Summary
Formålet med dette manuskript er at fremlægge en skitse til de omfattende biokemiske og funktionelle undersøgelser af RING typen E3 ubiquitin-ligaser. Denne flertrinsrørledning, med detaljerede protokoller, validerer en enzymatisk aktivitet af det testede protein og demonstrerer, hvordan aktiviteten knyttes til funktion.
Abstract
Allestedsnærværende, som en post translationel modifikation af proteiner, spiller en vigtig regulerende rolle i homøostase af eukaryote celler. Den kovalente fastgørelse af 76 aminosyre ubiquitin-modifikatorer til et målprotein, afhængigt af længden og topologien af polyubiquitin-kæden, kan resultere i forskellige resultater, der spænder fra protein nedbrydning til ændringer i lokalisering og/eller aktivitet af modificeret protein. Tre enzymer sekventielt katalyserer den allestedsnærværende proces: E1 ubiquitin-aktiverende enzym, E2 ubiquitin-konjugering enzym, og E3 ubiquitin Ligase. E3 ubiquitin ubiquitinligase afgør substratspecificitet og repræsenterer derfor et meget interessant Studieemne. Her præsenterer vi en omfattende tilgang til at studere forholdet mellem den enzymatiske aktivitet og funktion af RING-typen E3 ubiquitin Ligase. Denne fire-trins protokol beskriver 1) hvordan man genererer en E3 ubiquitinligase mangelfuld mutant gennem site-instrueret mutagenese rettet mod det bevaret RING domæne; 2 – 3) hvordan man undersøger den allestedsnærværende aktivitet både in vitro og i planta; 4) hvordan man knytter disse biokemiske analyser til den biologiske betydning af det testede protein. Generering af en E3 Ligase-mangelfuld mutant, der stadig interagerer med dets substrat, men ikke længere allestedsnærværende det til nedbrydning letter testning af enzym-substrat interaktioner in vivo. Desuden giver mutationen i det bevaret RING domæne ofte en dominerende negativ fænotype, der kan udnyttes i funktionelle knockout-studier som en alternativ tilgang til en RNA-interferens tilgang. Vores metoder blev optimeret til at undersøge den biologiske rolle af planten parasitisk fyrretræsnematoden Effector RHA1B, som kaprer værten allestedsnærværende system i planteceller for at fremme parasitismen. Med en mindre ændring af in vivo-udtryks systemet kan denne protokol anvendes til analyse af alle RING type E3-ubiquitinligase, uanset dens oprindelse.
Introduction
Langt størstedelen af E3 ubiquitin-ligaser tilhører ring (Rer interesting NEW Gene)-type proteiner. RING finger-domænet blev oprindeligt identificeret af Freemont et al. 1 og funktionelt beskrevet som et domæne, der medierer protein-protein interaktion2. Den kanoniske RING finger er en særlig type af zink koordinerende domæne defineret som en konsensus sekvens af otte bevaret cys (C) og hans (H) specifikt fordelt på andre aminosyre rester (X), C-X2-c-x9 – 39-c-x1 – 3-H-x2 – 3-c/H-x2-c-x4 – 48-c-x2-c. To Zn2 + ioner stabiliseres af Core c-og H-rester gennem en unik topologi med c1/c2 og c/H5/c6 , der koordinerer den første Zn2 + ion, hvorimod C3/h4 og c7/c8 binder den anden (figur 1A)3,4. Afhængigt af tilstedeværelsen af enten C eller H i femte Zn2 +-koordinations sted, blev to kanoniske underklasser af ring finger proteiner defineret: C3HC4 og C3H2C3 (henholdsvis ring-HC og ring-H2). Da RING domænet for E3 ubiquitin ubiquitinligase formidler interaktionen mellem E2 konjugerende enzymer og substrater, har mutation af disse essentielle C-og H-rester vist sig at forstyrre ligaseaktiviteten5. Der er beskrevet yderligere fem mindre almindeligt forekommende underklasser af RING E3-ligaser (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T og RING-G)6. RING typen E3 ubiquitin-ligaser kan yderligere opdeles i simple og komplekse E3-enzymer. Den simple enkelt underenhed RING E3 ligaser indeholder både substratet anerkendelse site og E2-binding RING domæne. Derimod er den multi underenhed RING-type E3 kompleks enten rekrutteres substrat eller medierer binding af E2-ubiquitin mellemliggende til E3-komplekset. RING domænet lys rest (r), der fungerer som et primært ubiquitin-fastgørelsessted (er) til selv-allestedsnærværende, kan også være vigtigt for E3-ligaseaktiviteten.
