Summary
Este documento describe los protocolos de evaluación de la respuesta Tfh y GC B en el modelo de ratón de infección por el virus de la gripe.
Abstract
Las células T Follicular Helper (Tfh) son un subconjunto independiente de células CD4+ T especializado en proporcionar ayuda para el desarrollo del centro germinal (GC) y la generación de anticuerpos de alta afinidad. En la infección por el virus de la gripe, se inducen respuestas sólidas de células Tfh y GC B para facilitar la erradicación eficaz del virus, lo que confiere un modelo de ratón cualificado para el estudio asociado a Tfh. En este artículo, describimos protocolos en la detección de la respuesta inmune básica asociada a Tfh durante la infección por el virus de la gripe en ratones. Estos protocolos incluyen: inoculación intranasal del virus de la gripe; flujo de tinción de citometría y análisis de células Tfh policlonales y específicas de antígenos, células GC B y células plasmáticas; detección de inmunofluorescencia de GCs; ensayo inmunosorbente vinculado a enzimas (ELISA) de anticuerpos específicos del virus de la gripe en suero. Estos ensayos básicamente cuantifican la diferenciación y la función de las células Tfh en la infección por el virus de la gripe, proporcionando así ayuda para estudios sobre el mecanismo de diferenciación y estrategia de manipulación.
Introduction
En la última década, numerosos estudios se han centrado en el subconjunto de células CD4+ T recientemente identificado, subconjunto de células Tfh, por sus funciones esenciales en el desarrollo del centro germinal (GC) B. El linfoma de células B 6 (Bcl6), que se considera principalmente como represor genético, es el factor definitorio del linaje de las células Tfh para la evidencia de que la expresión ectopic de Bcl6 es suficiente para impulsar la diferenciación tfh, mientras que la deficiencia de Bcl6 resulta en la diferenciación tfh desaparecida1,2,3. A diferencia de otros subconjuntos auxiliares CD4+ T que realizan su función de efector mediante la migración a los sitios de inflamación, las células Tfh proporcionan la ayuda celular B principalmente en la zona folicular de células B de bazo y ganglio linfático. Las moléculas co-estimulantes ICOS y CD40L, desempeñan un papel significativo en la interacción entre las células Tfh y GC B. Durante la diferenciación tfh, ICOS transmite las señales necesarias de las células B del cognato y también actúa como un receptor que recibe señales de migración de las células B del transeúnte para la localización de la zona celular B4,5. CD40L es un mediador de señales de células Tfh para la proliferación de células B y supervivencia6. Otro factor que juega el papel similar a CD40L es la citoquina IL21, que es secreta principalmente por las células Tfh. IL21 regula directamente el desarrollo de células GC B y la producción de anticuerpos de alta afinidad, pero su papel en la diferenciación de Tfh sigue siendo controvertido7,8. PD-1 y CXCR5, que ahora se utilizan con mayor frecuencia en la identificación de células Tfh en el análisis de citometría de flujo, también desempeñan un papel significativo en la diferenciación y función de este subconjunto. CXCR5 es el receptor de la quimiocina folicular de células B y media la localización de células Tfh en folículos celulares B9. Pd-1 ahora se identifica no sólo para tener la función de orientación folicular, sino también transmitir señales críticas en el proceso de maduración de afinidad de células GC B10. Sobre la base de estos hallazgos, evaluar la expresión de estas moléculas podría básicamente reflejar la maduración y la función de las células Tfh.
El GC es una estructura microanatomical transitoria inducida en órganos linfoides secundarios y altamente dependiente de las células Tfh, siendo así una lectura perfecta para evaluar la respuesta de Tfh. En GC, después de recibir señales mediadas por citoquinas y moléculas co-estimulantes, las células B están sujetas a conmutación de clases e hipermutación somática para generar anticuerpos de alta afinidad11. La conmutación diferencial de la clase de anticuerpos se produce en el nicho diferencial de citoquinas, en el que IL4 e IL21 inducen la conmutación de la clase IgG1 mientras que el IFNḥ induce el cambio de clase IgG212. Las células plasmáticas son los productores de anticuerpos secretos y son células diferenciadas terminalmente. Al igual que las células Tfh, el desarrollo de células B en GC se asocia con la expresión dinámica de muchas moléculas significativas. Según el estudio actual, las células GC B se pueden identificar como B220+PNA+Fas+ o B220+GL7+Fas+ células y células plasmáticas, en comparación con sus precursores, expresión downregulate de B220 y cd138 upregulate expresión133. Además, ambas características se pueden detectar en el análisis de citometría de flujo e inmunofluorescencia, siendo así una evaluación adecuada de la respuesta de GC.
Respuestas celulares y humorales robustas son inducidas en la infección por el virus de la gripe, con células Tfh y Th1 dominando CD4+ T respuesta celular14,lo que lo convierte en un modelo perfecto para el estudio de diferenciación de células Tfh. Influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), que es una cepa adaptada al ratón de uso común, se utiliza con frecuencia en este estudio14,15,16. Aquí, describimos algunos protocolos básicos del ensayo relevante para el estudio de Tfh en la infección por el virus de la gripe: 1) inoculación intranasal del virus PR8; 2) células Tfh específicas de antígenos, células GC B y plasma y detección IL21 con citometría de flujo; 3) visualización histológica de GC; 4) detección de titer de anticuerpos específicos de antígenos en suero con ELISA. Estos protocolos proporcionan las técnicas necesarias para nuevos investigadores en el estudio asociado a Tfh.
