في RT لمدة 30 دقيقة.
ملاحظة: تغطية ورقة مبللة على فم الأنابيب لتقليل التبخر - إضافة خليط من علامات سطح أخرى(الجدول 1)ومواصلة الحضانة في RT لمدة 30 دقيقة.
- غسل الخلايا وإعادة تعليقها كما هو موضح في الخطوتين 3.2.3 و3.2.4.
5. مناعة من Bcl6 في خلايا الزهة البولي كلينال
- أداء علامات السطح (الجدول 2) تلطيخ كما هو موضح في القسم 3 إلا أن غسل الماضي مع 2 مل من برنامج تلفزيوني، بدلا من تلطيخ العازلة.
- جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل الكريات الخلية فائقة و resuspend عن طريق النقر بلطف أسفل الأنبوب.
- إضافة 300 ميكرولتر من 3.7٪ حل الفورمالديهايد (المخفف من 37٪ الفورمالديهايد مع برنامج تلفزيوني) في أنبوب لتثبيت الخلية. دوامة على جهاز تذبذب دوامة واحتضان في RT لمدة 20 دقيقة.
- إضافة 2 مل من مخزن البقع للغسيل والطرد المركزي عند 500 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من الخلايا الفائقة والمرتدة عن طريق النقر بلطف على الأنبوب.
- إضافة 300 μL من 0.2٪ تريتون X 100 والخلايا resuspend من قبل دوامة على جهاز تذبذب دوامة. احتضان في RT لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 2 مل من مخزن البقعة للغسيل. جهاز طرد مركزي عند 500 × ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل الخلايا الفائقة و resuspend عن طريق النقر بلطف أسفل الأنبوب.
- أضف 1.5 ميكرولتر من الأجسام المضادة PE-المضادة Bcl6 لكل أنبوب. التنصت بلطف أسفل أنبوب لإعادة تعليق الخليط واحتضان في RT لمدة 2 ساعة مع النقر بلطف على الأنبوب كل 30 دقيقة.
ملاحظة: تغطية ورقة مبللة على فم الأنابيب لتقليل تبخر الخليط. - إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني تكملها 0.01٪ تريتون X 100 في الأنبوب. دوامة وطاردة مركزية عند 500 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجة مئوية.
- كرر الغسيل كخطوة 5.8. خلايا إعادة النيامد مع 400 ميكرولتر من عازلة تلطيخ. إبقاء الخلايا في الظلام على الجليد حتى تحليل تدفق العمليات.
6. تلطيخ داخل الخلايا من IL21
- تحفيز الخلايا مع PMA (phorbol 12-myristate 13-خلات) والأيونوميسين.
- خذ 2 × 106 خلايا من نظام التعليق الخلوي والطرد المركزي عند 350 × ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه الخلية الفائقة و resuspend مع 500 ميكرولتر من خلية تي كاملة المتوسطة. نقل الخلايا إلى لوحة 24-جيدا.
- إضافة 20 PMA 20 و 2 ميكرومول أيونوميسين في 500 ميكرولتر من18 متوسطة كاملة وتخلط جيدا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا.
- إضافة حل المعدة في الخطوة 6.2 في تعليق الخلية في لوحة 24-well ومزيج عن طريق هز لوحة. إعداد التحكم غير المنشط بإضافة 500 ميكرولتر خلية كاملة متوسطة دون إضافة PMA والأيونوميسين في الخلايا. احتضان في حاضنة CO2 في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات.
- إضافة 10 ميكرومول BFA (Brefeldin A، حل مع الميثانول) في كل بئر لمنع جهاز غولجي توسط نقل البروتين. وضع لوحة العودة إلى حاضنة الخلية واحتضان لمدة 2 ساعة.
- تنفيذ تلطيخ علامة سطح الخلية.
- خلايا إعادة بناء عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا ونقل الخلايا إلى أنبوب FACS. إضافة 1 مل من عازلة تلطيخ في أنبوب والطرد المركزي في 350 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية.
- أداء Fc-مستقبلات تلطيخ كتل كخطوة 3.1.4.
