Summary
Detta dokument beskriver protokoll för utvärdering av Tfh och GC B svar i mus modell av influensa virus infektion.
Abstract
T Follicular Helper (Tfh) celler är en oberoende CD4+ T cell delmängd som specialiserat sig på att ge hjälp för germinal center (GC) utveckling och generering av hög affinitet antikroppar. Vid influensavirusinfektion induceras robusta Tfh- och GC B-cellsvar för att underlätta effektiv virusutrotning, vilket ger en kvalificerad musmodell för Tfh-associerade studier. I detta dokument beskrev vi protokoll för påvisande av grundläggande Tfh-associerade immunsvar under influensa virus infektion hos möss. Dessa protokoll omfattar intranasal inokulering av influensavirus; Flödescytometrifärgning och analys av polyklonala och antigenspecifika Tfh-celler, GC B-celler och plasmaceller. Immunofluorescens detektion av GCs. enzym-linked immunosorbent analys (ELISA) av influensa virus-specifika antikroppar i serum. Dessa analyser kvantifierar i princip differentiering och funktion av Tfh-celler vid influensavirusinfektion, vilket ger hjälp till studier för att belysa differentieringsmekanism och manipulationsstrategi.
Introduction
Under det senaste decenniet har många studier fokuserats på den nyligen identifierade CD4+ T-cellundergruppen Tfh cell delmängd, för dess väsentliga roller i germinal center (GC) B utveckling. B-cellslymfom 6 (Bcl6), som främst betraktas som en genrepressor, är den härstamningsdefinierande faktorn hos Tfh-celler för bevis för att utomkvedsuttryck av Bcl6 är tillräckligt för att driva Tfh differentiering medan brist på Bcl6 resulterar i försvunnen Tfh differentiering1,2,3. Till skillnad från andra CD4+ T-hjälpgrupper som utför sin effektorfunktion genom migrering till inflammationsplatserna, ger Tfh-celler B-cellhjälpen främst i B-cellens follikulära zon av mjälte och lymfkörtel. Medstimulerande molekyler ICOS och CD40L spelar betydande roller i interaktionen mellan Tfh- och GC B-celler. Under Tfh-differentiering överför ICOS nödvändiga signaler från konjak B-celler och fungerar också som en receptor som tar emot migrationssignaler från B-celler för B-cellzonlokalisering4,5. CD40L är en medlare av signaler från Tfh-celler för B-cellers spridning och överlevnad6. En annan faktor som spelar en liknande roll som CD40L är cytokinen IL21, som huvudsakligen utsöndras av Tfh-celler. IL21 reglerar direkt GC B-cellers utveckling och produktion av hög affinitetsantikroppar, men dess roll i Tfh-differentiering är fortfarande kontroversiell7,8. PD-1 och CXCR5, som nu oftast används för att identifiera Tfh-celler i flödescytometrianalys, spelar också betydande roller i differentiering och funktion av denna delmängd. CXCR5 är receptorn för B-cells follikulärt chemokin och förmedlar lokaliseringen av Tfh-celler i B-cellsäckar9. PD-1 identifieras nu för att inte bara ha follikulära styrfunktionen utan också överföra kritiska signaler i processen med GC B-celler affinitet mognad10. Baserat på dessa resultat kan utvärdering av uttrycket av dessa molekyler i princip återspegla mognaden och funktionen hos Tfh-celler.
GC är en inducerad transienta mikroanatomical struktur i sekundära lymfoida organ och mycket beroende av Tfh celler, vilket är en perfekt avläsning för att utvärdera Tfh svar. I GC, efter att ha fått signaler medierade av cytokiner och samstimulerande molekyler, är B-celler föremål för klassväxling och somatisk hypermutation för att generera antikroppar med hög affinitet11. Differentiell antikroppsklassväxling sker i differentialcytokinnisch, där IL4 och IL21 inducerar IgG1-klassväxling medan IFNγ inducerar IgG2-klassbyte12. Plasmaceller är producenter av utsöndrade antikroppar och är terminalt differentierade celler. Liksom Tfh-celler är utveckling av B-celler i GC förknippad med dynamiskt uttryck av många signifikanta molekyler. Baserat på den aktuella studien kan GC B-celler identifieras som B220+PNA+Fas+ eller B220+GL7+Fas+ celler och plasmaceller, jämfört med deras prekursorer, nedreglerat uttryck av B220 och uppreglerat CD138-uttryck13. Dessutom kan båda dessa egenskaper detekteras i flödescytometri och immunofluorescensanalys, vilket är lämplig utvärdering av GC-svar.
Robusta cellulära och humorala svar induceras vid influensavirusinfektion, där Tfh- och Th1-celler dominerar CD4+ T-cellsrespons14, vilket gör det till en perfekt modell för Tfh-cellers differentieringsstudie. Influensa A/Puerto Rico/8/34 H1N1(PR8), som är en vanlig musanpassad stam, används ofta i denna studie14,15,16. Här beskriver vi några grundläggande protokoll för Tfh studierelevant analys vid influensavirusinfektion: 1) intranasal inokulering av PR8-virus; 2) Antigenspecifika Tfh-celler, GC B- och plasmaceller och IL21-detektion med flödescytometri. 3) histologisk visualisering av GC; 4) påvisande av antigenspecifik antikroppstiter i serum med ELISA. Dessa protokoll ger de nödvändiga teknikerna för nya forskare i Tfh-associerade studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee of Institut Pasteur of Shanghai, Kina. Alla experiment utfördes baserat på de institutionella djurvårds- och användningskommittégodkända djurprotokollen.
OBS: Virusinfektion hos möss och isolering av organ bör utföras under ABSL2-tillstånd.