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Protocol
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Institut Pasteur de Shanghai, China. Todos los experimentos se realizaron sobre la base de los protocolos de animales aprobados por la Comisión Institucional de Cuidado y Uso de Animales.
NOTA: La infección por virus de ratones y el aislamiento de órganos deben realizarse bajo condición ABSL2.
1. Inoculación del virus de la gripe PR8 y registro del peso de los ratones
- Prepare ratones C57BL/6 machos de 8 semanas para la infección en la habitación ABSL2.
NOTA: Este protocolo también es adecuado en experimentos con ratones hembra. - Dilución del virus PR8:eliminar el virus del congelador -80 °C e incubar en hielo hasta que se derrita en líquido. Vórtice el virus de stock a fondo y diluir el virus a 2 PFU/μL con solución salina estéril amortiguada por fosfato (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4)en un tubo preenfriado de 1,5 ml.
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Anestesia de ratones: pesar cada ratón y calcular el volumen (4 veces (μL) del peso del ratón (g)) del pentobarbital sódico (2 mg/ml) a utilizar. Inyecte el volumen calculado de pentobarbital sódico por vía intraperitoneally.
NOTA: Este paso es hacer que los ratones respiren de forma constante y pacífica, para que el titer preciso del virus pueda inocularse por vía intranástica. Los latidos cardíacos demasiado rápidos o lentos indican una anestesia inadecuada. Además, se recomienda el uso de ungüento veterinario para evitar la sequedad ocular. - Inoculación intranasal: vórtice el virus PR8 diluido a fondo. Pipetear 10 μL y realizar cuidadosamente la inoculación intranasal en un lado gota a gota. Después de terminar la inoculación de todos los ratones en una jaula (máximo 5 ratones) en este lado, repita la inoculación en el otro lado (mantenga la respiración del ratón pacífica y constante durante toda la inoculación). Cada ratón está infectado con 40 PFU del virus PR8 en total.
- Coloque a los ratones en recumbencia severa en jaulas calientes para un mejor renacimiento.
- Monitoree el peso del ratón diariamente durante 10 días. (El día de la infección se registra como día 0).
2. Aislamiento de linfocitos del bazo y el ganglio linfático mediastinal (mLN)
- Eutanasia del ratón: poner a los ratones en una cámara pequeña y eutanasiar a los ratones bombeando en CO2 pacíficamente desde el fondo de la cámara. Saque a los ratones cuando no se muevan y realice la dislocación cervical para asegurarse de que los ratones mueran por completo. Sumerja los ratones con un 75% de etanol y transfiéralos a la campana de la bioseguridad.
- Inmovilice a los ratones con agujas de disección en la absorbente placa de espuma de disección cubierta de papel. Corta la piel a lo largo de la línea media abdominal y las patas traseras con tijeras de disección y estira la piel con pinzas. Inmovilizar la piel estirada con agujas de disección.
- Prepare dos platos de 6 cm para cada ratón y guárdalos en el hielo. Poner un colador celular de 70-μm en cada plato y añadir 5 ml de DMEM complementado con 1% suero bovino fetal (DMEM (1% FBS))
- Aislamiento del bazo: corte el peritoneo para exponer la cavidad abdominal con tijeras de disección. Toma el bazo y ponlo en el plato preparado.
- aislamiento mLN: cortar el diafragma y la parte inferior de la costilla de la jaula a las proximidades de timo. Tire de la costilla a un lado y colóquela con agujas de disección para exponer la cavidad torácica. Tire del pulmón hacia el lado derecho y use pinzas para tomar mLN, debajo del corazón y cerca del lado ventral de la tráquea.
- Ponga el mLN en el plato preparado.
- Obtener las suspensiones de una sola célula: mallar el bazo o mLN suavemente con un émbolo de jeringa de 3 ml a través del colador de células de 70-μm. Enjuague el colador de células con 1 ml de DMEM fresco (1% FBS). Resuspend la suspensión celular y transferir a un tubo centrífuga de 15 ml.
- Centrífuga la suspensión celular a 350 x g durante 6 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de DMEM (1% FBS).
- Resuspend el pellet celular con 1 mL-pipeta a fondo. Agregue 4 ml de DMEM (1% FBS) en suspensiones de células de bazo y guárdelos en hielo para las siguientes operaciones.
NOTA: Es necesario resuspend el pellet celular con 1 ml de medio en primer lugar, no 5 ml, para aislar completamente las células individuales del pellet.
A partir de este paso, todas las operaciones se pueden realizar en el laboratorio normal. -
Recuento de células de bazo
- Resuspend células girando los tubos hacia arriba y hacia abajo durante varias veces. Tome 10 μL en 90 μL de tampón de lisis de glóbulos rojos (RBC) (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 155mM NH4Cl). Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 3 min y añadir 900 μL de PBS frío para terminar la reacción.
- Centrífuga a 400 x g durante 6 min a 4 °C y retire el sobrenadante. Resuspend con 100 μL de PBS frío. Tomar 10 μL de células en 10 μL de 0.4% w/v trypan azul y tomar 10 μL de la mezcla para el conteo celular con el hemociclo.