Ikke alle RING-holdige proteiner fungerer som E3-ligaser. Den bioinformatiske forudsigelse af RING finger-domænet og kapaciteten for E2-afhængig protein allestedsnærværende skal således være biokemisk valideret og knyttet til det testede protein's biologiske rolle. Her beskriver vi en trin-for-trin-protokol, der skitserer, hvordan man detekterer og funktionelt karakteriserer den enzymatiske aktivitet af ring-type E3 ubiquitinligaser, både in vitro og i planta, gennem en site-instrueret mutagenese tilgang. De repræsentative resultater fra denne pipeline vises for RING type E3 ubiquitinligase RHA1B. RHA1B er en Effector protein produceret af planten parasitisk cyste fyrretræsnematoden Globodera pallida at undertrykke plante immunitet og manipulere morfologien af planten rodceller. For at beskytte sig mod patogen/parasitat invasion, planter har udviklet nucleotid-binding domæne og leucin-rige gentage (NB-LRR) immun receptorer, der detekterer tilstedeværelsen af et patogen eller parasit og, som følge heraf, udvikle overfølsom respons (HR), som er en form for hurtig og lokaliseret celledød forekommer på infektionsstedet at arrestere kolonisering af patogener. En sådan immun receptor er kartoffel Gpa2 protein, der giver resistens over for nogle isolater af G. pallida (felt populationer D383 og D372)7.
Ved hjælp af de præsenterede protokoller, er det for nylig blevet konstateret, at RHA1B interfererer med plante immun signalering i en E3-afhængige måde ved at målrette planten Gpa2 immunoreceptor for allestedsnærværende og nedbrydning8.
Protocol
1. site-instrueret mutagenese (figur 1)
- Identificér de bevaret cys og hans aminosyrer i RING domænet (figur 1A) og design primere, der bærer substitutions codon af interesse flankeret af 15 basepar på hver side af Mutations stedet (figur 1B).
- Den ønskede mutation indføres ved PCR-baseret forstærkning af plasmid-husly af det relevante gen med mutagene primere og high-fidelity-DNA-Polymerase indeholdende PFU i 50 μl af total PCR-reaktions volumen som vist i tabel 1 og tabel 2 i henhold til fabrikantens protokol.
- Det Escherichia coli-afledte moder methylerede og semi-METHYLEREDE DNA fordøje ved at tilsætte 3 ΜL DPNI -begrænsnings enzym direkte til PCR-reaktionen (trin 1,2) og inkuberet ved 37 °c i 2 timer.
Bemærk: methylering er en posttranskriptional protein modifikation, der tilsættes til plasmid produceret og isoleret fra bakterier. Nye kopier af PCR-genereret plasmid mangler methylering, derfor vil de nye kopier forblive intakt under DPNI -behandling. - Rense de mutagenicerede plasmider ved hjælp af et kommercielt DNA-ekstraktions udstyr baseret på spin-kolonne teknologi og elueres DNA med 50 μl vand.
- Transformér DH5α E. coli kemisk kompetente celler med 0,5 μl af det genvundne mutagenicerede PLASMID-DNA i henhold til fabrikantens protokol. Kort sagt, Inkubér kompetente celler med DNA på is i 30 minutter, Opvarm dem derefter til 20 s ved 42 °C, og Placer rørene igen på is i 2 min. Inkubér celler med 500 μL LB-medier ved 37 °C i 1 time ved 250 rpm, og spred dem derefter på selektive Pates.
- Bekræft den ønskede mutation af sanger sekvensering af DNA-plasmiderne isoleret fra E. coli.
2. rekombinant protein rensning og in vitro-allestedsnærværende analyse
- Klon den vilde type RING og muterede RING gener af interesse i pMAL-C2 vektor (Følg producentens protokol; Tabel 3) til at smelte disse gener med MBP epitop tag, der tillader et-trins rensning ved hjælp af amyloseholdig harpiks. Introducere de resulterende konstruktioner i E. coli BL21 stammen som beskrevet i trin 1,5.