1. Vaccination av PR8-influensavirus och registrering av mössens vikt
- Förbered 8 veckor gamla manliga C57BL/6 möss för infektion på ABSL2 rum.
OBS: Detta protokoll är också lämpligt i experiment med kvinnliga möss. - Utspädning av PR8-virus: ta ut viruset från frysen -80 °C och inkubera på is tills det smälter till vätska. Virvel beståndsviruset noggrant och späd viruset till 2 PFU/μL med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 135 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,1,8 mM KH2PO4)i ett förkylt 1,5 mL-rör.
-
Mössens bedövning: väg varje mus och beräkna volymen (4-faldig (μL) musvikten (g)) av natriumpentobarbital (2 mg/ml) som ska användas. Injicera den beräknade volymen natriumpentobarbital intraperitoneally.
OBS: Detta steg är att få möss att andas stadigt och fredligt, så att korrekt titer av virus kan vaccinelas intranasally. För snabba eller långsamma hjärtslag indikerar olämplig bedövning. Dessutom rekommenderas användning av veterinärsalva för att undvika ögontorrhet. - Intranasal inokulering:virvel det utspädda PR8-viruset noggrant. Rör 10 μL och utför försiktigt intranasal inokulering på ena sidan droppe för droppe. Efter avslutad vaccination av alla möss i en bur (högst 5 möss) på denna sida, upprepa inokulering på andra sidan (håll andningen av musen fredlig och stadig genom hela vaccinationen). Varje mus är infekterad med totalt 40 PFU PR8-virus.
- Placera mössen i sternal recumbency i varma burar för bättre väckelse.
- Övervaka musvikten dagligen i 10 dagar. (Infektionsdagen registreras som dag 0).
2. Isolering av lymfocyter från mjälte och mediastinal lymfkörtel (mLN)
- Mus eutanisering: lägg mössen i en liten kammare och avliva mössen genom att pumpa in i CO2 fredligt från botten av kammaren. Ta ut möss när de inte rör sig och utför livmoderhalsförskjutning för att säkerställa att möss dör helt. Doppa mössen med 75% etanol och överför till biosäkerhetshuven.
- Immobilisera mössen med dissekeringsnålar på den absorberande papperstäckta dissektionsskumplattan. Skär huden längs bukens mittlinje och bakbenen med dissekeringssax och sträck ut huden med pincett. Immobilisera den sträckta huden med dissekeringsnålar.
- Förbered två 6 cm rätter för varje mus och håll dem på isen. Lägg en 70-μm cellsil i varje maträtt och tillsätt 5 ml DMEM kompletterat med 1% fetala nötkreatursserum (DMEM (1% FBS))
- Mjälteisolering: skär bukhinnan för att exponera bukhålan med dissekeringssax. Ta mjälten och lägg den i den beredda skålen.
- mlN-isolering: skär membranet och botten av burspjällen i närheten av tymus. Dra revbenet åt sidan och fäst det med dissekeringsnålar för att exponera brösthålan. Dra lungan åt sidan till höger sida och använd pincett för att ta mLN, under hjärtat och nära luftstrupens ventrala sida.
- Lägg mLN i den beredda skålen.
- Få encellsupphängningar: koka mjälten eller mLN försiktigt med en kolv på 3 ml spruta genom 70-μm cellsilen. Skölj cellsilen med 1 ml färsk DMEM (1% FBS). Återanvänd cellfjädringen och överför till ett 15 ml centrifugeringsrör.
- Centrifugera cellfjädringen vid 350 x g i 6 min vid 4 °C. Ta bort supernatanten och tillsätt 1 ml DMEM (1% FBS).
- Återanvänd cellpelleten med 1 ml pipett noggrant. Tillsätt 4 ml DMEM (1% FBS) i mjältecellsupphängningar och håll dem på is för följande operationer.
OBS: Det är nödvändigt att återanvända cellpelleten med 1 ml medium först, inte 5 ml, för att helt isolera enstaka celler från pellet.
Från och med nu kan alla operationer utföras i det vanliga labbet. -
Räknar mjältecell
- Återanvänd celler genom att vrida rören upp och ner flera gånger. Ta 10 μL i 90 μL lysbuffert (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 155 mM NH4Cl). Inkubera i rumstemperatur (RT) i 3 min och tillsätt 900 μL kall PBS för att avsluta reaktionen.
- Centrifug vid 400 x g i 6 min vid 4 °C och ta bort supernatant. Återanvänds med 100 μL kall PBS. Ta 10 μL celler i 10 μL 0,4% w/v trypanblått och ta 10 μL ur blandningen för cellräkning med hemocytometern.
- Beräkning: beräkna celler som vanlig metod. I korthet, räkna cellnummer i två diagonala hörnrutor på hemocytometern och få N1, N2 för varje hörnruta. Cellkoncentrationen av 5-ml-cellupphängningen ska beräknas som (N1+N2)/2 x 104 /ml.
3. Immunostaining av polyklonala Tfh-celler med PD-1 och CXCR5
- Färgning med anti-CXCR5-antikropp.
- Återanvänd cellupphängningar genom att vrida röret upp och ner. Ta 2 x 106 celler i FACS-röret och tillsätt 2 ml färgbuffert (PBS (1% FBS, 1 mM EDTA)). Tvätta med virvel på virvelsvängningsanordningen.
- Centrifugera vid 350 x g i 6 min vid 4 °C. Kassera supernatanten genom att hälla ut vätskan och doppa rörmunnen på det absorberande papperet två gånger.
- Lossa cellpelleten med restvätskan genom att knacka på botten av röret. Lägg röret i rörhållaren på is.