- Cálculo: calcule las celdas como método normal. En resumen, cuente los números de celda en dos cuadrados de esquina diagonales en el hemociclo y obtenga N1, N2 para cada cuadrado de esquina. La concentración celular de la suspensión celular de 5 ml debe calcularse como (N1+N2)/2 x 104 /mL.
3. Inmunodetención de células Tfh policlonales con PD-1 y CXCR5
- Tinción con anticuerpo biotina-anti-CXCR5.
- Resuspend suspensiones celulares girando el tubo hacia arriba y hacia abajo. Tome 2 x 106 células en el tubo FACS y agregue 2 ml de búfer de tinción (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). Lavar por vórtice en el dispositivo de oscilación de vórtice.
- Centrífuga a 350 x g durante 6 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante vertiendo el líquido y sumerja la boca del tubo en el papel absorbente dos veces.
- Afloje el pellet celular con el líquido de residuos tocando la parte inferior del tubo. Coloque el tubo en el soporte del tubo sobre hielo.
NOTA: El volumen de líquido de residuos es de aproximadamente 25 μL. - Añadir 0,2 μL de CD16/CD32 anti-ratón (bloqueador de receptores Fc) para cada tubo. Vórtice tocando suavemente el fondo del tubo e incubando en hielo durante 10 minutos.
NOTA: Preparar la mezcla de anticuerpos para múltiples muestras mediante dilución con 5μL de tampone de tinción para cada tubo. La receta de mezcla debe prepararse diluyendo (n/10+1) x 0,2 μL De bloqueador de receptores fc en (n/10+1) x 5 μL de tinción y añadir 5,2 μL de mezcla en cada tubo. - Añadir 0,3 μL de ratón anti-biotina CXCR5 en el residuo 30 μL de amortiguador de tinción para cada tubo y vórtice tocando la parte inferior del tubo.
NOTA: Preparar la mezcla como se describe en el paso 3.1.4. - Incubar sobre hielo durante 1 h con células de resuspending suavemente tocando el tubo a 30 min.
NOTA: Vórtice a 30 min es para evitar agregados celulares para una mejor tinción. - Agregue 2 ml de búfer de tinción y vórtice en el dispositivo de oscilación de vórtice. Centrífuga a 350 x g durante 6 min a 4 °C y deseche el sobrenadante como se describe en el paso 3.1.2. Vórtice tocando el tubo e incubando en hielo para su posterior tinción.
- Tinción con otros marcadores de superficie.
- Preparar mezcla de anticuerpos (Tabla 1) como se describe en el paso 3.1.4.
- Agregue la mezcla de anticuerpos a cada tubo. Vórtice tocando la parte inferior del tubo e incubando en hielo durante 30 minutos.
- Lave las células con 2 ml de amortiguador de tinción. Centrífuga a 350 x g durante 6 min a 4 °C.
- Deseche el sobrenadante y agregue 400 μL de amortiguador de tinción. Vórtice el tubo en el dispositivo de oscilación de vórtice y mantener el tubo en oscuro hasta el análisis de citometría de flujo.
4. Inmunodetención de células Tfh específicas del virus de la gripe PR8 NP
NOTA: Este protocolo de tinción de células Tfh específicas np es de estudios anteriores15,17.
- Realice la tinción de biotina-CXCR5 como se describe en el paso 3.1, excepto que el número de celda tomado para la tinción es de 3 x 106 para que se registren suficientes células específicas de antígeno en la citometría de flujo.
- Añadir 0,3 μL de tetramero APC-conjugado-IAbNP311-325 MHC clase II (NP311-325)en el tubo de 3.1.7. Preparar la mezcla para múltiples muestras como en el paso 3.1.4
NOTA: Es importante manchar el tetramer antes de la adición de anticuerpos anti-CD4, ya que la unión entre cd4 y anticuerpo anti-CD4 interferiría la tinción óptima del tetramer. - Resuspend la mezcla celular tocando suavemente el tubo e incubar en la oscuridad a RT durante 30 min.
NOTA: Cubra un papel mojado en la boca de los tubos para disminuir la evaporación - Agregue la mezcla de otros marcadores de superficie(Tabla 1)y continúe incubando en RT durante 30 min.
- Lave y resuspend las células como se describe en los pasos 3.2.3 y 3.2.4.
5. Inmunodetención de Bcl6 en células tfh policlnales
- Realice la tinción de marcadores de superficie(Tabla 2)como se describe en la sección 3, excepto que el último lavado con 2 ml de PBS, en lugar del búfer de tinción.
- Centrífuga a 350 x g durante 6 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y los pellets celulares resuspend tocando suavemente la parte inferior del tubo.
- Añadir 300 μL de solución de formaldehído al 3,7% (diluida a partir de un formaldehído del 37% con PBS) en el tubo para la fijación celular. Vórtice en el dispositivo de oscilación de vórtice e incubar en RT durante 20 min.
- Añadir 2 ml de amortiguador de tinción para lavado y centrífuga a 500 x g durante 6 minutos a 4 °C. Deseche el sobrenadante y las células resuspend tocando suavemente el tubo.
- Añadir 300 μL de 0.2% Triton-X 100 y resuspend células por vórtice en el dispositivo de oscilación de vórtice. Incuba en RT durante 15 minutos.