- تنفيذ علامات سطح الخلية تلطيخ (الجدول 3) كما هو موضح في الخطوات 3.2.1 إلى 3.2.3 باستثناء خلايا الغسيل مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
- جهاز طرد مركزي عند 350 x ز لمدة 6 دقائق عند 4 درجات مئوية. تجاهل الخلايا الفائقة و resuspend عن طريق النقر على أسفل الأنبوب.
- إضافة 0.2 μL من الكاشف من حية / الميت قابل للإصلاح أكوا خلية الميت تلطيخ عدة واحتضان أنبوب في الظلام في RT لمدة 10 دقيقة لأداء تلطيخ الخلايا الميتة.
- إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب ودوامة على جهاز تذبذب دوامة. جهاز طرد مركزي في 350 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من الفائق.
- تنفيذ تثبيت الخلية كما هو موضح في الخطوتين 5.3 و 5.4.
- إضافة 300 μL من البقع العازلة لالخلايا resuspend وتخزين الأنابيب في ثلاجة 4 ° C بين عشية وضحاها. جهاز طرد مركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية لإزالة فائقة.
ملاحظة: هذه الخطوة قد يكون حذف ثم متابعة الخطوة 6.7 مباشرة بعد الخطوة 6.5. - إضافة 1 مل من العازلة سابونين (تلطيخ العازلة تكملة مع 0.2٪ (ث / الخامس) سابونين) في أنبوب ودوامة على جهاز تذبذب دوامة. احتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة لتنفيذ permeabilization الخلية.
- جهاز طرد مركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق في 4 درجة مئوية والتخلص من الفائق.
- إضافة 0.5 μL من مستقبلات FC-IL21 الإنسان في كل أنبوب. إعداد خليط الأجسام المضادة لعدة خطوة كخطوة 3.1.4 إلا أن تخفيف الأجسام المضادة مع العازلة السابونين بدلا من تلطيخ العازلة.
- احتضان في RT لمدة 1 ساعة مع النقر بلطف أسفل الأنبوب للخلايا ريسوسنيد في 30 دقيقة.
- إضافة 2 مل من العازلة سابونين لغسل الخلايا والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 6 دقائق. تخلص من الغسل الفائق والتكرار مرة واحدة.
- إضافة 0.1 μL من APC-المضادة للإنسان Ig (H + L) في كل أنبوب. إعداد خليط لعينات متعددة كخطوة 3.1.4 إلا أن تخفيف الأجسام المضادة مع العازلة السابونين بدلا من تلطيخ العازلة.
- احتضان العينات على الجليد لمدة 30 دقيقة وغسل كخطوة 6.11.
- خلايا إعادة النيامد مع 400 ميكرولتر من عازلة تلطيخ. إبقاء العينة في الظلام على الجليد حتى تحليل تدفق القياسات.
7. GC B وخلايا البلازما تلطيخ
- اتخاذ الخلايا وتنفيذ الأجسام المضادة المضادة للمستقبلات Fc تلطيخ كخطوات من 3.1.1 إلى 3.1.4.
- أداء علامات السطح تلطيخ (الجدول 4) كخطوات من 3.1.5 إلى 3.1.7 إلا أن وقت الحضانة هو 30 دقيقة بدلاً من 1 ساعة.
- خلايا إعادة النيامد مع 400 ميكرولتر من عازلة تلطيخ. إبقاء العينات في الظلام على الجليد حتى تحليل تدفق القياسات.
8. عزل المصل من الدم
- في اليوم 14 بعد العدوى (d.p.i 14) ، وجمع الدم من وريد الوجه والحفاظ على عينات الدم في ثلاجة 4 °C بين عشية وضحاها.
ملاحظة: تنفيذ جمع الدم في شرط ABSL2 ومن هذه الخطوة فصاعداً يمكن تنفيذ كافة الإجراءات في المختبر العادي. - جهاز طرد مركزي الدم في 400 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. عزل المصل مع ماصة 200 ميكرولتر بعناية لتجنب تلوث الخلايا الحمراء. Aliquot في 3 أنابيب لكل عينة وتخزينها في -80 درجة مئوية.
