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Biochemistry

रिंग-टाइप E3 सर्वव्यापी लिगैसइन विट्रो और प्लांटा में कार्यात्मक लक्षण वर्णन

Published: December 5, 2019 doi: 10.3791/60533
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2, 1, 2
1Department of Entomology, Plant Pathology and Nematology, University of Idaho, 2Department of Plant Sciences, University of Idaho

Summary

इस पांडुलिपि का लक्ष्य रिंग-प्रकार ई 3 सर्वव्यापक लिगैसों के व्यापक जैव रासायनिक और कार्यात्मक अध्ययनों के लिए एक रूपरेखा पेश करना है। विस्तृत प्रोटोकॉल के साथ यह मल्टीस्टेप पाइपलाइन, परीक्षण किए गए प्रोटीन की एक एंजाइमैटिक गतिविधि को मान्य करती है और यह दर्शाती है कि गतिविधि को कार्य करने के लिए कैसे लिंक किया जाए।

Abstract

सर्वव्यापकता, प्रोटीन के एक पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन के रूप में, यूकेरियोटिक कोशिकाओं के होमोस्टिसिस में एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाती है। पॉलीयूबिक्विटिन श्रृंखला की लंबाई और टोपोलॉजी के आधार पर 76 अमीनो एसिड सर्वव्यापकता के सहसंयोजक लगाव के परिणामस्वरूप प्रोटीन क्षरण से लेकर स्थानीयकरण में परिवर्तन और/या संशोधित प्रोटीन की गतिविधि तक विभिन्न परिणाम हो सकते हैं। तीन एंजाइम क्रमिक रूप से सर्वव्यापी प्रक्रिया को उत्प्रेरक करते हैं: E1 सर्वव्यापी-सक्रिय एंजाइम, E2 सर्वव्यापी-conjugating एंजाइम, और E3 सर्वव्यापक लिगासे। E3 सर्वव्यापी लिगासे सब्सट्रेट विशिष्टता निर्धारित करता है और इसलिए, एक बहुत ही दिलचस्प अध्ययन विषय का प्रतिनिधित्व करता है। यहां हम रिंग-टाइप ई3 सर्वव्यापक लिगास के एंजाइमैटिक गतिविधि और कार्य के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं। यह चार चरण प्रोटोकॉल 1 का वर्णन करता है) संरक्षित रिंग डोमेन पर लक्षित साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस के माध्यम से ई 3 लिगास की कमी उत्परिवर्ती कैसे उत्पन्न करें; 2-3) विट्रो और प्लांटा दोनों में सर्वव्यापी गतिविधि की जांच कैसे करें; 4) उन जैव रासायनिक विश्लेषण को परीक्षण प्रोटीन के जैविक महत्व से कैसे जोड़ें। एक E3 लिगाज-कमी उत्परिवर्ती की पीढ़ी जो अभी भी अपने सब्सट्रेट के साथ बातचीत करती है लेकिन अब इसे गिरावट के लिए सर्वव्यापी नहीं करती है, वीवो में एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन के परीक्षण की सुविधा प्रदान करती है। इसके अलावा, संरक्षित रिंग डोमेन में उत्परिवर्तन अक्सर एक प्रमुख नकारात्मक फेनोटाइप प्रदान करता है जिसका उपयोग आरएनए-हस्तक्षेप दृष्टिकोण के वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में कार्यात्मक नॉकआउट अध्ययनमें किया जा सकता है। हमारे तरीकों को पौधे परजीवी सूत्रकृमि प्रभावक RHA1B की जैविक भूमिका की जांच करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जो परजीवीवाद को बढ़ावा देने के लिए पौधे की कोशिकाओं में मेजबान सर्वव्यापकता प्रणाली का अपहरण करता है। वीवो अभिव्यक्ति प्रणाली में मामूली संशोधन के साथ, इस प्रोटोकॉल को इसके मूल की परवाह किए बिना किसी भी रिंग-प्रकार E3 लिगाज़ के विश्लेषण पर लागू किया जा सकता है।

Introduction

E3 सर्वव्यापी liगैसों के विशाल बहुमत अंगूठी के हैं(आरeally मैंnteresting New Gene)- प्रकार प्रोटीन । रिंग-फिंगर डोमेन को मूल रूप से फ्रीमोंट एट अलद्वारा पहचाना गया था। 1 और कार्यात्मक प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन2मध्यस्थता के रूप में वर्णित है । विहित रिंग फिंगर एक विशेष प्रकार का जिंक समन्वय डोमेन है जिसे आठ संरक्षित सीवाईएस (सी) और उनके (एच) के सर्वसम्मति अनुक्रमके रूप में परिभाषित किया गया है, जो विशेष रूप से अन्य अमीनो एसिड अवशेषों (एक्स), सी-एक्स 2-सी-एक्स9-39-सी-एक्स1-3-एच-एक्स2-सी-एच-एक्स2-सी-एक्स 2-सी-एक्स4-सी-एक्स-सी-सी-सीद्वारा स्थान पर है । दो Zn2 + आयनों सी1/सी2 और सी/एच5/सी6 के साथ अद्वितीय "क्रॉस-ब्रेस" टोपोलॉजी के माध्यम से कोर सी और एच अवशेषों द्वारा स्थिर कर रहे है पहले Zn2 + आयन जबकि सी3/एच4 और सी7/सी8 दूसरे बांध(चित्रा 1ए)3,4। पांचवें Zn2 +-समंवय साइट में सी या एच की उपस्थिति के आधार पर, रिंग-फिंगर प्रोटीन के दो विहित उपवर्गों को परिभाषित किया गया था: C3HC4 और C3H2C3 (रिंग-एचसी और रिंग-एच 2, क्रमशः)। क्योंकि E3 सर्वव्यापी लिगास का रिंग डोमेन E2 conjugating एंजाइमों और सब्सट्रेट्स के बीच बातचीत में मध्यस्थता करता है, इन आवश्यक सी और एच अवशेषों के उत्परिवर्तन को लिगास गतिविधि5को बाधित करने के लिए दिखाया गया है। रिंग E3 लिगैसों के एक अतिरिक्त पांच कम आम उपवर्गों का वर्णन किया गया है (रिंग-वी, रिंग-सी 2, रिंग-डी, रिंग-एस/टी, और रिंग-जी)6। रिंग-टाइप E3 सर्वव्यापी लिगैसों को सरल और जटिल E3 एंजाइमों में और अधिक विभाजित किया जा सकता है। सरल एकल उपइकाई रिंग E3 लिगैसों में सब्सट्रेट मान्यता साइट और ई 2-बाध्यकारी रिंग डोमेन दोनों होते हैं। इसके विपरीत, मल्टीसबयूनिट रिंग-टाइप ई 3 कॉम्प्लेक्स या तो ई 2-सर्वव्यापक मध्यवर्ती के बाध्यकारी के सब्सट्रेट की भर्ती करता है। रिंग डोमेन लायस अवशेष (एस) जो स्वयं-सर्वव्यापकता के लिए प्राथमिक सर्वव्यापी लगाव साइट (एस) के रूप में कार्य करता है, E3 लिगाज़ गतिविधि के लिए भी महत्वपूर्ण हो सकता है।