OBS: Volymen restvätska är cirka 25 μL. - Tillsätt 0,2 μL antimus-CD16/CD32 (Fc-receptorblockerare) för varje rör. Virvel genom att knacka försiktigt på rörbotten och inkubera på is i 10 minuter.
OBS: Förbered antikroppsblandningen för flera prover genom utspädning med 5 μL färgbuffert för varje rör. Blandningsreceptet ska beredas genom utspädd (n/10+1) x 0,2 μL Fc-receptorblockerare i (n/10+1) x 5 μL färgbuffert och tillsätt 5,2 μL blandning i varje rör. - Tillsätt 0,3 μL biotin-antimus CXCR5 i resterna 30 μL färgbuffert för varje rör och virvel genom att knacka på rörbotten.
OBS: Bered blandning enligt beskrivningen i steg 3.1.4. - Inkubera på is i 1 timme med försiktigt återanvänd celler genom att knacka på röret på 30 min.
OBS: Vortex på 30 min är att undvika cellaggregat för bättre färgning. - Tillsätt 2 ml färgbuffert och virvel på virvelsvängningsanordningen. Centrifug vid 350 x g i 6 min vid 4 °C och kassera supernaten enligt beskrivningen i steg 3.1.2. Virvel genom att knacka på röret och inkubera på is för efterföljande färgning.
- Färgning med andra ytmarkeringar.
- Bered antikroppsblandning (tabell 1) enligt beskrivningen i steg 3.1.4.
- Tillsätt antikroppsblandning i varje rör. Virvel genom att knacka på rörbotten och inkubera på is i 30 minuter.
- Tvätta celler med 2 ml färgbuffert. Centrifugera vid 350 x g i 6 min vid 4 °C.
- Kassera supernaten och tillsätt 400 μL färgbuffert. Virvel röret på virvel svängning enhet och hålla röret i mörker till flöde cytometri analys.
4. Immunostaining av PR8-influensavirus NP-specifika Tfh-celler
OBS: Detta protokoll för färgning NP-specifika Tfh celler är från tidigare studier15,17.
- Utför biotin-CXCR5 färgning enligt beskrivningen i steg 3.1 förutom att cellnumret som tas för färgning är 3 x 106 för att tillräckligt med antigenspecifika celler ska registreras i flödescytometri.
- Tillsätt 0,3 μL APC-konjugerad-IAbNP311-325 MHC klass II (NP311-325)tetramer i röret från 3.1.7. Förbered blandningen för flera prover enligt steg 3.1.4
OBS: Det är viktigt att färga tetramer före tillsats av anti-CD4-antikroppar eftersom bindningen mellan CD4- och anti-CD4-antikroppar skulle störa den optimala tetramerfärgningen. - Återanvänd cellblandningen genom att försiktigt knacka på röret och inkubera i mörker vid RT i 30 minuter.
OBS: Täck ett vått papper på rörens mun för att minska avdunstning - Tillsätt blandningen av andra ytmarkörer(tabell 1)och fortsätt inkubationen vid RT i 30 minuter.
- Tvätta och återanvänd celler enligt beskrivningen i steg 3.2.3 och 3.2.4.
5. Immunostaining av Bcl6 i polyklonala Tfh-celler
- Utför ytmarkörer(tabell 2)färgning enligt beskrivningen i avsnitt 3, förutom att den sista tvätten med 2 ml PBS, i stället för färgbuffert.
- Centrifugera vid 350 x g i 6 min vid 4 °C. Kassera supernaten och återanvänd cellpellets genom att försiktigt knacka på rörbotten.
- Tillsätt 300 μL 3,7% formaldehydlösning (utspädd från 37% formaldehyd med PBS) i röret för cellfixering. Virvel på virvelsvängningsanordningen och inkubera på RT i 20 min.
- Tillsätt 2 ml färgbuffert för tvätt och centrifugering vid 500 x g i 6 min vid 4 °C. Kassera supernaten och återanvänd cellerna genom att försiktigt knacka på röret.
- Tillsätt 300 μL 0,2% Triton-X 100 och återanvänd celler med virvel på virvelsvängningsanordningen. Inkubera på RT i 15 minuter.
- Tillsätt 2 ml färgbuffert för tvätt. Centrifugera vid 500 x g i 6 min vid 4 °C. Kassera supernatant och återanvänd celler genom att försiktigt knacka på rörbotten.
- Tillsätt 1,5 μL PE-anti-Bcl6-antikroppar för varje rör. Knacka försiktigt på rörbotten för att återanvända blandningen och inkubera vid RT i 2 timmar med att försiktigt knacka på röret var 30: e minut.
OBS: Täck ett vått papper på rörens mun för att minska blandningens avdunstning. - Tillsätt 2 ml PBS kompletterat med 0,01% Triton-X 100 i röret. Virvel och centrifugera vid 500 x g i 6 min vid 4 °C.
- Upprepa tvätten som steg 5.8. Återanvända celler med 400 μL färgbuffert. Håll cellerna mörka på isen tills flödescytometrianalysen.
6. Intracellulär färgning av IL21
- Stimulera celler med PMA (phorbol 12-myristate 13-acetat) och jonomycin.
- Ta 2 x 106 celler från mjältcellsupphängning och centrifugera vid 350 x g i 6 min vid 4 °C. Kassera supernaten och återanvänd cellpelleten med 500 μL komplett T-cellsmedium. Överför cellerna till 24-brunnsplattan.
- Tillsätt 20 nmol PMA och 2 μmol jonomycin i 500 μL komplett medium18 och blanda noggrant genom att leda upp och ner.
- Tillsätt lösningen i steg 6.2 i cellfjädringen i 24-brunnsplattan och blanda genom att skaka plattan. Ställ in den ospecificerade kontrollen genom att tillsätta 500 μL komplett T-cellsmedium utan tillsats av PMA och jonomycin i cellerna. Inkubera i en CO2-inkubator vid 37°C i 4 timmar.