9. مقايسة من الأجسام المضادة HA محددة تتر مع ELISA
- معطف ELISA لوحات مع 50 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / مل هه حل البروتين في البئر واحتضان لهم في 4 ° C ثلاجة بين عشية وضحاها.
- غسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني المخفف 0.05٪ توين (PBST). إضافة 100 ميكرولتر من PBST المخفف 5٪ الحليب منزوع الدسم في كل بئر واحتضان في RT لمدة 2 ساعة لمنع الربط غير محدد.
- تخفيف واحتضان المصل: إعداد 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني كما عازلة التخفيف. تمييع المصل في عازلة التخفيف كما 1:50, 1:150, 1:450, ...... إلى 1:36450 (يوصى بتخفيف المسلسل 3 أضعاف). أضف 50 ميكرولتر من المصل المخفف لكل بئر وحضن في الثلاجة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
- تخلص من المصل وغسل الآبار بسرعة مرة واحدة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من PBST في كل بئر (اهزها بهدوء ، ثم تجاهلها). ثم غسل ببطء لوحات على شاكر مع 200 ميكرولتر من PBST ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل من.
- إضافة 100 ميكرولتر من مضادة هدبة مضادة الثانوية محددة لIgG مجموع، IgM، IgG1، IgG2b، IgG2c (1:5000، مخففة مع PBST) واحتضان في RT لمدة 1 ساعة. غسل لوحات من قبل PBST كما هو موضح في 9.4.
- قم بأخذ حجم مساوٍ من المخزن المؤقت A و Buffer B (TMB) من 4 درجة مئوية التخزين والاحماء لمدة 30 دقيقة على الأقل في RT قبل الاستخدام. مزيج A وB وإضافة 100 μL من TMB في كل بئر واحتضان لهم لمدة 10-30 دقيقة في RT عن طريق اهتزاز بهدوء.
ملاحظة: هذا وصف مختصر لـ مجموعة الركيزة TMB Set (BD,555214) يدوي. - ماصة 100 ميكرولتر من 2M H2SO4 في كل بئر لإنهاء التفاعل. قراءة قيمة OD450 من خلال الصك.
- تحليل البيانات: الحصول على قيمة OD450 النهائية عن طريق طرح إشارة الخلفية (OD450 قيمة فارغة جيدا). ارسم المنحنى المقابل لنمط ايزوي للأجسام المضادة لكل عينة مع عامل التخفيف على محور X وقيمة OD450 على محور ص.
10. علم الأنسجة
- عزل الطحال في d.p.i 10. إصلاحها في 3.7٪ حل الفورمالديهايد ل 1 ح في RT. تجاهل العازلة التثبيت وغسل مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق على شاكر لمدة ثلاث مرات.
- يجفف الطحال في PBS (10٪ سكروز) في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم يجففها في PBS (30٪ سكروز) في 4 درجة مئوية مع اهتزاز بهدوء حتى تغرق الطحالات إلى أسفل أنبوب 15 مل.
- أخرج الطحال المجففة ، وتضمينها في مركب درجة حرارة القطع الأمثل والمبكوم.
- قبل ابرد الأسيتون في -20 درجة مئوية. احتضان أقسام الأنسجة مع الأسيتون المبردة مسبقا لمدة 10 دقائق. اغسل الأنسجة مع برنامج تلفزيوني لمدة ثلاث مرات.
- Permeabilize أقسام الأنسجة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ تريتون X-100 لمدة 20 دقيقة وغسلها لمدة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
- منع الربط غير محددة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 10٪ مصل الماعز العادي (العازلة منع) لمدة 1 ساعة في RT وغسل أقسام الأنسجة مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة.
- حظر الربط غير المحدد مع مجموعة حظر STREPTAVIDIN/BIOTIN.
ملاحظة: لا تدع العينات تجف من هذه الخطوة فصاعداً. - تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية: إضافة منع العازلة المخفف البيوتين السلطة الوطنية الفلسطينية (25 ميكروغرام / مل) والجرذان المضادة للفأرة IGD (2.5 ميكروغرام / مل) على أقسام الأنسجة بعناية. احتضان أقسام الأنسجة في الغرفة الرطبة في 4 درجات مئوية الفريزر بين عشية وضحاها.