सभी रिंग युक्त प्रोटीन E3 लिगैसके रूप में कार्य नहीं करते हैं। इस प्रकार, रिंग-फिंगर डोमेन की बायोइन्फॉर्मेटिक भविष्यवाणी और ई 2-निर्भर प्रोटीन सर्वव्यापकता के लिए क्षमता को जैव रासायनिक रूप से मान्य किया जाना चाहिए और परीक्षण किए गए प्रोटीन की जैविक भूमिका से जोड़ा जाना चाहिए। यहां, हम एक चरण-दर-कदम प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसमें साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस दृष्टिकोण के माध्यम से रिंग-प्रकार ई 3 सर्वव्यापी लिगैसों की एंजाइमैटिक गतिविधि का पता लगाने और कार्यात्मक रूप से विशेषता है। इस पाइपलाइन से प्रतिनिधि परिणाम रिंग-प्रकार E3 लिगाज़ RHA1B के लिए दिखाए जाते हैं। RHA1B पौधे की प्रतिरक्षा को दबाने और पौधे की जड़ कोशिकाओं की आकृति विज्ञान में हेरफेर करने के लिए पौधे परजीवी पुटी नेमाटोड ग्लोबोडेरा पैलिडा द्वारा उत्पादित एक प्रभावक प्रोटीन है। रोगजनक/परजीवी आक्रमण से खुद को बचाने के लिए, पौधों ने न्यूक्लियोटाइड-बाध्यकारी डोमेन और ल्यूसिन-रिच रिपीट (एनबी-एलआरआर) प्रकार के प्रतिरक्षा रिसेप्टर्स विकसित किए हैं जो रोगजनक या परजीवी की उपस्थिति का पता लगाते हैं और परिणामस्वरूप, अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया (एचआर) विकसित करते हैं, जो रोगजनकों के उपनिवेशको रोकने के लिए संक्रमण स्थल पर होने वाली तीव्र और स्थानीयकृत कोशिका मृत्यु का एक रूप है। ऐसा ही एक प्रतिरक्षा रिसेप्टर आलू Gpa2 प्रोटीन है जो जी पैलिडा (क्षेत्र की आबादी D383 और D372)7के कुछ अलग-अलग लोगों के प्रतिरोध प्रदान करता है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हाल ही में पाया गया है कि RHA1B सर्वव्यापकता और क्षरण8के लिए संयंत्र Gpa2 इम्यूनोरिसेप्टर को लक्षित करके ई 3-निर्भर तरीके से पौधे प्रतिरक्षा संकेत के साथ हस्तक्षेप करता है।

Protocol

1. साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस(चित्र ा 1)

  1. रिंग डोमेन में संरक्षित Cys और उसके अमीनो एसिड की पहचान करें(चित्रा 1ए)और डिजाइन प्राइमर म्यूटेशन साइट के दोनों ओर 15 आधार जोड़े द्वारा पार्श्व ब्याज के प्रतिस्थापन कोडन ले जाने(चित्र 1बी)।
  2. पीसीआर आधारित प्रवर्धन द्वारा वांछित उत्परिवर्तन का परिचय, जिसमें मुतर्जेनिक प्राइमर और उच्च निष्ठा डीएनए पॉलीमरेज का उपयोग करके ब्याज के जीन को शरण दी गई है, जिसमें कुल पीसीआर प्रतिक्रिया मात्रा के 50 माइक्रोन में Pfu युक्त है जैसा कि निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार तालिका 1 और तालिका 2 में दिखाया गया है।
  3. एस्चेरिचिया कोलाईको डाइजेस्ट-व्युत्पन्न माता-पिता मेथाइलेटेड और अर्ध-मेथाइल डीएनए को सीधे पीसीआर रिएक्शन (स्टेप १.२) में डीपीनी प्रतिबंध एंजाइम के 3 माइक्रोन जोड़कर और 2 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके ।
    नोट: मिथाइलेशन एक पोस्टट्रांसक्रिप्शन प्रोटीन संशोधन है जिसे बैक्टीरिया से उत्पादित और अलग प्लाज्मिड में जोड़ा जाता है। पीसीआर जनित प्लाज्मिड की नई प्रतियों में मिथाइलेशन की कमी है, इसलिए डीपीएनआई ट्रीटमेंट के दौरान नई कॉपियां ज्यों की त्यों बनी रहेंगी।
  4. स्पिन कॉलम तकनीक के आधार पर एक वाणिज्यिक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर उत्परिवर्तित प्लाज्मिड को शुद्ध करें और डीएनए को 50 माइक्रोन पानी के साथ एल्यूट करें।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार बरामद म्यूटाजेनाइज्ड प्लाज्मिड डीएनए के 0.5 माइक्रोन के साथ DH5α ई. कोलाई रासायनिक रूप से सक्षम कोशिकाओं को बदलें। संक्षेप में, 30 00 के लिए बर्फ पर डीएनए के साथ इनक्यूबेट सक्षम कोशिकाओं, तो गर्मी-42 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस के लिए उन्हें झटका, और 2 टिन के लिए बर्फ पर फिर से ट्यूब जगह है। 250 आरपीएम पर 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एलबी मीडिया के 500 माइक्रोन के साथ इनक्यूबेट कोशिकाएं और फिर उन्हें चुनिंदा पेट्स पर फैलाएं।
  6. ई. कोलाईसे अलग डीएनए प्लाज्मिड ्स अनुक्रमण सेंगर द्वारा वांछित उत्परिवर्तन सत्यापित करें।