- Agregue 2 ml de amortiguador de tinción para lavar. Centrífuga a 500 x g durante 6 min a 4 °C. Deseche las células sobrenadantes y resuspend tocando suavemente la parte inferior del tubo.
- Añadir 1,5 μL de anticuerpo PE-anti-Bcl6 para cada tubo. Toque suavemente la parte inferior del tubo para resuspend la mezcla e incubar en RT durante 2 h con tocar suavemente el tubo cada 30 minutos.
NOTA: Cubra un papel mojado en la boca de los tubos para disminuir la evaporación de la mezcla. - Añadir 2 mL de PBS complementado con 0.01% Triton-X 100 en el tubo. Vórtice y centrífuga a 500 x g durante 6 min a 4 °C.
- Repita el lavado como paso 5.8. Células resuspend con 400 μL de tampone de tinción. Mantenga las células en la oscuridad sobre el hielo hasta el análisis de la citometría de flujo.
6. Tinción intracelular de IL21
- Estimular las células con PMA (phorbol 12-myristate 13-acetato) e ionomicina.
- Tome 2 x 106 células de suspensión de células esplenicas y centrífuga a 350 x g durante 6 minutos a 4 °C. Deseche el sobrenadante y el pellet de celda resuspend con 500 μL de medio completo de células T. Transfiera las celdas a la placa de 24 pozos.
- Añadir 20 nmol PMA y 2 μmol ionomycina en 500 μL de medio completo18 y mezclar bien pipeteando arriba y abajo.
- Agregue la solución preparada en el paso 6.2 en la suspensión celular en la placa de 24 pozos y mezcle agitando la placa. Configure el control no atenuado añadiendo 500 μL de medio completo de células T sin adición de PMA e ionomycina en las células. Incubar en una incubadora de CO2 a 37°C durante 4 h.
- Añadir 10 μmol BFA (Brefeldina A, disuelto con metanol) en cada pozo para bloquear el transporte de proteínas mediada por el aparato Golgi. Vuelva a colocar el plato en la incubadora de celdas e incubar durante 2 h.
- Realice la tinción del marcador de superficie celular.
- Resuspend células canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo y transfiriendo las células a un tubo FACS. Añadir 1 ml de amortiguador de tinción en el tubo y centrífuga a 350 x g durante 6 minutos a 4 °C.
- Realice la tinción del bloqueador de receptores Fc como paso 3.1.4.
- Realice la tinción de marcadores de superficie celular(Tabla 3)como se describe en los pasos 3.2.1 a 3.2.3, excepto las células de lavado con 2 ml de PBS.
- Centrífuga a 350 x g durante 6 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y las células resuspend tocando la parte inferior del tubo.
- Agregue 0,2 μL de reactivo del kit de tinción Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell e incuba el tubo en la oscuridad en RT durante 10 minutos para realizar la tinción de las células muertas.
- Añadir 2 ml de PBS en el tubo y vórtice en el dispositivo de oscilación de vórtice. Centrífuga a 350 x g durante 6 min a 4 °C y deseche el sobrenadante.
- Realice la fijación de celdas como se describe en los pasos 5.3 y 5.4.
- Agregue 300 μL de tampone de tinción a las células resuspend y almacene los tubos en el refrigerador de 4 °C durante la noche. Centrífuga a 500 x g durante 6 min a 4 °C para eliminar el sobrenadante.
NOTA: Este paso podría omitirse y continuar con el paso 6.7 directamente siguiendo el paso 6.5. - Añadir 1 ml de tampón de saponina (búfer de tinción complementado con 0,2% (w/v) saponina) en el tubo y vórtice en el dispositivo de oscilación de vórtice. Incubar en hielo durante 20 minutos para realizar la permeabilización celular.
- Centrífuga a 500 x g durante 6 min a 4 °C y deseche el sobrenadante.
- Añadir 0,5 μL de receptor fc-IL21 humano en cada tubo. Prepare la mezcla de anticuerpos para múltiples como paso 3.1.4 excepto ese anticuerpo diluido con tampón de saponina en lugar de amortiguador de tinción.
- Incubar en RT durante 1 h con suavemente tocando la parte inferior del tubo para resuspend celdas a 30 min.
- Agregue 2 ml de tampón de saponina para lavar las células y la centrífuga a 500 x g durante 6 minutos. Deseche el sobrenadante y repita el lavado una vez.
- Añadir 0,1 μL de APC-anti-humano Ig(H+L) en cada tubo. Preparar la mezcla para múltiples muestras como paso 3.1.4 excepto ese anticuerpo diluido con tampón de saponina en lugar de amortiguador de tinción.
- Incubar las muestras en hielo durante 30 min. y lavar como paso 6.11.
- Células resuspend con 400 μL de tampone de tinción. Mantenga la muestra en la oscuridad sobre hielo hasta el análisis de citometría de flujo.
7. GC B y células plasmáticas manchadas
- Tome células y realice la tinción de anticuerpos anti-Fc-receptor como pasos de 3.1.1 a 3.1.4.
- Realice la tinción de marcadores de superficie(Tabla 4)como pasos de 3.1.5 a 3.1.7, excepto que el tiempo de incubación es de 30 min en lugar de 1 h.
- Células resuspend con 400 μL de tampone de tinción. Mantenga las muestras en la oscuridad sobre hielo hasta el análisis de citometría de flujo.