- Vokse E. coli stamme BL21 husly den ønskede konstruktion i 50 ml lb flydende medium ved 37 °c for 2 – 3 h, indtil den når den logaritmiske fase (OD600 af 0,4 – 0,6).
- IPTG tilsættes til en slutkoncentration på 0,1 – 1 mM for at inducere ekspression af MBP-mærket, der er af interesse, og inkubere E. coli -kulturen i 2 – 3 timer ved 28 °c. Placer kulturen på is efter inkubation.
Bemærk: Udfør trin 2.4 – 2.13 på is for at beskytte proteiner mod nedbrydning. - For at kontrollere induktions effektiviteten, Indsaml 1,5 ml inducerede celler, drej dem ned ved 13.000 x g i 2 minutter, Fjern supernatanten, og resuspender cellerne i 20 μl 2x SDS-side loading buffer (24 mm Tris-HCL pH 6,8, 0,8% SDS, 10% (v/v) glycerol, 4 mm DTT, 0,04% (w/v) bromphenolblåt blå).
- Kog prøverne i 5 min og køre dem på en 10% SDS-side gel. Til visuelt at evaluere ophobning af MBP-fusionsprotein (molekylvægt af protein af interesse + 42,5 kDa MBP), plette gelen i 20 min ved at agitere med Coomassie farvnings buffer (50% methanol, 10% eddikesyre, 0,1% Coomassie Blue) og affarvning natten over med affarvnings bufferen (20% methanol, 10% eddikesyre).
- Høst de resterende E. coli -celler ved centrifugering ved 1.350 x g i 6 min., kassér supernatanten, og resuspender celle pellet med 5 ml kolonne buffer (20 mm Tris HCl, 200 mm NACL, 1 mm EDTA, bakteriel proteasehæmmer).
Bemærk: Dette er et godt sted at stoppe protokollen natten over. De frosne celler kan opbevares i op til 1 uge ved-20 °C. - Nedbryde E. coli celler ved at placere røret indeholdende bakterierne i et isvands bad og anvende 10 sonikering cyklusser: 10 s sonikering ved 30% amp efterfulgt af 20 s pauser.
- Centrifugerings prøven ved 13.000 x g ved 4 °c i 10 min. og Gem supernatanten (rå ekstrakt).
- Forbered 500 μL amyloseholdig harpiks i et 15 mL rør. Harpiks vaskes ved tilsætning af 10 mL kold kolonne buffer og centrifugering ved 1.800 x g, 4 °c i 5 min. Gør dette 2x.
- Tilsæt 5 mL råekstrakt til røret med amyloseholdig-harpiks, og Inkuber natten over ved 4 °C.
- Centrifugeres ved 1.800 x g ved 4 °c i 5 min., og supernatanten kasseres.
- 10 mL kolonne buffer tilsættes til harpiks pellet og Inkuber i 20 min. Derefter centrifugeres ved 1.800 x g ved 4 °c i 5 min. Gentag dette trin 2x.
- Fusions proteinet eluerer med 0,5 mL kolonne buffer indeholdende 10 mM maltose ved at inkube en prøve i 2 timer ved 4 °C. Centrifugeres ved 1.800 x g ved 4 °c i 5 minutter og opsamles med det eluede protein. Gentag dette trin 2x.
- Dialyze 1 mL af proteinfraktionen mod den kolde PBS. Aliquot protein i engangs rør (10-20 μL) for at undgå fryse optøning og opbevaring ved-80 °C, indtil det er nødvendigt.
- Mål proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford assay9.
- Der er oprettet in vitro-allestedsnærværende reaktioner i et samlet volumen på 30 μL ved at blande op 40 ng af E1 (f. eks. AtUBA1), 100 ng af E2 (f. eks. AtUBC8, SlUBC1/4/6/7/12/13/17/20/22/27/32), 1 μg MBP-RING type protein og 2 μg FLAG-UB (eller HA-UB) i den allestedsnærværende buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl2, 30 mm kreatinphosphat, 50 μg/ml kreatinfosfokinase). Blandingen inkubates ved 30 °C i 2 timer.
Bemærk: Premake 20x ubiquitination buffer og opbevar den op til 6 måneder ved-20 °C i små aliquoter til en enkelt anvendelse. Kreatinfosfokinase mister let sin enzymatiske aktivitet, når bufferen er optøet og frosset gentagne gange. - Reaktionen afsluttes ved at blande de 30 μl prøver med 7,5 μl 5x SDS-side indlæsnings buffer (60 mm Tris-HCL pH 6,8, 2% SDS, 25% (v/v) glycerol, 10 mm DTT, 0,1% (w/v) bromphenolblåt blå) og kogning i 5 min.