- اغسل بسرعة أقسام الأنسجة مع PBST مرة واحدة. سرعان ما يغسل أقسام الأنسجة في PBST مع اهتزاز ببطء لمدة 5 دقائق. كرر الغسل ثلاث مرات.
- تمييع اليكسا فلور 488-streptavidin (1:500) واليكسا فلور 555- الماعز المضادة الفئران IgG (1:500) الأجسام المضادة مع عازلة حظر وإضافتها إلى أقسام الأنسجة بعناية
- احتضان في RT لمدة 1 ساعة.
- غسل أقسام الأنسجة كخطوة 10.8 وتتصاعد بعناية مع حل إطالة. تغطية الأنسجة مع الأغطية بعناية والاحتفاظ بها في الظلام عند 4 درجة مئوية حتى تحليل confocal.
- تحليل حجم رد فعل GC عن طريق عد أرقام GC لكل حجم المساحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توصيف اعتلال الماوس في عدوى فيروس الأنفلونزا
بعد عدوى فيروس الأنفلونزا، الفئران هي أقل نشاطا وفقدان الشهية بسبب المرض، والذي ينعكس من قبل فقدان الوزن الشديد، وهو عرض شائع الاستخدام لرصد المراضة الماوس19. كما هو مبين في الشكل 1أ، بدأت الفئران المصابة بفيروس PR8 في فقدان الوزن في اليوم 6 ، ووصلت إلى أعلى مستوى خسارة في اليوم 8 وعادت إلى المستوى الأولي في اليوم 10. كما هو متوقع، لم يلاحظ فقدان الوزن طوال الفترة في فئران التحكم المعالجة بـ PBS. ل في أعراض الجسم الحي, عدوى الفيروس يؤدي إلى توسع الخلايا الليمفاوية قوية في العقدة الليمفاوية استنزاف, mLN في هذه الحالة. ولذلك، لوحظ حجم أكبر بكثير من mLNs في الفئران المصابة بالفيروس PR8 مما كانت عليه في الفئران التحكم(الشكل 1b). مجتمعة، أظهرت جميع هذه الفئران الأعراض المتوقعة وكانت مؤهلة لدراسة الاستجابة المناعية اللاحقة المرتبطة بـ Tfh.
الكشف عن التمايز تف والجزيئات المرتبطة بالوظيفة
لتحليل التمايز تف، تم التضحية الفئران في اليوم 5 و 7 و 10 و 14 بعد العدوى وتم عزل mLNs أو الطحال لتحليل تدفق قياس الخلايا. الشكل 2a والشكل 2B تظهر استراتيجية الغات السكان Tfh، مع Tfh مسور كD-1مرحبا CXCR5 خلايامرحبا وغير Tfh كما PD-1منخفضةCXCR5 الخلاياالمنخفضة. مع هذه الاستراتيجية الغات، تم فحص حركية تمايز تف أثناء عدوى فيروس الأنفلونزا. كما هو مبين في الشكل 2c، التمايز Tfh تهيئة في اليوم 5 وبلغت ذروتها في اليوم 10. لذا أخذنا عينات من اليوم العاشر لمزيد من التحليل. كما هو مبين في الشكل 3a، تم التمايز القوي لخلايا Tfh في الفئران المصابة بفيروس الإنفلونزا مقارنة بفئران التحكم. لتحليل الأنفلونزا فيروس محدد خلايا تف، الفلوروكرروم المسمى IAbNP311-325 MHC فئة II tetramers (NP311-325)أضيفت في بوليكلان خلايا تف تلطيخ لوحة(الجدول 1). سواء في mLNs والطحالات من الفئران المصابة بفيروس الانفلونزا ، NP311-325- CD4+ T محددة الخلايا التي تم إحداثها بشكل كبير وNP311-325- محددة Tfh الخلايا يمكن تحليلها عن طريق