8. Aislamiento del suero de la sangre
- El día 14 después de la infección (d.p.i 14), recoger la sangre de la vena facial y mantener muestras de sangre en un refrigerador de 4 °C durante la noche.
NOTA: Realizar la recolección de sangre en la condición ABSL2 y a partir de este paso todos los procedimientos podrían realizarse en el laboratorio regular. - Centrífuga la sangre a 400 x g durante 10 min a 4 °C. Aísle el suero con la pipeta de 200 μL cuidadosamente para evitar la contaminación de las células rojas. Aliquot en 3 tubos para cada muestra y guárdelos a -80°C.
9. Ensayo del titer de anticuerpos específico de HA con ELISA
- Cubra las placas ELISA con 50 μL de solución proteica ha de 2 μg/ml por pozo e incubarlas en el refrigerador de 4 °C durante la noche.
- Lavar tres veces con 200 μL de interpolación diluida por PBS (PBST). Añadir 100 μL de leche desnatada diluida por PBST en cada pozo e incubar en RT durante 2 h para bloquear la unión inespecífica.
- Dilución e incubación sérica: preparar 3% BSA en PBS como búfer de dilución. Diluir el suero en tampón de dilución como 1:50, 1:150, 1:450, ...... a la 1:36450 (se recomienda dilución en serie de 3 veces). Agregue 50 μL de suero diluido a cada pozo e incuba en el refrigerador de 4°C durante la noche.
- Deseche el suero y lave rápidamente los pozos una vez añadiendo 200 μL de PBST en cada pozo (agitarlo suavemente, luego desechar). A continuación, lave lentamente las placas en la coctelera con 200 μL de PBST tres veces durante 5 minutos cada una.
- Añadir 100 μL de anticuerpo secundario etiquetado con HRP específico para el total de IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, diluido con PBST) e incubar en RT durante 1 h. Lave las placas por PBST como se describe en 9.4.
- Saque el mismo volumen de Buffer A y Buffer B (TMB) del almacenamiento de 4 °C y caliente durante al menos 30 minutos en RT antes de su uso. Mezcle A y B y agregue 100 μL de TMB en cada pozo e incubarlos durante 10-30 minutos en RT agitando suavemente.
NOTA: Esta es una breve descripción del manual TMB Substrate Reagent Set (BD,555214). - Pipeta 100 μL de 2M H2SO4 en cada pozo para terminar la reacción. Lea el valor OD450 a través del instrumento.
- Análisis de datos: obtenga el valor final de OD450 restando la señal de fondo (valor OD450 de pozo vacío). Dibuje la curva correspondiente a un isotipo de anticuerpo de cada muestra con el factor de dilución en el eje X y el valor OD450 en el eje Y.
10. Histología
- Aísle los bazos en d.p.i 10. Fijarlos en 3.7% solución de formaldehído para 1 h en RT. Deseche el búfer de fijación y lave con PBS durante 5 minutos en la coctelera durante tres veces.
- Deshidratar los bazos en PBS (10% sacarosa) a 4°C durante 1 h y luego deshidratarlos en PBS (30% sacarosa) a 4°C con agitación suave hasta que los bazos se hunden hasta la parte inferior del tubo de 15 ml.
- Saca los bazos deshidratados, cósalos en un compuesto óptimo de temperatura de corte y criosección.
- Pre-enfríe la acetona a -20°C. Incubar las secciones de tejido con acetona pre-refrigerada durante 10 minutos. Lave el tejido con PBS durante tres veces.
- Permeabilizar las secciones de tejido con PBS que contienen 0.2% Tritón X-100 durante 20 minutos y lavarlos por tres veces con PBS.
- Bloquee la unión no específica con PBS que contenga un 10% de suero de cabra normal (amortiguador de bloqueo) durante 1 h en RT y lave las secciones de tejido con PBS una vez.
- Bloquee el enlace no específico con el kit de bloqueo STREPTAVIDIN/BIOTIN.
NOTA: No deje que las muestras se sequen a partir de este paso. - Tinción con anticuerpo primario: añadir biotina-PNA diluida por búfer de bloqueo (25 μg/ml) y IgD anti-ratón de rata (2,5 μg/ml) en las secciones de tejido cuidadosamente. Incubar las secciones de tejido en la cámara húmeda en el congelador de 4 °C durante la noche.
- Lave rápidamente las secciones de tejido con PBST una vez. Lave rápidamente las secciones de tejido en el PBST con agitación lentamente durante 5 minutos. Repita el lavado tres veces.
- Diluir los anticuerpos Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) y Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG (1:500) con amortiguador de bloqueo y añadirlos a las secciones de tejido cuidadosamente
- Incuba en RT durante 1 h.
- Lave las secciones de tejido como paso 10.8 y monte cuidadosamente con la solución de prolongación. Cubra el tejido con manchas cuidadosamente y guárdalos en la oscuridad a 4°C hasta el análisis confocal.
- Analice la magnitud de la reacción de GC contando los números de GC por tamaño de área.