- Adskil proteinerne med 7,5% SDS-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side), og overfør derefter til PDVF-membranen, og detektér allestedsnærværende ved Western blotting ved hjælp af anti-flaget (eller anti-HA).
- Plette PVDF-membranen med Coomassie Blue for at verificere lige belastning af testet protein af MBP-RING type.
3. Agrobacterium-medieret forbigående protein ekspression i Nicotiana benthamiana blade og i planta allestedsnærværende analyse
- Streak passende Agrobacterium tumefaciens stammer, der bærer det epitope-mærkede gen af interesse (f. eks. ha-RHA1B, ha-RHA1BC135S, ha-RHA1BK146R, ha-UB) og Tom vektor som en kontrol på lb-mediet, der indeholder de relevante selektions antibiotika.
- Efter 2 dages vækst ved 28 °C, afhente enkelt kolonier og vokse dem i LB flydende medium med passende antibiotika ved 28 °C/250 rpm for en anden 24 h.
- Overfør 100 μL Agro bakteriel kultur til 3 mL frisk LB med de relevante antibiotika, og Inkuber kulturen i yderligere 4 – 6 timer ved 28 °C med rotation (250 rpm) til den sene eksponentielle vækstfase.
- Spin ned agrobakterielle celler ved 1.800 x g i 6 min, kassér supernatanten, og resuspendere celler med 3 ml vaskebuffer (50 mm MES pH 5,6, 28 mm glucose, 2 mm Nah2po4). Gentag dette trin 2x.
- Efter den anden vask, resuspension cellerne i induktions bufferen (50 mM MES pH 5,6, 28 mM glucose, 2 mM NaH2po4, 200 μM acetosyringone, 37 mm NH4CL, 5 mm mgso4. 7H2o, 4 mm KCl, 18 μM FeSO4. 7h2O, 2 mm CaCl2). Cellerne inkubates med induktions buffer i yderligere 10 – 12 timer ved 28 °C.
Bemærk: Acetosyringone inducerer T-DNA-overførsel. - Cellerne centrifugeres ved 1.800 x g i 6 minutter, og supernatanten kasseres, og cellerne resuspenderes med 2 ml infiltrations buffer (10 mm MES pH 5,5, 200 μM acetosyringone).
Bemærk: Hvis Agrobakterier aggregeres efter inkubation med induktions buffer, lad de aggregerede celler synke til bunden af røret ved at lade det på bænken i et par minutter, og overføre den klare Agrobacterium suspension til et nyt rør, før du fortsætter med trin 3,6. - Koncentrationen af bakterier måles ved hjælp af OD600 -værdien (den optiske densitet ved absorbans på 600 nm). Juster OD600 -værdierne til de ønskede værdier.
Bemærk: normalt en OD600 værdi mellem 0.2 – 0,4 fungerer bedst for en enkelt agrobakteriel plet udtryk. Hvis der anvendes en kombination af forskellige Agro bakterielle stammer, bør de samlede OD600 -værdier af agro bakterielle stammer ikke overstige 1. - Agroinfiltrate 4-ugers gamle N. bethamiana blade ved forsigtigt at stikke dem med en nål, efterfulgt af hånd-indsprøjtning Agrobacterium med en sprøjte uden nålen. Cirkel det infiltrerede blad område med markøren (normalt 1 – 2 cm i diameter).
- Saml det infiltrerede blad væv 36 h efter infiltration. Slibe vævet til et fint pulver med flydende nitrogen.
- Resuspenderet vævs pulver med 300 μL protein ekstraktions buffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 10% glycerol, 1% polyvinylpolypyrrolidon, 1 mM PMSF, plante proteasehæmmer cocktail) og centrifuge ved 15.000 x g i 15 min ved 4 °c.
- Overfør supernatanten til et nyt rør. Tilføj 5x SDS-side loading buffer til en endelig koncentration af 1x og kog i 5 min.
- Separate rå proteiner på 10% SDS-side gels, overførsel på PVDF membraner, og sonde med anti-HA til påvisning i planta allestedsnærværende.