2. पुनः संयोजन प्रोटीन शुद्धि और इन विट्रो सर्वव्यापकता परख

  1. पीमाल-सी2 वेक्टर में जंगली प्रकार की अंगूठी और उत्परिवर्तित रिंग जीन को क्लोन करें (निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें; तालिका 3) एमबीपी एपिटोप टैग के साथ इन जीनों को फ्यूज करने के लिए जो एमिलोज राल का उपयोग करके एक-चरण शुद्धि की अनुमति देता है। चरण 1.5 में वर्णित ई. कोलाई BL21 तनाव में परिणामी निर्माण का परिचय दें।
  2. ई. कोलाई तनाव BL21 2-3 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 मीटर पौंड तरल माध्यम में वांछित निर्माण बंदरगाह जब तक यह logarithmic चरण (0.4-0.6 के OD600) तक पहुंचता है।
  3. एमबीपी-टैग किए गए प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए आईपीटीजी को 0.1-1 एमएम की अंतिम एकाग्रता में जोड़ें और ई कोलाई संस्कृति को 28 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। ऊष्मायन के बाद संस्कृति को बर्फ पर रखें।
    नोट: प्रोटीन को गिरावट से बचाने के लिए बर्फ पर 2.4-2.13 कदम उठाएं।
  4. प्रेरण दक्षता की जांच करने के लिए, प्रेरित कोशिकाओं के 1.5 mL एकत्र करें, उन्हें 2 मिन के लिए 13,000 x ग्राम पर स्पिन करें, सुपरनेटेंट को हटा दें, और 2x एसडीएस-पेज लोडिंग बफर (24 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 6.8, 0.8% एसडी, 10% (v/v) ग्लाइसेल, 4 एमएम डीटीटी, 0.04% (w/v) ब्रोमोप्नो ब्लूल के 20 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  5. 5 मिन के लिए नमूनों को उबालें और उन्हें 10% एसडीएस-पेज जेल पर चलाएं। एमबीपी-फ्यूजन प्रोटीन (ब्याज के प्रोटीन का आणविक वजन + 42.5 केडीए एमबीपी) के संचय का नेत्रहीन मूल्यांकन करने के लिए, कूमासी धुंधला बफर (50% मेथनॉल, 10% एसिटिक एसिड, 0.1% कूमासी ब्लू) के साथ आंदोलन करके 20 मिन के लिए जेल को दाग दें और रात भर destaining डिस्टेनिंग बफर (20% मेथनॉल, 10% एसिटिक एसिड)।
  6. शेष ई. कोलाई कोशिकाओं को 6 मिन के लिए 1,350 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा काटें, सुपरनेटेंट को त्यागें, और सेल पेलेट को कॉलम बफर (20 एम ट्राई एचसीएल, 200 एम एम नैल, 1 एम ईटीए, बैक्टीरियल प्रोटीज़ अवरोधक) के साथ फिर से निलंबित करें।
    नोट: यह रात भर प्रोटोकॉल को रोकने के लिए एक अच्छी जगह है। फ्रोजन कोशिकाओं को -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 सप्ताह तक संग्रहित किया जा सकता है।
  7. एक बर्फ पानी स्नान में बैक्टीरिया युक्त ट्यूब रखकर ई. कोलाई कोशिकाओं को तोड़ें और 10 ध्वनि चक्र लागू: 30% amp पर 10 एस ध्वनिकरण 20 एस टूट के बाद ।
  8. 10 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज नमूना और सुपरनेटेंट (क्रूड निकालने) को बचाने के लिए।
  9. 15 एमएल ट्यूब में एमिलोज रेसिन के 500 माइक्रोन तैयार करें। ठंडे कॉलम बफर के 10 मिलीग्राम और 1,800 x ग्राम,5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्री डालकर रेसिन धोएं। यह 2x करें।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात एमिलोज रेसिन और इनक्यूबेट के साथ ट्यूब में क्रूड निकालने का 5 mL जोड़ें।
  11. 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज और सुपरनेटेंट को त्याग दें।
  12. 20 मीटर के लिए रेसिन गोली और इनक्यूबेट में कॉलम बफर के 10 mL जोड़ें। फिर 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। इस चरण को 2x दोहराएं।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक नमूना इनक्यूबेटिंग करके 10 mM माल्टोज युक्त कॉलम बफर के 0.5 mL के साथ संलयन प्रोटीन को एल्यूट करें। 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1,800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और उत्सर्जन प्रोटीन इकट्ठा। इस कदम को दोहराएं 2x।
  14. ठंडे पीबीएस के खिलाफ प्रोटीन अंश का डायलिसि 1 मिलीएल। फ्रीज-विगलन से बचने के लिए एकल उपयोग ट्यूबों (10-20 माइक्रोन) में अलीकोट प्रोटीन और जरूरत होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  15. ब्रैडफोर्ड परख9का उपयोग कर प्रोटीन एकाग्रता उपाय ।
  16. E1 के ४० एनजी (जैसे, AtUBA1), E2 के १०० एनजी (जैसे, AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/27/32), 1 μg MBP-रिंग प्रकार, 1 μg MBP-रिंग प्रकार, 1 μg MBP-रिंग प्रकार, प्रोटीन, 1 μgMBP-रिंग प्रकार, और सर्वव्यापकता बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 7.5, 2 एमएम एटीपी, 5 एमएम एमजीसीएल2,30 मीटर क्रिएटिन फॉस्फेट, 50 μg/mL क्रिएटिन फॉस्फोकिनेज) में 2 μg FLAG-Ub (या HA-Ub) । मिश्रण को 2 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: प्रीमेक 20x सर्वव्यापकता बफर और इसे एक ही उपयोग के लिए छोटे aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर 6 महीने तक स्टोर करें। क्रिएटिन फॉस्फोकिनेज़ आसानी से अपनी एंजाइमैटिक गतिविधि खो देता है जब बफर गल जाता है और बार-बार जमे हुए होता है।
  17. 5x SDS-पेज लोडिंग बफर (60 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 6.8, 2% एसडीएस, 25% (v/v) ग्लाइसेरोल, 10 एमएम डीटीटी, 0.1% (w/v) ब्रोमोफेनॉल ब्लू) और 5 मिन के लिए उबलते के 7.5 माइक्रोन के साथ 30 माइक्रोन नमूनों को मिलाकर प्रतिक्रिया समाप्त करें।
  18. प्रोटीन को 7.5% एसडीएस-पॉलीएक्रिलैमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस (एसडीएस-पेज) के साथ अलग करें, फिर पीडीवीएफ झिल्ली पर स्थानांतरित करें, और एंटी-फ्लैग (या एंटी-एचए) का उपयोग करके पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा सर्वव्यापीता का पता लगाएं।
  19. परीक्षण किए गए एमबीपी-रिंग-प्रकार प्रोटीन के समान लोडिंग को सत्यापित करने के लिए कूमस्सी नीले रंग के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को दाग दें।