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Representative Results
Caracterización de la morbilidad del ratón en la infección por el virus de la gripe
Después de la infección por el virus de la gripe, los ratones son menos activos y anoréxicos debido a una enfermedad, que se refleja en la pérdida de peso grave, un síntoma comúnmente utilizado para controlar la morbilidad del ratón19. Como se muestra en la Figura 1a , ratones infectados por el virus PR8 comenzaron a perder peso en el día 6, alcanzaron el nivel de pérdida más alto en el día 8 y regresaron al nivel inicial el día 10. Como era de esperar, la pérdida de peso no se observó durante todo el período en ratones de control tratados con PBS. Para los síntomas in vivo, la infección por virus conduce a una expansión robusta de los linfocitos en el ganglio linfático agotador, mLN en este caso. Por lo tanto, se observó un tamaño significativamente mayor de mLNs en ratones infectados por el virus PR8 que en ratones de control (Figura 1b). En conjunto, todos estos ratones mostraron síntomas esperados y fueron calificados para el estudio posterior de respuesta inmune asociada a Tfh.
Detección de la diferenciación de Tfh y moléculas asociadas a la función
Para analizar la diferenciación de Tfh, los ratones fueron sacrificados el día 5, 7, 10 y 14 después de que la infección y los mLNs o bazos fueron aislados para el análisis de citometría de flujo. La Figura 2a y la Figura 2b muestran la estrategia de gating de la población Tfh, con Tfh cerrado como PD-1hi CXCR5hi células y no-Tfh como PD-1células bajasCXCR5. Con esta estrategia de gating, se adivino la cinética de la diferenciación de Tfh durante la infección por el virus de la gripe. Como se muestra en la Figura 2c, la diferenciación Tfh se inicializó en el día 5 y alcanzó su punto máximo en el día 10. Así que tomamos muestras del día 10 para su posterior análisis. Como se muestra en la Figura 3a,se indujo una sólida diferenciación celular Tfh en ratones infectados por el virus de la gripe en comparación con ratones de control. Para analizar las células Tfh específicas del virus de la gripe, se añadieron tetrameros IAbNP311-325 MHC clase II etiquetados con fluorocromo (NP311-325)en el panel de tinción de células Tfh policlonales (Tabla 1). Tanto en los mLNs como en los bazos de ratones infectados por el virus de la gripe, las células NP311-325-específicas CD4+ T fueron significativamente inducidas y las células Tfh específicas NP311-325pudieron ser analizadas mediante la adición de PD-1 y CXCR5 en el análisis (Figura 3e). Debido a los roles esenciales de Bcl6 en la diferenciación tfh, Bcl6+CXCR5+ celdas también pueden representar la población Tfh. Consistentemente, las células Tfh identificadas con esta estrategia también fueron inducidas con solidez(Figura 3b). Analizamos más a fondo la expresión de Bcl6 en celdas Tfh y no Tfh. Como se muestra en la Figura 3c, mayor expresión de Bcl6 en las celdas Tfh que en las células no Tfh indica la tinción exitosa Bcl6. Con una estrategia similar, ICOS, también se analizó otra molécula asociada a Tfh(Figura 3d). Debido al papel especializado de las células Tfh en proporcionar ayuda para las células B, el ensayo de la expresión de IL21, que es secretado principalmente por las células Tfh y demostrado para regular directamente la supervivencia y proliferación de células B, podría revelar que las células Tfh funcionan hasta cierto punto. Como se muestra en la Figura 3f,la tinción intracelular de IL21 reveló que la infección PR8 indujo una producción significativamente mayor de esta citoquina, con células no instimuladas como control de gating. En conjunto, estos ensayos podrían reflejar información básica de la diferenciación de Tfh y proporcionar la información sobre la capacidad de ayuda celular B.
Detección del desarrollo de células GC B y plasmáticas y anticuerpos específicos del virus de la gripe en suero
La función principal de las células Tfh es proporcionar ayuda celular B en los GCs, en los que se producen la conmutación de clases de anticuerpos y la maduración de afinidad. Así que el desarrollo de GC B podría reflejar indirectamente la diferenciación y la función de las células Tfh. Las celdas GC B podrían ser cerradas como B220+PNA+Fas+ celdas (Figura 2d). A través de esta estrategia de gating, asestamos la cinética de la respuesta celular gc B y encontramos que la respuesta gc B comenzó en el día 10 y continuó aumentando en el día 14 (Figura 2e). La comparación entre ratones infectados por el virus PR8 y los ratones de control mostró que el robusto GC B se indujo tanto en mLN como en bazo después de la infección por el virus de la gripe(Figura 4a),que es consistente con la diferenciación inducida de Tfh en ratones infectados por el virus PRB. Además, la tinción de inmunofluorescencia con IgD y PNA proporciona imágenes visualizadas que indican la reacción inducida del GC (áreas verdes) en ratones infectados por el virus PR8(Figura 4d). Las células plasmáticas, identificadas como IgDlowCD138+ cells(Figura 2d),también se generaron en ratones infectados por el virus PR8 (Figura 4b). Estudios anteriores han identificado que IFNƳ e IL21 podrían ser secretados de células Th1 y Tfh en la infección por virus e inducir el cambio de clase IgG2 e IgG1, respectivamente20. La Figura 4c representa la generación de anticuerpos específicos del virus de la gripe por ensayo ELISA de IgM específico de HA, IgG total, IgG1, IgG2b e IgG2C. Juntos, todos estos ensayos reflejan las respuestas de células B asociadas a Tfh en la infección por el virus de la gripe.