- Tillsätt 10 μmol BFA (Brefeldin A, upplöst med metanol) i varje brunn för att blockera Golgi-apparatens medierade proteintransport. Sätt tillbaka plattan till cellinkubatorn och inkubera i 2 timmar.
- Utför cellytans markörfärgning.
- Återanvänd celler genom att försiktigt pipetting upp och ner och överföra cellerna till ett FACS-rör. Tillsätt 1 ml färgbuffert i röret och centrifugera vid 350 x g i 6 min vid 4 °C.
- Utför Fc-receptorblockerare färgning som steg 3.1.4.
- Utför cellytans markörer färgning (tabell 3) enligt beskrivningen i steg 3.2.1-3.2.3 utom tvättceller med 2 ml PBS.
- Centrifugera vid 350 x g i 6 min vid 4 °C. Kassera supernaten och återanvänd cellerna genom att knacka på rörbotten.
- Tillsätt 0,2 μL reagens från Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell färgningssats och inkubera röret i mörker på RT i 10 minuter för att utföra färgning av döda celler.
- Tillsätt 2 ml PBS i röret och virveln på virvelsvängningsanordningen. Centrifug vid 350 x g i 6 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
- Utför cellfixeringen enligt beskrivningen i steg 5.3 och 5.4.
- Tillsätt 300 μL färgbuffert för att återanvända celler och förvara rören i kylskåpet på 4 °C över natten. Centrifugera vid 500 x g i 6 min vid 4 °C för att avlägsna supernaten.
OBS: Det här steget kan utelämnas och fortsätta att steg 6.7 direkt efter steg 6.5. - Tillsätt 1 ml saponinbuffert (färgbuffert kompletterad med 0,2%(w/v) saponin) i röret och virveln på virvelsvängningsanordningen. Inkubera på is i 20 minuter för att utföra cellpermeabilisering.
- Centrifug vid 500 x g i 6 min vid 4 °C och kassera supernatant.
- Tillsätt 0,5 μL human Fc-IL21-receptor i varje rör. Bered antikroppsblandning för flera som steg 3.1.4 förutom den utspädda antikroppen med saponinbuffert i stället för färgbuffert.
- Inkubera vid RT i 1 timme med att försiktigt knacka på rörbotten för att återanvända celler på 30 min.
- Tillsätt 2 ml saponinbuffert för att tvätta celler och centrifugera vid 500 x g i 6 min. Kassera supernatant och upprepa tvätten en gång.
- Tillsätt 0,1 μL APC-anti-human Ig(H+L) i varje rör. Bered blandningen för flera prover enligt steg 3.1.4, förutom den utspädda antikroppen med saponinbuffert i stället för färgbuffert.
- Inkubera proverna på is i 30 minuter och tvätta enligt steg 6.11.
- Återanvända celler med 400 μL färgbuffert. Håll provet mörkt på is tills flödescytometrianalysen.
7. Färgning av GC B- och plasmaceller
- Ta celler och utför anti-Fc-receptor antikropp färgning som steg från 3.1.1 till 3.1.4.
- Utför ytmarkörer färgning (tabell 4) som steg från 3.1.5 till 3.1.7 förutom att inkubationstiden är 30 min istället för 1 h.
- Återanvända celler med 400 μL färgbuffert. Håll proverna i mörker på is tills flödescytometrianalysen.
8. Isolering av serum från blod
- På dag 14 efter infektion (d.p.i 14), samla blodet från ansikts ven och hålla blodprover i ett 4 °C kylskåp över natten.
OBS: Utför blodinsamling vid ABSL2-tillstånd och från och med detta steg kan alla procedurer utföras i det vanliga labbet. - Centrifugera blodet vid 400 x g i 10 min vid 4 °C. Isolera serumet med 200 μL-pipetten noggrant för att undvika förorening av röda blodkroppar. Aliquot i 3 rör för varje prov och lagra dem vid -80 °C.
9. Analys av HA-specifik antikroppstiter med ELISA
- Täck ELISA-plattor med 50 μL 2 μg/ml HA proteinlösning per brunn och inkubera dem i kylskåpet på 4 °C över natten.
- Tvätta tre gånger med 200 μL PBS-utspädd 0,05% interpolering (PBST). Tillsätt 100 μL PBST-utspädd 5% skummjölk i varje brunn och inkubera vid RT i 2 h för att blockera den ospecificerade bindningen.
- Serumutspädning och inkubation: bered 3% BSA i PBS som utspädningsbuffert. Späd serumet i utspädningsbufferten som 1:50, 1:150, 1:450, ...... till 1:36450 (3-faldig seriell utspädning rekommenderas). Tillsätt 50 μL utspädd serum till varje brunn och inkubera i 4°C kylskåpet över natten.
- Kassera serumet och tvätta snabbt brunnarna en gång genom att tillsätta 200 μL PBST i varje brunn (skaka det mjukt och kassera sedan). Tvätta sedan långsamt plattorna på skakapparaten med 200 μL PBST tre gånger i 5 minuter vardera.
- Tillsätt 100 μL HRP-märkt sekundär antikropp som är specifik för total IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, utspädd med PBST) och inkubera vid RT i 1 timme. Tvätta plattorna med PBST enligt beskrivningen i 9.4.
- Ta ut lika stor mängd buffert A och buffert B (TMB) från 4 °C lagring och värm upp i minst 30 minuter på RT före användning. Blanda A och B och tillsätt 100 μL TMB i varje brunn och inkubera dem i 10-30 minuter på RT genom att skaka mjukt.