إضافة PD -1 و CXCR5 في التحليل (الشكل 3e). بسبب الأدوار الأساسية لBcl6 في التمايز تف، Bcl6+CXCR5+ الخلايا يمكن أن تمثل أيضا السكان Tfh. باستمرار، تم حث خلايا تفه التي تم تحديدها مع هذه الاستراتيجية أيضا بقوة (الشكل 3b). قمنا بتحليل المزيد من التعبير عن Bcl6 في خلايا Tfh وغير Tfh. كما هو مبين في الشكل 3c، أعلى تعبير من Bcl6 في خلايا تفه مما هو عليه في الخلايا غير Tfh يشير إلى تلطيخ Bcl6 ناجحة. مع استراتيجية مماثلة، ICOS، آخر جزيء المرتبطة Tfh تم تحليلها أيضا (الشكل 3d). نظرا للدور المتخصص للخلايا تفه في تقديم المساعدة لخلايا B، يمكن أن تكشف عن فحص التعبير من IL21، والتي تفرز أساسا من قبل خلايا تفه وأظهرت لتنظيم خلايا B مباشرة البقاء والانتشار، تكشف خلايا تفه وظيفة إلى حد ما. كما هو مبين في الشكل 3F، كشف تلطيخ داخل الخلايا من IL21 أن عدوى PR8 تسببت في إنتاج أعلى بكثير من هذا السيتوكين ، مع الخلايا غير المستحثة كتحكم في الغاءات. معا، يمكن أن تعكس هذه المقايسات المعلومات الأساسية للتمايز تفه وتوفير رؤى في قدرة مساعدة الخلية B.
الكشف عن GC B والخلايا البلازما تطوير ونزلة انفلونزا المضادة للفيروسات محددة في المصل
الوظيفة الرئيسية لخلايا تفه هي توفير مساعدة الخلية B في GCs، حيث يحدث تبديل فئة الأجسام المضادة ونضوج التقارب. حتى GC B التنمية يمكن أن تعكس بشكل غير مباشر التمايز ووظيفه خلايا تف. يمكن أن تكون مسور الخلايا GC B كما B220+السلطة الوطنية الفلسطينية+فاس+ الخلايا(الشكل 2d). من خلال هذه الاستراتيجية الجاتينغ، ونحن مقهّد الحركة من استجابة الخلية B GC ووجد أن GC B الاستجابة بدأت في اليوم 10 واستمرت في الزيادة في اليوم 14(الشكل 2e). وأظهرت المقارنة بين PR8 المصابة بالفيروس وفئران مكافحة الإيدز GC B قوية تم حثها في كل من mLN والطحال بعد عدوى فيروس الأنفلونزا (الشكل 4a)، وهو ما يتفق مع التمايز المستحث Tfh في الفئران المصابة بفيروس PRB. وبالإضافة إلى ذلك، وصمة Immunofluorescence مع IGD والسلطة الوطنية الفلسطينية يوفر صورا متصورة تشير إلى تفاعل GC المستحث (المناطق الخضراء) في الفئران المصابة بالفيروس PR8(الشكل 4d). خلايا البلازما، التي تم تحديدها كـ CD138 + خلايامنخفضةIgD(الشكل 2d)، تم إنشاؤها أيضًا في الفئران المصابة بفيروس PR8 (الشكل 4b). وقد حددت الدراسات السابقة أن IFNƳ وIL21 يمكن أن تفرز من كل من الخلايا Th1 وTfh في عدوى الفيروس والحث على IgG2 و IgG1 فئة التبديل، على التوالي20. 4c الشكل يصور جيل من الأجسام المضادة لفيروس الأنفلونزا محددة من قبل ELISA مقايسة من IGM ها محددة، مجموع IgG، IgG1، IgG2b وIgG2C. معا، كل هذه المقايسات تعكس استجابات الخلية B المرتبطة ب Tfh في عدوى فيروس الأنفلونزا.