Figura 1: Caracterización de la morbilidad del ratón. Los ratones machos de 8 semanas de edad fueron infectados con 40 PFU del virus de la gripe PR8 por inoculación intranasal. Los ratones se pesaban diariamente durante 10 días(a)y los mLNs estaban aislados en d.p.i 10 (b). Las barras de error de (a) representan la media ± SD. n = 4 ratones por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Estrategia de Gating de células Tfh y células GC B. (a) Los linfocitos son definidos por FSC-A y SSC-A, y los singletes celulares están cerrados con FSC-A, FSC-H y SSC-A, SSC-W. (b) Después de gating en células CD4+ T, los marcadores de superficie CD62L y CD44 se utilizan para distinguir las ingenuas células T (CD44loCD62Lhi)y las células T activadas (CD44hiCD62Llo). Las células Tfh policlonales se pueden bloquear de las células T activadas como pd-1hi CXCR5alta población, por el contrario, células no Tfh como PD-1bajoCXCR5bajo. Las células Tfh específicas del virus PR8 se definen como CÉLULAS CD4+CD44+ NP311-325 tetramer+PD-1hi CXCR5hi. (c,e) Cinética de frecuencia Tfh en células activadas (c) y frecuencia GC B en B220+ células (e). (d) Las células GC B están cerradas como células B220+ PNA+FAS+ , y las células plasmáticas son IgD-CD138+ células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de la diferenciación tfh en ratones infectados por el virus PR8. Los ratones fueron sacrificados en d.p.i 10 y los mLNs y bazos fueron aislados para el análisis de diferenciación de Tfh. (a) Porcentaje de tfh en mLNs y bazos en ratones infectados por el virus PR8 y ratones tratados con PBS (panel superior). Las estadísticas de las células Tfh (panel inferior). (b) La tinción intracelular de Bcl6 en células CD4+CD44hi T (panel superior). Las estadísticas de Bcl6+CXCR5+ celdas (panel inferior). (c) Expresión Bcl6 y (d) ICOS en celdas Tfh (rojo línea) y no Tfh (gris sólido). (e) Gating de NP311-325-específico CD4+ células T en mLNs y bazos de ratones infectados por virus PR8 y tratados con PBS (panel izquierdo). El porcentaje de células Tfh específicas del virus PR8 en mLNs y bazos (panel medio). "Isotipo" indica tinción con control de tetramer irrelevante. Las estadísticas de NP311-325-específica CD4+ células T (panel derecho). (f) Tinción intracelular de IL-21 en células CD4+ T esplénicas de ratones infectados por el virus PR8 y tratados con PBS, la no estimulación mostrada como control (izquierda). Las estadísticas de tinción IL-21 (derecha). **P < 0.01, ***P < 0.001 y **** P < 0.0001 (prueba t del estudiante de dos colas). Las barras de error representan la media ± SD. n = 3 ratones por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Análisis de la respuesta asociada a células GC B en ratones infectados por el virus PR8. Los ratones fueron sacrificados en d.p.i 10 y los mLNs y bazos fueron aislados para su análisis. (a) El porcentaje de celdas GC B (panel superior). Las estadísticas de las células GC B (panel inferior). (b) El porcentaje de células plasmáticas (panel superior). Las estadísticas de las células plasmáticas (panel inferior). (c) Cuantificación del virus PR8 HA específico IgG, IgM, IgG1, IgG2b e IgG2c en el suero (d.p.i 14) de ratones infectados por el virus PR8 y ratones tratados con PBS. (d) Microscopía confocal de folículos celulares B (IgD+, Rojo) y GCs (PNA+, Verde) en las muestras de bazo de ratones infectados por el virus PR8 y ratones tratados con PBS (d.p.i 10). *P < 0.5, **P < 0.01 y ***P < 0.001 (prueba t del estudiante de dos colas). Las barras de error representan la media ± SD. n = 3 ratones por grupo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| marcador de superficie | fluorocromo | Clon | volumen por muestra(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | eVolve 605 | IM7 | 0.2 |
| CD62L | FITC | MEL-14 | 0.2 |
| ICOS | BV421 | 7E.17G9 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidin | Pe | 0.2 |
Tabla 1: Panel de anticuerpos marcador de superficie (excepto CXCR5) para manchar células Tfh (PD-1hiCXCR5hi).
| marcador de superficie | fluorocromo | Clon | volumen por muestra(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | IM7 | 0.2 |
| PD1 | PE/Cy7 | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidin | BV421 | 0.5 |
Tabla 2: Panel de anticuerpos marcadores de superficie (excepto CXCR5) para manchar Bcl6 en células Tfh.
| marcador de superficie | fluorocromo | Clon | volumen por muestra(ul) |
| CD4 | Percp-eFluor 710 | GK1.5 | 0.2 |
| CD44 | FITC | IM7 | 0.2 |
Tabla 3: Panel de anticuerpos marcadores de superficie para la tinción intracelular de IL21.
| marcador de superficie | fluorocromo | Clon | volumen por muestra(ul) |
| B220 | Apc | RA3-6B2 | 0.2 |
| Ngc | eFluor 450 | 11-26c | 0.2 |
| CD95 | PE/Cy7 | Hop | 0.3 |
| Pna | FITC | 0.3 | |
| CD138 | Pe | 281-2 | 0.2 |
Tabla 4: Panel de anticuerpos marcadores de superficie para manchar células GC B y B plasmáticas.