OBS: Detta är en kort beskrivning av TMB Substrate Reagens Set (BD,555214) manualen. - Pipett 100 μL 2M H2SO4 i varje brunn för att avsluta reaktionen. Läs OD450-värdet genom instrument.
- Dataanalys: få det slutliga OD450-värdet genom att subtrahera bakgrundssignalen (OD450-värdet för tom brunn). Rita kurvan som motsvarar en antikroppsisotyp för varje prov med utspädningsfaktorn på X-axeln och OD450-värdet på Y-axeln.
10. Histologi
- Isolera mjältarna på d.p.i 10. Fixera dem i 3,7% formaldehydlösning i 1 timme vid RT. Kassera fixeringsbufferten och tvätta med PBS i 5 minuter på skakapparaten i tre gånger.
- Torka mjältarna i PBS (10% sackaros) vid 4 °C i 1 timme och torka dem sedan i PBS (30% sackaros) vid 4 °C med att skaka mjukt tills mjälten sjunker till botten av 15 ml-röret.
- Ta ut de uttorkade mjältarna, bädda in dem i optimal skärtemperaturförening och kryosectioned.
- Förkyl acetonen vid -20°C. Inkubera vävnadssektionerna med förkyld aceton i 10 minuter. Tvätta vävnaden med PBS i tre gånger.
- Permeabilisera vävnadssektionerna med PBS som innehåller 0,2% Triton X-100 i 20 min och tvätta dem tre gånger med PBS.
- Blockera den icke-specifika bindningen med PBS som innehåller 10% normalt getserum (blockeringsbuffert) i 1 timme vid RT och tvätta vävnadssektionerna med PBS en gång.
- Blockera den icke-specifika bindningen med STREPTAVIDIN/BIOTIN blockeringssats.
OBS: Låt inte proverna torka från detta steg och framåt. - Färgning med primär antikropp: tillsätt blockering av buffertspädd biotin-PNA (25 μg/ml) och råtta antimus-IgD (2,5 μg/ml) på vävnadssektionerna noggrant. Inkubera vävnadssektionerna i våtkammaren i frysen på 4 °C över natten.
- Tvätta snabbt vävnadssektionerna med PBST en gång. Tvätta snabbt vävnadssektionerna i PBST med skakningar långsamt i 5 minuter. Upprepa tvätten tre gånger.
- Späd Alexa Fluor 488-streptavidin (1:500) och Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG (1:500) antikroppar med blockerande buffert och tillsätt dem på vävnadssektionerna noggrant
- Inkubera på RT i 1 h.
- Tvätta vävnadssektionerna enligt steg 10.8 och montera försiktigt med förlängningslösningen. Täck vävnaden med täcken noggrant och håll dem i mörker vid 4 °C tills konfokal analys.
- Analysera storleken på GC-reaktionen genom att räkna GC-talen per områdesstorlek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Karakterisering av mussjuklighet vid influensavirusinfektion
Efter influensavirusinfektion är möss mindre aktiva och anorektiska på grund av sjukdom, vilket återspeglas av svår viktminskning, ett vanligt symptom för att övervaka musmorbiditeten19. Som visas i figur 1abörjade PR8 virusinfekterade möss gå ner i vikt dag 6, nådde den högsta förlustnivån dag 8 och återvände till den ursprungliga nivån på dag 10. Som förväntat observerades inte viktminskning under hela perioden hos PBS-behandlade kontrollmöss. För in vivo-symtom leder virusinfektion till robust lymfocytexpansion i den dränerande lymfkörtlen, mLN i detta fall. Därför observerades betydligt större storlek på mLN hos PR8 virusinfekterade möss än hos kontrollmöss (figur 1b). Sammantaget visade dessa möss alla förväntade symtom och var kvalificerade för den efterföljande Tfh-associerade immunsvarsstudien.
Detektion av Tfh-differentiering och funktionsrelaterade molekyler
För att analysera Tfh differentiering offrades möss dag 5, 7, 10 och 14 efter infektion och mLNs eller mjälte isolerades för flöde cytometri analys. Figur 2a och figur 2b visar Tfh population gating strategi, med Tfh gated som PD-1hej CXCR5hi celler och icke-Tfh som PD-1lågCXCR5låga celler. Med denna gating strategi, kinetiken av Tfh differentiering under influensa virus infektion analyseras. Som visas i figur 2cinitierades Tfh-differentiering dag 5 och nådde sin topp dag 10. Så vi tog prover från dag 10 för vidare analys. Som visas i figur 3a induceradesrobust Tfh-cell differentiering hos influensavirusinfekterade möss jämfört med kontrollmöss. För att analysera influensavirusspecifika Tfh-celler tillsattes fluorokrommärkta IAbNP311–325 MHC klass II-tetramerer (NP311-325)i färgpanelen för polyklonala Tfh-celler (tabell 1). Både i mLN och mjälte från influensavirusinfekterade möss inducerades NP311-325-specifikaCD4+ T-celler signifikant och NP311-325-specifikaTfh-celler kunde analyseras genom tillsats av PD-1 och CXCR5 i analys(Figur 3e). På grund av viktiga roller av Bcl6 i Tfh differentiering, Bcl6+CXCR5+ celler kan också representera Tfh befolkningen. Konsekvent inducerades Tfh-celler som identifierats med denna strategi också kraftfullt (figur 3b). Vi analyseras ytterligare uttryck av Bcl6 i Tfh och icke-Tfh celler. Som visas i figur 3canger högre uttryck av Bcl6 i Tfh-celler än i celler som inte är Tfh framgångsrika Bcl6-färgning. Med liknande strategi, ICOS, analyserades också en annan Tfh-associerad molekyl (Figur 3d). På grund av Tfh-cellernas specialiserade roll i att ge hjälp för B-celler, kan analys av uttrycket av IL21, som huvudsakligen utsöndras av Tfh-celler och demonstreras för att direkt reglera B-cellers överlevnad och spridning, avslöja Tfh-cellers funktion i viss utsträckning. Som visas i figur 3f, intracellulär färgning av IL21 visade att PR8 infektion inducerad betydligt högre produktion av detta cytokin, med ostimulerade celler som gating kontroll. Sammantaget kan dessa analyser återspegla grundläggande information om Tfh-differentiering och ge insikter om B-cellhjälpsförmågan.