3. एग्रोबैक्टीरियम -निकोतियाना बेंथमियाना पत्तियों में और प्लांटा सर्वव्यापकता परख में क्षणिक प्रोटीन अभिव्यक्ति

  1. स्ट्रीक उपयुक्त एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफैक्सियंस ने उचित चयन एंटीबायोटिक दवाओं वाले एलबी माध्यम पर नियंत्रण के रूप में एपिटोप-टैग किए गए जीन (जैसे, एचए-आरएचए1बी, एचए-आरए1बीK146R,एचए-यूबी) और खाली वेक्टर को ले जाने वाले उपभेदों को नियंत्रित किया।
  2. 28 डिग्री सेल्सियस की वृद्धि के 2 दिनों के बाद, एकल उपनिवेशों को उठाएं और उन्हें एक और 24 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस/250 आरपीएम पर उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पौंड तरल माध्यम में विकसित करें।
  3. उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 3 मिलीएल ताजा पौंड के लिए कृषि जीवाणु संस्कृति के 100 μL स्थानांतरित करें और देर से घातीय विकास चरण के लिए रोटेशन (250 आरपीएम) के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 4-6 घंटे के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
  4. 6 मिन के लिए 1,800 x ग्राम पर एग्रोबैक्टीरियल कोशिकाओं को स्पिन करें, सुपरनेटेंट को त्यागें, और 3 एमएल वॉश बफर (50 एमएम एमईएस पीएच 5.6, 28 एमएम ग्लूकोज, 2 एमएम एएच2पीओ4)के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। इस कदम को दोहराएं 2x।
  5. दूसरे वॉश के बाद इंडक्शन बफर (50 एमएम एमईएस पीएच 5.6, 28 एमएम ग्लूकोज, 2 एमएम एनएएच2पीओ4, 200 माइक्रोएम एसीटोसिरिंगोन, 37 एमएम एनएच4सीएल, 5 एमएम एमजीएसओ4.7एच2ओ, 4 एमएम केसीएल, 18 माइक्रोन फेसो 4.7एच 2 ओ, 2 एमएम केसीएल, 18 माइक्रोन फेसो4.7एच2ओ, 2 एमएम सीएसीएल2)में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। 28 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 10-12 घंटे के लिए इंडक्शन बफर के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: Acetosyringone टी डीएनए हस्तांतरण लाती है ।
  6. 6 मिन के लिए 1,800 x ग्राम पर कोशिकाओं को केंद्रीकृत करें, सुपरनेटेंट को त्यागें, और घुसपैठ बफर (10 एमएम एमईएस पीएच 5.5, 200 माइक्रोएम एसीटोसिरिंगोन) के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    नोट: यदि एग्रोबैक्टीरिया प्रेरण बफर के साथ ऊष्मायन के बाद कुल, एकत्रित कोशिकाओं को कुछ मिनटों के लिए बेंच पर छोड़कर ट्यूब के नीचे सिंक करते हैं, और चरण 3.6 के साथ आगे बढ़ने से पहले स्पष्ट एग्रोबैक्टीरियम निलंबन को एक नई ट्यूब पर स्थानांतरित कर ते हैं।
  7. ओडी600 मूल्य (600 एनएम के अवशोषण में ऑप्टिकल घनत्व) का उपयोग करबैक्टीरिया की एकाग्रता को मापें। वांछित लोगों के लिए OD600 मूल्यों को समायोजित करें।
    नोट: आमतौर पर 0.2-0.4 के बीच एक ओडी600 मूल्य एक एग्रोबैक्टीरियल दाग अभिव्यक्ति के लिए सबसे अच्छा काम करता है। यदि विभिन्न एग्रोबैक्टीरियल उपभेदों का संयोजन लागू किया जाता है, तो एग्रोबैक्टीरियल उपभेदों के कुल ओडी600 मूल्य 1 से अधिक नहीं होने चाहिए।
  8. एग्रोघुसपैठ 4 सप्ताह पुरानी एन बेथमियाना उन्हें धीरे से सुई से चुभने से छोड़ देता है, जिसके बाद सुई के बिना सिरिंज के साथ एग्रोबैक्टीरियम को हाथ से इंजेक्ट किया जाता है । मार्कर के साथ घुसपैठ वाले पत्ते क्षेत्र को सर्कल करें (आमतौर पर व्यास में 1-2 सेमी)।
  9. घुसपैठ के बाद 36 घंटे ऊतकों को इकट्ठा करें। टिश्यू को लिक्विड नाइट्रोजन के साथ बारीक पाउडर में पीस लें।
  10. प्रोटीन निष्कर्षण बफर के 300 माइक्रोन के साथ पुनः निलंबित ऊतक पाउडर (50 mM Tris-HCl पीएच 7.5, 150 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम ईटीए, 2 एमएम डीटीटी, 10% ग्लाइरोल, 1% पॉलीविनाइलपॉलीपाइरियोलडोन, 1 एमएम पीएमएसएफ, प्लांट प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए 15,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  11. एक नई ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण। 1x की अंतिम एकाग्रता में 5x एसडीएस-पेज लोडिंग बफर जोड़ें और 5 मिन के लिए उबाललें।
  12. 10% एसडीएस-पेज जैल पर अलग कच्चे प्रोटीन, पीवीडीएफ झिल्ली पर स्थानांतरित करें, और प्लांटा सर्वव्यापकता में पता लगाने के लिए एंटी-एचए के साथ जांच करें।