الشكل 1: توصيف اعتلال الماوس. أصيب فئران الذكور البالغ من العمر 8 أسابيع مع 40 PFU من فيروس الأنفلونزا PR8 عن طريق التلقيح داخل الأنف. كانت وزنها فئران يوميا لمدة 10 أيام (أ) وتم عزل mLNs على d.p.i 10 (ب). تمثل أشرطة الخطأ في (a) المتوسط ± SD. n = 4 ماوس لكل مجموعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استراتيجية جاتينغ لخلايا تفه والخلايا B GC. (أ)يتم تعريف الخلايا الليمفاوية من قبل FSC-A و SSC-A، ويتم بوابات العزب الخلية مع FSC-A، FSC-H وSSC-A، SSC-W. (ب) بعد gating في CD4+ الخلايا T، وتستخدم علامات سطح CD62L وD44 للتمييز بين الخلايا التائية الساذجة (CD44لوCD62Lمرحبا)والخلايا التائية تنشيط (CD44مرحباCD62Lلو). يمكن أن تكون بسور Polyclonal Tfh الخلايا من الخلايا التائية المنشط كما PD-1مرحبا CXCR5السكان مرحبا, على العكس, غير Tfh الخلايا كما PD-1منخفضةCXCR5منخفضة. PR8 فيروس محددة خلايا تفه كما يتم تعريف CD4+CD44+ NP311-325 tetramer+PD-1مرحبا CXCR5 الخلايامرحبا. (ج،ه) الحركية من التردد تف في الخلايا المنشطة (ج) و GC B تردد في B220+ الخلايا(ه). (د)يتم بوابات خلايا GC B كما B220+ PNA+FAS+ الخلايا، وخلايا البلازما هي IGD-CD138+ الخلايا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل تمايز الـ Tfh في الفئران المصابة بالفيروس PR8. تم التضحية الفئران على d.p.i 10 وتم عزل mLNs والطحال لتحليل التمايز تف. (أ)نسبة Tfh في mLNs والطحال في الفئران المصابة بفيروس PR8 والفئران المعالجة PBS (اللوحة العلوية). إحصاءات خلايا تفه (لوحة السفلي). (ب) تلطيخ داخل الخلايا من Bcl6 في CD4+CD44مرحبا الخلايا التائية (اللوحة العليا). إحصاءات Bcl6+CXCR5+ الخلايا (لوحة السفلي). (ج) Bcl6 و (d) ICOS التعبير في تف (خط أحمر) وغير Tfh الخلايا (الصلبة الرمادي). (ه) جاتينغ من NP311-325-محددة CD4+ الخلايا T في mLNs والطحالات من PR8 فيروس المصابة وBBS- فئران المعالجة (لوحة اليسرى). النسبة المئوية للخلايا TFH الخاصة بفيروس PR8 في الطبقات اللينية والطحال (اللوحة الوسطى). "Isotype" يشير إلى تلطيخ مع التحكم رباعية المامر غير ذي صلة. إحصاءات NP311-325-CD4 محددة+ الخلايا T (اللوحة اليمنى). (و) تلطيخ داخل الخلايا من IL-21 في CD4+ T الخلايا من PR8 المصابة بالفيروسات و الفئران المعالجة PBS، و unstimulation كما هو مبين على أنها السيطرة (يسار). الإحصاءات من تلطيخ IL-21 (يمين). ** P < 0.01، *** P < 0.001 و **** P < 0.0001 (اختبار t-الطالب الذيلين). تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SD. n = 3 ماوس لكل مجموعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل الاستجابة المرتبطة بخلايا GC B في الفئران المصابة بالفيروس PR8. تم التضحية بالفئران على d.p.i 10 وتم عزل الـ mLNs والطحال للتحليل. (أ)النسبة المئوية للخلايا GC B (اللوحة العليا). إحصاءات خلايا GC B (اللوحة السفلية). (ب)النسبة المئوية للخلايا البلازما (اللوحة العليا). إحصاءات خلايا البلازما (اللوحة السفلية). (ج)القياس الكمي لفيروس PR8 HA-محددة IgG، IgM، IgG1، IgG2b وIgG2c في المصل (d.p.i 14) من الفئران المصابة بفيروس PR8 والفئران المعالجة PBS. (د)المجهر المجهري من بصيلات الخلية B (IGD+، الأحمر) وGCs (السلطة الوطنية+، الأخضر) في عينات الطحال من الفئران المصابة بفيروس PR8 والفئران المعالجة PBS (d.p.i 10). * P < 0.5، **P < 0.01، و ***P < 0.001 (اختبار t-الطالب ذو الذيلين). تمثل أشرطة الخطأ متوسط ± SD. n = 3 ماوس لكل مجموعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| علامة سطح | الفلوروكرروم | استنساخ | حجم لكل عينة (ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | eVolve 605 | IM7 | 0.2 |
| CD62L | FITC | ميل-14 | 0.2 |
| ICOS | BV421 | 7E.17G9 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| ستربتاد الدين | PE | 0.2 |
الجدول 1: علامة السطح (باستثناء CXCR5) الأجسام المضادة لوحة لتلوين خلايا تف (PD-1مرحباCXCR5مرحبا).