Påvisande av utveckling av GC B- och plasmaceller och influensavirusspecifika antikroppar i serum
Huvudfunktionen hos Tfh-celler är att ge B-cellhjälp i GCs, där antikroppsklassväxling och affinitetsmognad uppstår. Så GC B utveckling kan indirekt återspegla differentiering och funktion av Tfh celler. GC B-celler kan portas som B220+PNA+Fas+ celler (Figur 2d). Genom denna gating strategi, vi analyserat kinetiken i GC B cell svar och fann att GC B svar började dag 10 och fortsatte att öka på dag 14 (Figur 2e). Jämförelsen mellan PR8 virusinfekterade och kontrollmöss visade att robust GC B inducerades både i mLN och mjälte efter influensavirusinfektion(Figur 4a), vilket överensstämmer med den inducerade Tfh-differentiering i PRB virusinfekterade möss. Dessutom ger immunofluorescensfärgning med IgD och PNA visualiserade bilder som indikerar inducerad GC-reaktion (grönområden) hos PR8 virusinfekterade möss (Figur 4d). Plasmaceller, identifierade som IgDlågCD138+ celler(Figur 2d), genererades också i PR8 virusinfekterade möss (Figur 4b). Tidigare studier har identifierat att IFNƳ och IL21 kan utsöndras från både Th1- och Tfh-celler vid virusinfektion och inducera IgG2- respektive IgG1-klassbyte,respektive 20. Figur 4c visar genereringen av influensavirusspecifik antikropp genom ELISA-analys av HA-specifik IgM, total IgG, IgG1, IgG2b och IgG2C. Tillsammans återspeglar alla dessa analyser de Tfh-associerade B-cellsvaren vid influensavirusinfektion.
Figur 1: Karakterisering av mussjuklighet. 8 veckor gamla hanmöss smittades med 40 PFU av PR8 influensavirus genom intranasal inokulering. Möss vägdes dagligen i 10 dagar (a) och mLNs isolerades på d.p.i 10 (b). Felstaplarna i (a) representerar medelvärdet ± SD. n = 4 möss per grupp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Gatingstrategi för Tfh-celler och GC B-celler. a)Lymfocyter definieras av FSC-A och SSC-A, och cellsingel är gated med FSC-A, FSC-H och SSC-A, SSC-W. b) Efter gating i CD4+ T-celler används ytmarkörer CD62L och CD44 för att skilja de naiva T-cellerna (CD44loCD62Lhi)och aktiverade T-celler (CD44hiCD62Llo). Polyklonala Tfh-celler kan portas från aktiverade T-celler som PD-1hej CXCR5hi population, omvänt, icke-Tfh celler som PD-1lågCXCR5låg. PR8 virusspecifika Tfh-celler definieras som CD4+CD44+ NP311-325 tetramer+PD-1hej CXCR5hi celler. c,e)I artikel3.1 skall Kinetik av Tfh-frekvens i aktiverade celler (c) och GC B-frekvens i B220+ celler (e). (d) GC B-celler är portade som B220+ PNA+FAS+ celler, och plasmaceller är IgD-CD138+ celler. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Analys av Tfh-differentiering hos PR8-virusinfekterade möss. Möss offrades på d.p.i 10 och mLNs och mjälte isolerades för Tfh differentiering analys. a)Tfh i procent i mLN och mjälte hos PR8 virusinfekterade möss och PBS-behandlade möss (övre panelen). Statistiken över Tfh-celler (nedre panelen). b)Den intracellulära färgningen av Bcl6 i CD4+CD44hi T-celler (övre panelen). Statistiken för Bcl6+CXCR5+ celler (nedre panelen). c)Bcl6- ochd)ICOS-uttryck i Tfh-celler (linjeröda) och icke-Tfh-celler (helgrå). e)Gating av NP311-325-specifikaCD4+ T-celler i mLN och mjälte av PR8 virusinfekterade och PBS-behandlade möss (vänster panel). Procentandelen PR8-virusspecifika Tfh-celler i mLN och mjälte (mittpanelen). "Isotyp" indikerar färgning med irrelevant tetramerkontroll. Statistiken över NP311-325-specifika CD4+ T-celler (höger panel). f)Intracellulär färgning av IL-21 i spleniska CD4+ T-celler från PR8 virusinfekterade och PBS-behandlade möss, den ostimulering som visas som kontroll (vänster). Statistiken över IL-21 färgning (höger). **P < 0.01, ***P < 0.001 och **** P < 0.0001 (tvåstjärtad Students t-test). Felstaplarna representerar medelvärdet ± SD. n = 3 möss per grupp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Analys av GC B-cell-associerade svar hos PR8 virusinfekterade möss. Möss offrades på d.p.i 10 och mLNs och mjälte isolerades för analys. a)Procentandelen GC B-celler (övre panelen). Statistiken över GC B-celler (nedre panelen). b)Procentandel plasmaceller (övre panelen). Statistiken över plasmaceller (nedre panelen). c)Kvantifiering av PR8-virus HA-specifik IgG, IgM, IgG1, IgG2b och IgG2c i serumet (d.p.i 14) hos PR8-virusinfekterade möss och PBS-behandlade möss. d)Konfokal mikroskopi av B-cellsäckar (IgD+, Röd) och GCs (PNA+, Grön) i mjälteproverna av PR8-virusinfekterade möss och PBS-behandlade möss (d.p.i 10). *P < 0,5, **P < 0,01 och ***P < 0,001 (tvåstjärtad students t-test). Felstaplarna representerar medelvärdet ± SD. n = 3 möss per grupp. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| ytmarkör | fluorokrom | Klon | volym per prov(ul) |
| CD4 (CD4) | Percp-eFluor 710 | GK1,5 | 0.2 |
| CD44 (cd44) | eVolve 605 | Snabbmeddelanden7 | 0.2 |
| CD62L (cd62L) | Fitc | MEL-14 (olika personer) | 0.2 |
| ICOS (på andra) | BV421 (BV421) | 7E.17G9 | 0.2 |
| PD1 (PD1) | PE/Cy7 (engelska) | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidin (streptavidin) | Pe | 0.2 |
Tabell 1: Ytmarkör (med undantag för CXCR5) antikroppspanel för färgning av Tfh-celler (PD-1hiCXCR5hi).