4. एंजाइमैटिक गतिविधि और प्लांटा में समारोह के बीच की कड़ी की स्थापना

नोट: उदाहरण के लिए, RHA1B एचआर सेल मौत को दबाने के लिए प्रतिरोधी प्रोटीन GPa2 के क्षरण को बढ़ावा देता है । इस कदम से पता चलता है कि कैसे सत्यापित करने के लिए कि RHA1B की उन उग्र गतिविधियों E3 निर्भर हैं ।

  1. लकीर उपयुक्त एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफैक्सिस उपभेदों को टैग किए गए जीन ऑफ इंटरेस्ट (इस उदाहरण में एचए-आरए1बी, एचए-आरएचए1बीसी 135एस,एचए-आरए1बीK146R,myc-Gpa2, RBP1) और एक नियंत्रण के रूप में खाली वेक्टर। एन बेथामिया के पत्तों पर एग्रोबैक्टीरियम तैयार करने और इंजेक्शन के लिए चरण 3.1-3.8 का पालन करें।
  2. E3-निर्भर सब्सट्रेट प्रोटीन क्षरण के लिए, चरण 3.9-3.12 का पालन करें और पौधे की कोशिकाओं (जैसे, एंटी-एचए और एंटी-MYC) में प्रोटीन संचय का पता लगाने के लिए उपयुक्त एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी दाग प्रदर्शन करें।
  3. E3-निर्भर अतिसंवेदनशील प्रतिक्रिया (एचआर) मध्यस्थता सेल मौत अवरोध के लिए, घुसपैठ के 2-4 दिनों के बाद मानव संसाधन सेल मौत के लक्षणों के लिए कृषि घुसपैठ पत्तियों की निगरानी करें।

Representative Results

इस खंड में, एक उपइकाई E3 सर्वव्यापी लिगासे RHA1B की जांच के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रदान किए जाते हैं जिसमें प्रोसाइट-भविष्यवाणी रिंग-एच 2 प्रकार डोमेन (132-176 अमीनो एसिड)10है। जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है, E3-कमी वाले उत्परिवर्ती प्रोटीन प्राप्त करने के लिए, रिंग डोमेन में आठ संरक्षित सीएस या एचएस में से कम से कम एक(चित्रा 1ए)को उत्परिवर्तनित करने की आवश्यकता है(चित्रा 1बी)। इस प्रकार, पहले चरण के रूप में, RHA1B के दो उत्परिवर्ती संस्करण, RHA1BC135S (रिंग डोमेन के संरक्षित सी3 में सेर द्वारा सीवाईएस का प्रतिस्थापन) और RHA1BK146R (RHA1B में मौजूद एकमात्र Lys में एआरजी द्वारा Lys का प्रतिस्थापन) उत्पन्न किया गया था। हालांकि एकल उपइकाई E3 liगैस मध्यस्थता सर्वव्यापी से सर्वव्यापकता हस्तांतरण E2 बंदरगाह के बजाय सीधे सर्वव्यापी के साथ बातचीत, Lys में E3 के आत्म सर्वव्यापीअपनी अधिकतम एंजाइमैटिक गतिविधि के लिए आवश्यक हो सकता है ।

चित्रा 2ए में पश्चिमी दाग परिणाम एक ठेठ सकारात्मक इन विट्रो सर्वव्यापकता परख परिणाम दिखाते हैं, जिसमें एक बहुबंधन धब्बा परीक्षण प्रोटीन (जैसे, एमपीबी-फ्यूज्ड आरएचए1बी ~ 100 केडीए) के आणविक वजन से शुरू होता है और ऊपर की ओर बढ़ रहा है। एंटी-हा एंटीबॉडी ने एचए-टैग यूबी को विभिन्न लंबाई की पॉली-सर्वव्यापकता श्रृंखला में शामिल किया, जिससे यह विशिष्ट सर्वव्यापी-संबंधित सीढ़ी जैसी धब्बा बन गई। सकारात्मक परिणामों को मान्य करने के लिए, चित्रा 2ए व्यक्तिगत घटकों (E1, E2, Ub, या MBP-RHA1B) लापता सभी महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण ों को भी प्रस्तुत करता है या नियंत्रण के रूप में एमबीपी का उपयोग कर रहा है और गंदा सर्वव्यापकता संकेत की कमी है। इसके अलावा, पीवीडीएफ झिल्ली के कूमासी नीले धुंधला सभी नियंत्रणों में बीपी-RHA1B या एमबीपी के बराबर लोडिंग दिखाया ।

चित्रा 2बी से पता चलता है कि कैसे इन विट्रो सर्वव्यापकता परिणाम विशिष्ट E2/E3 संयोजन के आधार पर विविध । इस उदाहरण में, 10 विभिन्न E2 परिवारों का प्रतिनिधित्व करने वाले 11 विभिन्न E2s का परीक्षण किया गया था। पता चला सर्वव्यापकता गतिविधि कोई संकेत (कोई धब्बा) से लेकर एक बहुबैंडिंग धब्बा के लिए विभिन्न आणविक वजन पर शुरू, विभिन्न सर्वव्यापकता पैटर्न का संकेत है ।