| علامة سطح | الفلوروكرروم | استنساخ | حجم لكل عينة (ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | IM7 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| ستربتاد الدين | BV421 | 0.5 |
الجدول 2: الأجسام المضادة لعلامة السطح (باستثناء CXCR5) لوحة لتلوين Bcl6 في خلايا تف.
| علامة سطح | الفلوروكرروم | استنساخ | حجم لكل عينة (ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | IM7 | 0.2 |
الجدول 3: لوحة الأجسام المضادة لعلامة السطح للتلوين داخل الخلايا من IL21.
| علامة سطح | الفلوروكرروم | استنساخ | حجم لكل عينة (ul) |
| B220 | APC | RA3-6B2 | 0.2 |
| IGD | eFluor 450 | 11-26ج | 0.2 |
| CD95 | PE/Cy7 | Jo2 | 0.3 |
| السلطة الوطنية الفلسطينية | FITC | 0.3 | |
| CD138 | PE | 281-2 | 0.2 |
الجدول 4: لوحة الأجسام المضادة لعلامة السطح لتلوين GC B والخلايا B البلازما.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ونظراً للأدوار المتخصصة في توفير المساعدة في الخلية ب لتوليد أجسام مضادة عالية التقارب، فقد تمت دراسة خلايا الت إفه على نطاق واسع في آليات التمايز والتلاعب لتوفير استراتيجيات جديدة لتصميم اللقاحات. إن عدوى فيروس الأنفلونزا تحفز استجابات خلايا تفه و GC B القوية، وبالتالي فهي نموذج مناسب لهذا المجال من البحوث. في هذه الورقة، وصفنا بروتوكولات عدوى فيروس الأنفلونزا عن طريق التلقيح داخل الأنف، وتقييم الاستجابة المرتبطة بـ Tfh عن طريق قياس التدفق، والflufluorescence و ELISA. وستسهل هذه الأقوال اكتشاف تمايز تفه، وتطوير GC B، والأجسام المضادة الخاصة بفيروس الإنفلونزا، وتساعد الباحثين على استكشاف وتحديد جزيئات جديدة حاسمة في الاستجابة المناعية.
في الدراسات التي أجريت مع نماذج الفئران المصابة بفيروس الإنفلونزا، فقدان الوزن هو مؤشر شائع الاستخدام لمراضة الفئران. وتغيّر الوزن المتوقع في الفئران المصابة بفيروس الإنفلونزا هو كما هو موضح في الشكل 1أ،الذي يعكس الاستجابة المناعية المناسبة التي يتم الحث عليها في الفئران. ومع ذلك ، فإن الحالات غير الطبيعية تحدث بانتظام ، حيث تفقد الفئران وزنها أو لا تظهر أي انخفاض في الوزن طوال فترة المراقبة. وفقا لتجاربنا، فإن هذه الفئران تحمل في الغالب استجابة مناعية أقل أو أعلى غير طبيعية، وبالتالي تعطيل نتائج التجربة. لتجنب مثل هذه الاختلافات، أولاً يجب أن تكون الفئران المستخدمة في التجربة الجنس ومطابقة العمر لضمان قدرة مماثلة استجابة للفيروس. ثابت titer الفيروس لكل فأر هو أيضا المهم21. titer الفيروس المستخدمة في هذا البروتوكول هو 40 PFU. ومع ذلك، يمكن أن يكون titer الفيروس للحث على تغيير الوزن المناسب الحركية في كل مختبر متغيرة بسبب عدم الاتساق في إجراء تقييم تيتر الفيروس وسلالات الماوس المستخدمة في التجربة. لذلك ننصح المعايرة من تتر الفيروس للعدوى ضروري قبل دراسة الاستجابة المناعية ذات الصلة.