| ytmarkör | fluorokrom | Klon | volym per prov(ul) |
| CD4 (CD4) | Percp-eFluor 710 | GK1,5 | 0.2 |
| CD44 (cd44) | Fitc | Snabbmeddelanden7 | 0.2 |
| PD1 (PD1) | PE/Cy7 (engelska) | 29F.1A12 | 0.3 |
| Streptavidin (streptavidin) | BV421 (BV421) | 0.5 |
Tabell 2: Ytmarkörantikroppar (utom CXCR5) för färgning av Bcl6 i Tfh-celler.
| ytmarkör | fluorokrom | Klon | volym per prov(ul) |
| CD4 (CD4) | Percp-eFluor 710 | GK1,5 | 0.2 |
| CD44 (cd44) | Fitc | Snabbmeddelanden7 | 0.2 |
Tabell 3: Antikroppspanel för ytmarkör för intracellulär färgning av IL21.
| ytmarkör | fluorokrom | Klon | volym per prov(ul) |
| B220 (B220) | Apc | RA3-6B2 | 0.2 |
| Igd | eFluor 450 | 11-26c | 0.2 |
| CD95 (cd95) | PE/Cy7 (engelska) | Jo2 (jo2) | 0.3 |
| Pna | Fitc | 0.3 | |
| CD138 (cd138) | Pe | 281-2 | 0.2 |
Tabell 4: Antikroppspanel för ytmarkör för färgning av GC B- och plasma B-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av specialiserade roller i att ge B-cellshjälp för att generera hög affinitetsantikroppar har Tfh-celler studerats utförligt i mekanismerna för differentiering och manipulation för att tillhandahålla nya strategier för vaccindesign. Influensavirusinfektion inducerar kraftfulla Tfh- och GC B-cellers svar, vilket är en lämplig modell för detta forskningsområde. I detta dokument beskrev vi protokoll av influensa virus infektion genom intranasal inokulering, utvärdering av Tfh-associerade svar av flöde cytometri, immunofluorescens och ELISA. Dessa analyser kommer att underlätta detektion av Tfh-differentiering, GC B-utveckling och influensavirusspecifika antikroppar och hjälpa forskare att utforska och identifiera nya viktiga molekyler i immunsvaret.
I studier med influensavirusinfekterade mössmodeller är viktminskning en vanlig indikator på mussjuklighet. Den förväntade viktförändringskinetiken hos influensavirusinfekterade möss beskrivs i figur 1a, som återspeglar lämpligt immunsvar som induceras hos mössen. Onormala fall skulle dock regelbundet uppstå, där mössen förlorar sin vikt eller inte visar någon viktminskning under hela observationsperioden. Enligt våra erfarenheter skulle dessa möss mestadels bära onormalt lägre eller högre immunsvar, vilket stör experimentresultaten. För att undvika sådana variationer bör för det första möss som används i experimentet vara kön och åldersmatchade för att garantera liknande mottaglig förmåga till virus. Konsekvent virus titer för varje mus är också viktigt21. Virus titern som används i detta protokoll är 40 PFU. Virus titer att inducera lämplig vikt förändring kinetik i varje labb kan dock varieras på grund av inkonsekvensen i virus titer utvärdering förfarande och mus stammar som används i experimentet. Så vi rekommenderar titrering av virus titer för infektion är nödvändigt före immunsvar-relevant studie.
I detta protokoll identifierade vi Tfh celler med ofta använda markörer PD-1, CXCR5 och den väsentliga transkription faktor Bcl6. Även om både PD-1hejCXCR5hej och Bcl6+CXCR5+ celler kan betecknas som Tfh celler, representerar de olika populationer och har inte föregångaren-avkomma förhållandet baserat på det faktum att inte alla PD-1hejCXCR5hi celler är Bcl6+ och inte alla Bcl6+CXCR5hi celler är PD-1hejCXCR5hi hi. Denna fenotyp kan förklaras av heterogeniteten hos Bcl6 uttryck i Tfh celler22. ICOS, en kritisk molekyl för både Tfh differentiering och migration bör också ingå i analysen av Tfh differentiering. Dessutom bör andra funktionsrelaterade samstimulerande molekyler, såsom OX40 och CD40L, också detekteras för deras uttrycksnivå, men inte inkluderas i detta protokoll. IL21 och IL4 är båda Tfh-utsöndrade cytokiner som spelar roller för att inducera IgG1 klassbyte. Protokollet för identifiering av IL21-uttryck beskrivs i det här dokumentet. På grund av svårigheten att upptäcka IL4 i Tfh-celler användes il4-GFP-reportermöss i tidigare studier23. I detta protokoll använde vi också fluorokrome-märkta NP tetramerer för att upptäcka NP311-325-specifikaTfh celler. Gränsen för mängden NP311-325-specifikaTfh-celler ger dock svårigheten att ytterligare analysera. Därför är adoptivöverföringsexperiment av influensa hemagglutinin specifika TCR transgena (Tg) CD4+ (TS-1) T-celler, som kan isoleras från TS-1 möss, en alternativ strategi för att lösa detta problem24.