चित्रा 3 अंगूठी के लिए सर्वव्यापकता परख परिणामों से पता चलता है-और कश्मीर परीक्षण प्रोटीन के उत्परिवर्ती संस्करणों । RHA1BC135S के लिए एंजाइमैटिक गतिविधि की कमी या तो विट्रो में एक बहुबैंडिंग धब्बा उत्पन्न करने में असमर्थता द्वारा समर्थित है(चित्रा 3ए)या प्लांटा में पॉली-सर्वव्यापकता संकेत को बढ़ावा देने(चित्रा 3बी)। यह उल्लेखनीय है कि अपने दम पर प्लांटा में एचए-टैग यूबी की अतिअभिव्यक्ति ने जंगली प्रकार RHA1B की एंजाइमैटिक गतिविधि द्वारा प्रदत्त मजबूत सर्वव्यापी संकेत के विपरीत, वेक्टर नियंत्रण सहित सभी परीक्षण किए गए नमूनों में बेसल स्तर का सर्वव्यापीकरण दिया। इसके अलावा, RHA1BK146R उत्परिवर्ती पर विश्लेषण से पता चलता है कि RHA1B की E3 गतिविधि के लिए K146 अवशेष भी आवश्यक है। यद्यपि विट्रो(चित्रा 3ए)में एक सीमांत आत्म-सर्वव्यापी संकेत का पता चला था, लेकिन प्लांटा परख में निर्धारित उत्परिवर्ती E3-कमी है(चित्रा 3बी,केवल पृष्ठभूमि सर्वव्यापकता संकेत का पता चला)।

E3-कमी उत्परिवर्ती उत्पन्न करने और जैव रासायनिक रूप से मान्य करने के बाद, कार्यात्मक अध्ययनों को परीक्षण रिंग E3 सर्वव्यापक लिगास की E3-संबद्ध जैविक भूमिका निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है। RHA1B के मामले में, यह सूत्रकृमि प्रभावक पौधे प्रतिरक्षा सिग्नलिंग को दबा देता है, जैसा कि GPa2-ट्रिगर एचआर सेल मौत के दमन से प्रकट होता है। जैसा कि जंगली प्रकार RHA1B के विपरीत चित्रा 4एमें प्रस्तुत किया गया है, RHA1BC135S उत्परिवर्ती E3 लिगाज़ गतिविधि की कमी एचआर सेल मौत में हस्तक्षेप नहीं करती थी। यह देखते हुए कि प्रोटीन सर्वव्यापकता का सबसे आम परिणाम इसकी प्रोटेसोम-मध्यस्थता क्षरण है, रिंग डोमेन में रहने वाले म्यूटेशन का उपयोग उनके प्रत्यक्ष और/या अप्रत्यक्ष सब्सट्रेट्स के क्षरण को ट्रिगर करने के लिए E3-निर्भर क्षमता को सत्यापित करने के लिए भी किया जा सकता है । इस प्रकार, महत्वपूर्ण रूप से, चित्रा 4बी में पश्चिमी दाग परिणाम इस बात की पुष्टि करते हैं कि GPa2 जंगली प्रकार RHA1B की उपस्थिति में जमा नहीं हुआ लेकिन RHA1BC135S का GPa2 प्रोटीन स्थिरता पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा।

Figure 1
चित्रा 1: सिद्धांत और साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस में शामिल कदमों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (A)संरक्षित Cys और उसके अमीनो एसिड के साथ रिंग-CH/H2 डोमेन पर प्रकाश डाला । (ख)म्यूटाजेनिक प्राइमर डिजाइन का एक उदाहरण। (ग)साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस के कदम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: विनी इन विट्रो सर्वव्यापकता परख में प्रतिनिधि । (A)शीर्ष जेल सभी नकारात्मक नियंत्रणसहित सर्वव्यापी परख दिखाता है, और नीचे जेल समान लोडिंग दिखाता है। (ख)ई 2 एंजाइमों के आधार पर अपेक्षित परिणामों की सीमा। इस आंकड़े को कुड एट एएल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: रिंग और कश्मीर-म्यूटेंट (RHA1BC135S और RHA1BK146R)के लिए सर्वव्यापी परख परिणाम। (A) इन विट्रो सर्वव्यापकता के परिणाम RHA1BC135S और RHA1BK146Rके लिए परिणाम । (ख)प्लांटा सर्वव्यापकता परख में RHA1BC135S और RHA1BK146Rके लिए परिणाम । इस आंकड़े को कुड एट एएल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: E3 निर्भर जैविक कार्यों के लिए प्रतिनिधि कार्यात्मक अध्ययन। E3-निर्भर जैविक कार्य को दिखाने वाले कार्यात्मक अध्ययनों का एक उदाहरण। (A)E3-निर्भर एचआर सेल डेथ दमन और(ख)एक संयंत्र इम्यूनोरिसेप्टर GPa2 का क्षरण । इस आंकड़े को कुड एट एएल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

पीसीआर की स्थापना
1 μL प्लाज्मिड (~ 100 एनजी)
1.5 माइक्रोन एफ म्यूटाजेनिक प्राइमर (10 माइक्रोन)
1.5 माइक्रोन आर म्यूटाजेनिक प्राइमर (10 माइक्रोन)
1 μL डीएनटीपी (10 एमएम)
5 माइक्रोन बफर (10x)
1 μL अल्ट्रा Pfu बहुलक (२.५ U/μl)
39 माइक्रोन डीडीएच2ओ
50 माइक्रोन कुल मात्रा

तालिका 1: पीसीआर प्रतिक्रिया स्थापित

थर्मोसाइकिलर कार्यक्रम
1 95 डिग्री सेल्सियस 30 एस
2 95 डिग्री सेल्सियस 30 एस
3 60 डिग्री सेल्सियस 30 एस
4 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिन दोहराएं 2-4 30 बार
5 72 डिग्री सेल्सियस 5 मिन

तालिका 2: पीसीआर थर्मोसाइकिलर कार्यक्रम

RHA1B उदाहरण के लिए स्थापित लिगेशन रिएक्शन
1.5 माइक्रोन PMAL-c2:: एमएमबी ने बाम्बी और साली (60 एनजी) के साथ पाचन द्वारा वैक्टर को लाइनर किया
7 माइक्रोन RHA1B/RHA1BC135S या RHA1BK146R BamHI और Sali (25 एनजी) के साथ पचा डालने
1 μL T4 लिगाज़ बफर (10x)
0.5 माइक्रोन T4 लिगास (400 U/μL)
10 माइक्रोन कुल मात्रा