في هذا البروتوكول، حددنا خلايا تف مع علامات تستخدم بشكل متكرر PD-1، CXCR5 وعامل النسخ الأساسية Bcl6. على الرغم من أن كلا من PD-1مرحباCXCR5مرحبا وBcl6+CXCR5+ الخلايا يمكن أن يرمز كخلايا تف، وأنها تمثل سكانا مختلفين وليس لديهم علاقة السلائف السلائف على أساس حقيقة أن ليس كل PD-1مرحباCXCR5 مرحبا الخلايا هي Bcl6+ وليس كل الخلاياBcl6 +CXCR5 مرحبا هي PD-1hiCXCR5مرحبا. يمكن تفسير هذا النمط الظاهري من خلال عدم تجانس التعبير Bcl6 في خلايا Tfh22. وينبغي أيضا تضمين ICOS، جزيء حاسم لكل من التمايز Tfh والهجرة في تحليل التمايز تف. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي أيضا الكشف عن الجزيئات الأخرى المرتبطة بالدالة المشتركة، مثل OX40 و CD40L لمستوى التعبير، وإن لم تكن مدرجة في هذا البروتوكول. IL21 و IL4 كلاهما سيتوكينات سرية Tfh تلعب الأدوار في تحفيز التبديل فئة IgG1. بروتوكول الكشف عن التعبير IL21 هو موضح في هذه الورقة. ومع ذلك ، نظرا لصعوبة في الكشف عن IL4 في خلايا تف ، IL4 - GFP فئران مراسل استخدمت في الدراسات السابقة23. في هذا البروتوكول، استخدمنا أيضًا رباعيات NP التي تحمل اسم الفلوروكرروم للكشف عن خلايا NP311-325-محددةمن Tfh. ومع ذلك، فإن الحد في كمية NP311-325-خلايا تف محددة يمنح صعوبة في مزيد من التحليل. ولذلك، فإن تجربة نقل بالتبني من hemagglutinin أنفلونزا محددة TCR المعدلة وراثيا (TG) CD4+ (TS-1) الخلايا التائية، والتي يمكن عزلها عن الفئران TS-1، هو استراتيجية بديلة في حل هذه المشكلة24.
هنا حددنا GC B كما B220+السلطة الوطنية الفلسطينية+فاس+ الخلايا في التلطخ تدفق الخلايا. وهناك استراتيجية بديلة تركيبة علامة لتعريف GC B كما GL7مرحباFAS مرحبا الخلايا المستخدمة أيضا في أوراق أخرى14,16. كما نستخدم الفلور المناعية لتصور ال GCs مع مزيج من مكافحة IGD والسلطة الوطنية الفلسطينية. هنا إضافة للأجسام المضادة CD3 يمكن أن تساعد في تصور خلايا تف، وبالتالي تمكين دراسة التفاعل بين هذين النوعين من الخلايا10.
نظرا لتمايز خلايا تف هو عملية متعددة المراحل ومتعددة العوامل، إضافية من الجزيئات الهامة الأخرى في نقاط زمنية متعددة ضروري لتوضيح آلية أكثر تفصيلا في التمايز تف. وبالإضافة إلى ذلك، المعلمات التي تم الكشف عنها هنا هي أيضا شائعة الاستخدام في نماذج أخرى18. لذلك ، إلى جانب الإصابة بفيروس الإنفلونزا ، يمكن للبروتوكولات الموصوفة هنا ، وخاصة الجزء المثبط للمناعة ، تقديم تعليمات في دراسة مرتبطة بـ Tfh مع نماذج أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
نشكر موظفي مرفق تدفق استئصال الدراجات ، ومرفق ABSL2 ومرفق الحيوانات SPF من معهد باستور في شنغهاي على مساعدتهم التقنية والمشورة. وقد دعم هذا العمل المنح التالية: برنامج البحوث الاستراتيجية ذات الأولوية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDB29030103)، البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2016YFA0502202)، المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31570886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