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Discussion
Debido a los roles especializados en proporcionar ayuda de células B para generar anticuerpos de alta afinidad, las células Tfh han sido ampliamente estudiadas en los mecanismos de diferenciación y manipulación para proporcionar nuevas estrategias para el diseño de vacunas. La infección por el virus de la gripe induce vigorosas respuestas de las células Tfh y GC B, siendo así un modelo adecuado para este campo de investigación. En este documento, describimos protocolos de infección por el virus de la gripe por inoculación intranasal, evaluación de la respuesta asociada a Tfh por citometría de flujo, inmunofluorescencia y ELISA. Estos ensayos facilitarán la detección de la diferenciación de Tfh, el desarrollo del GC B y los anticuerpos específicos del virus de la gripe y ayudarán a los investigadores a explorar e identificar nuevas moléculas cruciales en la respuesta inmune.
En estudios con modelos de ratones infectados por el virus de la gripe, la pérdida de peso es un indicador comúnmente utilizado de morbilidad del ratón. El cambio de peso esperado cinético en ratones infectados por el virus de la gripe es como se describe en la Figura 1a, que refleja la respuesta inmune adecuada inducida en los ratones. Sin embargo, se producirían casos anormales regularmente, en los que los ratones pierden su peso o no muestran ninguna disminución de peso durante todo el período de observación. Según nuestras experiencias, estos ratones soportarían principalmente una respuesta inmune anormal inferior o superior, interrumpiendo así los resultados del experimento. Para evitar tales variaciones, en primer lugar los ratones utilizados en el experimento deben ser sexo y adaptados a la edad para garantizar la capacidad de respuesta similar al virus. El titer de virus consistente para cada ratón también es importante21. El titer de virus utilizado en este protocolo es 40 PFU. Sin embargo, el titer del virus para inducir cinéticas apropiadas de cambio de peso en cada laboratorio podría ser variable debido a la inconsistencia en el procedimiento de evaluación del valor del virus y las cepas del ratón utilizadas en el experimento. Por lo tanto, aconsejamos la valoración del título del virus para la infección es necesaria antes de un estudio relevante para la respuesta inmune.
En este protocolo, identificamos células Tfh con marcadores utilizados con frecuencia PD-1, CXCR5 y el factor de transcripción esencial Bcl6. Aunque tanto PD-1hiCXCR5hi y Bcl6+CXCR5+ células podrían ser denotadas como células Tfh, representan diferentes población y no tienen la relación precursor-progenie basado en el hecho de que no todas las células PDP-1hiCXCR5hi son Bcl6+ y no todas las célulashi Bcl6+CXCR5 son PD-1hiCXCR5hi. Este fenotipo podría explicarse por la heterogeneidad de la expresión Bcl6 en las células Tfh22. ICOS, una molécula crítica para la diferenciación y migración de Tfh también debe incluirse en el análisis de la diferenciación tfh. Además, también deben detectarse otras moléculas co-estimulantes asociadas a la función, como OX40 y CD40L para su nivel de expresión, aunque no se incluyan en este protocolo. IL21 e IL4 son citoquinas secretas de Tfh que desempeñan papeles en la inducción del cambio de clase IgG1. El protocolo de detección de la expresión IL21 se describe en este documento. Sin embargo, debido a la dificultad en la detección de IL4 en células Tfh, los ratones reporteros IL4-GFP se utilizaron en estudios anteriores23. En este protocolo, también utilizamos tetramers NP etiquetados con fluorocromo para detectar células Tfh específicas np311-325. Sin embargo, el límite en la cantidad de células Tfh específicas NP311-325confiere la dificultad en el análisis posterior. Por lo tanto, el experimento de transferencia adoptiva de células T específica-TCR(Tg) CD4+ (TS-1) de gripe hemagglutinina, que podría aislarse de ratones TS-1, es una estrategia alternativa para resolver este problema24.
Aquí identificamos GC B como B220+PNA+Fas+ células en la tinción de citometría de flujo. Una estrategia alternativa de combinación de marcadores para definir GC B como células GL7hiFashi también se utiliza en otros trabajos14,16. También utilizamos inmunofluorescencia para visualizar GCs con combinación de anti-IgD y PNA. Aquí la adición de anticuerpo CD3 puede ayudar a visualizar las células Tfh, permitiendo así el estudio de la interacción entre estos dos tipos de células10.
Dada la diferenciación de las células Tfh es un proceso multietapa y multifactorial, se necesita un ensayo adicional de otras moléculas significativas en múltiples puntos de tiempo para dilucidar un mecanismo más detallado en la diferenciación tfh. Además, los parámetros detectados aquí también se utilizan comúnmente en otros modelos18. Por lo tanto, además de en la infección por el virus de la gripe, los protocolos descritos aquí, especialmente la parte inmunostaining, también pueden proporcionar instrucciones en el estudio asociado a Tfh con otros modelos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al personal de las instalaciones de citometría de flujo, las instalaciones de ABSL2 y las instalaciones de animales SPF del Institut Pasteur de Shanghai por su ayuda técnica y asesoramiento. Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: Programa de Investigación Estratégica Prioritaria de la Academia China de Ciencias (XDB29030103), Programa Nacional clave de I+D de China (2016YFA0502202), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31570886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
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