तालिका 3: RHA1B उदाहरण के लिए स्थापित लिगेशन रिएक्शन।

Discussion

रिंग प्रकार E3 सर्वव्यापी लिगैसों के जैव रासायनिक और मशीनी आधार को स्पष्ट करना विकास, तनाव संकेत, और होमोस्टोसिस के रखरखाव में उनके जैविक महत्व के बारे में हमारी समझ में बहुत योगदान दे सकता है। प्रोटोकॉल यहां वर्णित जोड़ों में विट्रो के साथ और planta कार्यात्मक अध्ययन में एक उत्पत्ति दृष्टिकोण । साइट-प्रत्यक्ष म्यूटाजेनेसिस के माध्यम से रिंग डोमेन के संरक्षित अवशेषों में एक अमीनो एसिड प्रतिस्थापन शुरू करके, जिसके परिणामस्वरूप E3-कमी उत्परिवर्ती का परीक्षण कार्यक्षमता के साथ एंजाइमैटिक गतिविधि को जोड़ने के लिए जंगली प्रकार प्रोटीन के समानांतर किया जा सकता है।

रिंग डोमेन, विशेष रूप से इसके संरक्षित Cys और उसके अवशेषों की ठीक से पहचान करना महत्वपूर्ण है। प्रोसाइट जैसे ऑनलाइन टूल का उपयोग10ऐसा करने के लिए किया जा सकता है। E2 एंजाइम की भर्ती के लिए जिम्मेदार रिंग डोमेन को अस्थिर करने के लिए, Cys आम तौर पर सेर के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है, जो इसके निकटतम संरचनात्मक प्रतिस्थापन में जिंक समन्वय के लिए उपयोग किए जाने वाले डिसुल्फिड बांड बनाने की क्षमता की कमी है। लॉरिक एट अल से पता चला है कि उन महत्वपूर्ण Cys अवशेषों में से किसी में उत्परिवर्तन एकल उपइकाई अंगूठी प्रकार E3liगैसों 5की सर्वव्यापकता गतिविधि को समाप्त करेगा । हालांकि कुछ Cys अवशेष ों को रिंग-प्रकार प्रोटीन युक्त बहुइकाई E3 लिगास परिसरों के लिए भी महत्वपूर्ण है, उन सर्वव्यापकता परिसरों की बहुआयामी और गतिशील त्रि-आयामी संरचना और रिंग-प्रकार प्रोटीन की विभिन्न भूमिका के कारण, बहुइकाई E3 लिगास में रिंग डोमेन में संरक्षित अवशेषों के एकल प्रतिस्थापन11

साइट निर्देशित म्यूटाजेनेसिस के लिए, हमने पाया कि छोटे प्लाज्मिड वेक्टर और कम प्रवर्धन चक्रों का उपयोग करने से आमतौर पर म्यूटाजेनेसिस के लिए उच्च दक्षता प्राप्त होती है। Pfu एंजाइम किसी भी अन्य उच्च निष्ठा और उच्च प्रक्रिया डीएनए बहुलक के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। इसके अलावा, यदि ब्याज के जीन दुर्लभ कोडन शामिल हैं, एक और ई. कोलाई दाग, रोसेटा, recombinant प्रोटीन की उच्च उपज प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, आईपीटीजी इंडक्शन के लिए ऊष्मायन समय और तापमान दोनों को और अनुकूलित किया जा सकता है। कम तापमान ई. कोलाई डिवीजन दर को कम करते हैं, जो कुछ प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूल हो सकता है । हालांकि आईपीटीजी की उच्च एकाग्रता प्रोटीन अभिव्यक्ति में सुधार कर सकती है, यह ई कोलाई डिवीजन प्रक्रियाओं को भी रोकती है और इसकी सिफारिश नहीं की जाती है।

एकल उपइकाई रिंग प्रकार E3 लिगैसन न केवल एक आणविक पाड़ के रूप में कार्य करती है जो सब्सट्रेट के करीब निकटता में ई 2-यूबी मध्यवर्ती की स्थिति है बल्कि उनके कॉग्नेट E2s की सर्वव्यापी हस्तांतरण गतिविधि को भी प्रोत्साहित करती है। इसके अलावा, यह देखते हुए कि एक E2/E3 संयोजन पॉलीयूबिक्विटिन श्रृंखला की लंबाई और संबंधों के लिए महत्वपूर्ण है जो एक संशोधित सब्सट्रेट के भाग्य को निर्धारित करता है, रिंग-प्रकार ई3एस के किसी भी विचार में उनके एंजाइमैटिक पार्टनर, E2s12शामिल होने चाहिए । जैसा कि चित्रा 3बीमें दिखाया गया है, सभी परीक्षण किए गए ई2एस RHA1B लिगाज़ के साथ संगत नहीं हैं। इसलिए, झूठे नकारात्मक परिणामों से बचने के लिए विभिन्न E2 वर्गों का प्रतिनिधित्व करने वाले कई E2 एंजाइमों के साथ समानांतर में इन विट्रो सर्वव्यापी परख किया जाना चाहिए।

यहां प्रस्तुत इन विट्रो एंजाइमैटिक परख है जो परीक्षण किए गए रिंग-प्रकार प्रोटीन की आत्म-सर्वव्यापीता क्षमता का पता लगाता है। हालांकि, छोटे संशोधनों के साथ, इस प्रोटोकॉल को आसानी से सब्सट्रेट्स के इन विट्रो सर्वव्यापकता का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस उद्देश्य के लिए, चरण 2.15 से इन विट्रो सर्वव्यापकता मिश्रण को संभावित E3 लिगाज़ सब्सट्रेट (500 एनजी) के पुनर्संयोजन प्रोटीन के साथ पूरक किया जाना चाहिए। 30 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे ऊष्मायन के बाद, सर्वव्यापी प्रोटीन विरोधी हा आत्मीयता मैट्रिक्स के 15 μL का उपयोग कर पर कब्जा कर लिया जाना चाहिए (यदि एचए-यूबी का उपयोग किया जाता है, या विरोधी झंडा आत्मीयता मैट्रिक्स अगर ध्वज-Ub प्रयोग किया जाता है) 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए आंदोलन द्वारा । ठंडयू वॉश बफर (20 एमएम ट्रिस पीएच 7.5, 100 एमएम एनएसीएल, 0.1 एम एम ईटीए, 0.05% ट्वीन 20, 1x PMSF) के साथ मोती 4x बार धोने के बाद, बफर के सभी लेकिन 40 माइक्रोन को त्यागें और 2.16 कदम पर जाएं। सर्वव्यापकता संकेत, जो क्रमशः एपिटोप-टैग यूबी और सब्सट्रेट के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा पाया गया, सब्सट्रेट प्रोटीन के आणविक वजन से उभर रहा है, सब्सट्रेट/एंजाइम विशिष्टता की पुष्टि करता है ।