Här identifierade vi GC B som B220+PNA+Fas+ celler i flöde cytometri färgning. En alternativ markörkombinationsstrategi för att definiera GC B som GL7hiFashi-celler används också i andra papper14,16. Vi använder också immunofluorescens för att visualisera GCs med kombination av anti-IgD och PNA. Häri kan tillägg av CD3-antikropp hjälpa till att visualisera Tfh-celler, vilket möjliggör studier av interaktionen mellan dessa två celltyper10.
Med tanke på differentiering av Tfh-celler är en multistage- och multifaktoriell process, är ytterligare analys av andra signifikanta molekyler vid flera tidpunkter nödvändig för att klargöra mer detaljerad mekanism vid Tfh-differentiering. Dessutom används parametrar som detekteras här också ofta i andra modeller18. Därför, förutom vid influensavirusinfektion, protokoll som beskrivs här, särskilt den immunostaining delen, kan också ge instruktioner i Tfh-associerade studier med andra modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar personalen vid flödescytometrianläggningen, ABSL2-anläggningen och SPF:s djuranläggning vid Institut Pasteur i Shanghai för deras tekniska hjälp och råd. Detta arbete stöddes av följande bidrag: Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences (XDB29030103), National Key FoU Program of China (2016YFA0502202), National Natural Science Foundation of China (31570886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunostaining of Tfh cells, NP-specific Tfh cells and Bcl-6 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| Anti-CD16/32 mouse | Thermo Fisher Scientific | 14-0161-86 | |
| APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer | NIH | ||
| Bcl-6 PE | Biolegend | 358504 | clone:7D1 |
| Biotin-CXCR5 | Thermo Fisher Scientific | 13-7185-82 | clone: SPRCL5 |
| CD4 Percp-eFluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-0041-82 | clone:GK1.5 |
| CD44 eVolve 605 | Thermo Fisher Scientifi | 83-0441-42 | clone:IM7 |
| CD44 FITC | Thermo Fisher Scientifi | 11-0441-82 | clone:IM7 |
| CD62L FITC | BD Pharmingen | 553150 | clone:MEL-14 |
| ICOS BV421 | Biolegend | 564070 | clone:7E.17G9 |
| PD1 PE/Cy7 | Biolegend | 135216 | clone:29F.1A12 |
| Streptavidin BV421 | BD Pharmingen | 563259 | |
| Streptavidin PE | BD Pharmingen | 554081 | |
| Intracelluar staining of IL21 | |||
| 37% formaldehyde | Sigma | F1635 | |
| anti-human IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 109-605-098 | |
| Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
| human FCc IL-21 receptor | R&D System | ||
| ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell staining kit | Thermo Fisher Scientific | L34966 | |
| PMA | Sigma | P1585 | |
| Saponin | MP | 102855 | |
| GC B and plasma cells staining | |||
| B220 APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0452-81 | clone:RA3-6B2 |
| CD138 PE | BD Pharmingen | 561070 | clone:281-2 |
| CD95 (FAS) PE/Cy7 | BD Pharmingen | 557653 | clone:Jo2 |
| IgD eFluor 450 | Thermo Fisher Scientific | 48-5993-82 | clone:11-26c |
| PNA FITC | Sigma | L7381 | |
| Assay of HA-specific antibody titer with ELISA | |||
| PR8-HA | Sino Biological | 11684-V08H | |
| BSA | SSBC | ||
| Goat anti mouse Ig (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgM (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG1 (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2b (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| Goat anti mouse IgG2c (SBA Clonotyping System-HRP) | SouthernBiotech | 5300-05 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Pharmingen | 555214 | |
| Histology | |||
| Alexa Fluor 555-Goat-anti rat IgG | Life Technology | A21434 | |
| anti-mouse IgD | Biolegend | 405702 | |
| biotinylated PNA | Vector laboratories | B-1075 | |
| dilute Alexa Fluor 488-streptavidin | Life Technology | S11223 | |
| normal goat serum | SouthernBiotech | 0060-01 | |
| Pro-long gold antifade reagent | Thermo Fisher Scientific | P3630 | |
| STREPTAVIDIN/BIOTIN blocking kit | Vector laboratories | SP-2002 |
References
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Pedros, C., et al. A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1. Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).
- Xu, H., et al. Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility. Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).
- Lee, S. K., et al. B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).
- Zotos, D., et al. IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism. The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).
- Vogelzang, A., et al. A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells. Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).
- Ansel, K. M., et al. A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles. Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).
- Shi, J., et al. PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function. Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).
- Methot, S. P., Di Noia, J. M. Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination. Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).
- Calame, K. L. Plasma cells: finding new light at the end of B cell development. Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).
- Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection. The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).
- Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability. Nature Communications. 5, 3495 (2014).
- He, L., et al. Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).
- León, B., et al. Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells. Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).
- Wang, H., et al. The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells. Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).
- Bouvier, N. M., Lowen, A. C. Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission. Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).
- Miyauchi, K., et al. Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells. Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).
- Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection. Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).
- Kitano, M., et al. Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity. Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).
- Yusuf, I., et al. Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150). The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).
- Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs. Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).