इसके अलावा, वीवो में E3 लिगाज सब्सट्रेट्स की पहचान आमतौर पर क्षणिक एंजाइम-सब्सट्रेट इंटरैक्शन और सर्वव्यापी लक्ष्य प्रोटीन के तेजी से क्षरण के कारण कई चुनौतियों से जुड़ी होती है। एक E3 ligase कमी उत्परिवर्ती का उपयोग करना, जो अभी भी अपने लक्ष्य के साथ बातचीत लेकिन अब यह13सर्वव्यापी, प्रोटेसोमल अवरोधक MG132 के अलावा एक बहुत ही उपयोगी विकल्प है, जो हमेशा पर्याप्त रूप से 26S प्रोटेसोम समारोह के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।

रिंग-टाइप E3 लिगैसों की एक आम विशेषता होमो-और/या विषमता के रूप में बनाने और कार्य करने की प्रवृत्ति है। दिलचस्प बात यह है कि रिंग डोमेन के संरक्षित अवशेषों में प्रतिस्थापन आमतौर पर एक प्रमुख नकारात्मक फेनोटाइप से जुड़ा होता है जहां उत्परिवर्तित रिंग-प्रकार ई3 लिगास देशी जंगली प्रकार प्रोटीन13की एंजाइमैटिक गतिविधि को अवरुद्ध करता है। इस प्रकार, प्लांटा में रिंग म्यूटेंट की अतिअभिव्यक्ति E3 लिगाज जीन को खटखटाने के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हमारा काम कृषि और खाद्य अनुसंधान पहल प्रतिस्पर्धी अनुदान (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर, यूएसडीए-एनआईएफए फार्म बिल, नॉर्थवेस्ट आलू से वित्तीय सहायता से संभव बनाया गया था । कंसोर्टियम, और आईएसडीए विशेषता फसल ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma-Aldrich A6283
Acetosyringone Sigma-Aldrich D134406
Amylose resin NEB E8021S
ATP Sigma-Aldrich A1852
Bacterial protease inhibitor Sigma-Aldrich P8465
Bromphenol Blue VWR 97061-690
CaCl2 Sigma-Aldrich C1016
Centrifuge Beckman Coulter model: Avanti J-25
Commassie Blue VWR 97061-738
Creatine phosphate Sigma-Aldrich P7936
Creatine phosphokinase Sigma-Aldrich C3755
DNA clean & concentrator Kit ZYMO RESEARCH D4029
DpnI NEB R0176S
DTT Sigma-Aldrich D0632
E. coli BL21 Thermo Fisher Scientific C600003
E. coli DH5α competent cells Thermo Fisher Scientific 18265017
EDTA Sigma-Aldrich 324504
FeSO4 7H2O Sigma-Aldrich F7002
FLAG-Ub BostonBiochem U-120
Glucose VWR 188
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
HA-Ub BostonBiochem U-110
Heat block VWR model: 10153-318
Incubator VWR model: 1525 Digital Incubator
Incubator shaker Thermo Fisher Scientific model: MaxQ 4000
IPTG Roche 10724815001
KCl Sigma-Aldrich P9333
LB Broth Sigma-Aldrich L3022
Liquide nitrogen university chemistore
Maltose Sigma-Aldrich 63418
MES Sigma-Aldrich M3671
Methanol Sigma-Aldrich 34860
MgCl2 Sigma-Aldrich 63138
MgSO4 7H2O Sigma-Aldrich 63138
Microcentrifuge Eppendorf model: 5424
Miniprep plasmid purification kit ZYMO RESEARCH D4015
monoclonal anti-FLAG antibody Sigma-Aldrich F3165
monoclonal anti-HA antibody Sigma-Aldrich H9658
monoclonal anti-MYC antibody Sigma-Aldrich WH0004609M2
Mortar VWR 89038-144
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S8282
NanoDrop Thermo Fisher Scientific model: 2000 Spectrophotometer
Needle Thermo Fisher Scientific 14-826-5C
NH4Cl Sigma-Aldrich A9434
PCR machine Bio-Rad model: C1000
Pestle VWR 89038-160
Pfu Ultra Agilent Technologies 600380
Plant protease inhibitor coctail Sigma-Aldrich P9599
pMAL-c2 NEB N8076S
PMSF Sigma-Aldrich P7626
Polyvinylpolypyrrolidone Sigma-Aldrich P6755
SDS Sigma-Aldrich 1614363
Sonicator Qsonica Sonicators model: Q125
Syringe Thermo Fisher Scientific 22-253-260
Tris Sigma-Aldrich T1503
T4 ligase NEB M0202S

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References

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बायोकेमिस्ट्री इश्यू 154 सर्वव्यापकता रिंग-टाइप E3 सर्वव्यापकता लिगासे RHA1B इफेक्टर ग्लोबोडेरा पल्लीडा, निकियाना बेन्थमियाना, एग्रोबैक्टीरियम-मध्यस्थताप्रोटीन क्षणिक अभिव्यक्ति साइट निर्देशित उत्परिवर्तन
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Kud, J., Wang, W., Yuan, Y., Caplan, A., Kuhl, J. C., Dandurand, L. M., Xiao, F. Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta. J. Vis. Exp. (154), e60533, doi:10.3791/60533 (2019).

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