4. etablering af forbindelsen mellem enzymatisk aktivitet og funktion i planta
Bemærk: for eksempel fremmer RHA1B nedbrydning af resistente protein Gpa2 for at undertrykke HR-celledød. Dette trin viser, hvordan man kontrollerer, at disse virulente aktiviteter i RHA1B er E3-afhængige.
- Streak passende Agrobacterium tumefaciens stammer transporterer mærkede gener af interesse (i dette eksempel ha-RHA1B, ha-RHA1BC135S, ha-RHA1BK146R, MYC-Gpa2, RBP1) og Tom vektor som en kontrol. Følg trin 3.1-3.8 for Agrobacterium præparat og injektion på N. bethamiana blade.
- For den E3-afhængige substrat protein nedbrydning, Følg trin 3.9-3.12 og udføre den vestlige blotting ved hjælp af passende antistoffer til påvisning af protein ophobning i planteceller (f. eks, anti-HA og anti-MYC).
- For den E3-afhængige overfølsomhedsreaktion (HR) medieret celledød hæmning, overvåge agroinfiltrerede blade for HR-celledød symptomer 2 – 4 dage efter infiltration.
Representative Results
I dette afsnit gives der repræsentative resultater for den protokol, der anvendes til undersøgelse af en enkelt underenhed E3 ubiquitin ubiquitinligase RHA1B, der har et PROSITE-forventet RING-H2-type domæne (132 – 176 aminosyrer)10. Som vist i figur 1skal mindst én af de otte, der er bevaret i ring domænet (figur 1A) for at opnå et E3-mangelfuld mutant protein, være mutageniceret (figur 1B). Som et første skridt blev der således genereret to mutante versioner af RHA1B, RHA1BC135S (en substitution af cys af ser i den bevaret C3 af ring domænet) og RHA1BK146R (en substitution af lys med ARG i den eneste lys, der findes i RHA1B). Selv om enkelt underenhed E3-ligaser formidler ubiquitin-overførsel fra ubiquitin-husly E2 til substratet i stedet for direkte interaktion med ubiquitin, kan det være nødvendigt med selvstændig allesteds nærning af E3 ved lys for sin maksimale enzymatiske aktivitet.
Den vestlige blotting resultater i figur 2a viser en typisk positiv in vitro allestedsnærværende analyseresultat, med en multibanding smøre startende på molekylvægten af det testede protein (f. eks, MPB-smeltet RHA1B ~ 100 kDa) og skrider opad. Anti-HA antistof anerkendt HA-Tagged UB indarbejdet i Poly-ubiquitination kæde af forskellige længder, hvilket skaber denne typiske ubiquitin-associerede stige-lignende smear. For at validere de positive resultater, figur 2A præsenterer også alle vigtige negative kontroller mangler individuelle komponenter (E1, E2, UB, eller MBP-RHA1B) eller ved hjælp af MBP som kontrol og mangler det smurt allestedsnærværende signal. Desuden viste Coomassie Blue-farvning af PVDF-membranen samme belastning af MBP-RHA1B eller MBP i alle kontroller.
Figur 2B viser, hvordan resultaterne af in vitro-ubiquitination varierede afhængigt af den specifikke E2/E3-kombination. I dette eksempel blev 11 forskellige E2s, der repræsenterede 10 forskellige E2-familier, afprøvet. Den detekterede allestedsnærværende aktivitet varierede fra intet signal (ingen smøre) til en multibanding smøre startende ved forskellige molekylvægte, hvilket indikerer forskellige allestedsnærværende mønstre.
Figur 3 viser resultater af allestedsnærværende assay for ring-og K-mutant versioner af testet protein. Manglende enzymatisk aktivitet for RHA1BC135S understøttes af dens manglende evne til enten at generere en multibanding smøre in vitro (figur 3a) eller fremme poly-ubiquitination signal i planta (figur 3B). Det er bemærkelsesværdigt, at overekspression af HA-Tagged UB i planta på egen hånd gav basal niveau allestedsnærværende i alle testede prøver, herunder vektorkontrol, i modsætning til det stærke allestedsnærværende signal, der er tildelt af den enzymatiske aktivitet af vilde type RHA1B. Desuden tyder analysen på RHA1BK146R mutant på, at K146 rester også er afgørende for E3-aktiviteten i RHA1B. Selv om der blev detekteret et marginalt selv-allestedsnærværende signal in vitro (figur 3a), var det i planta-analysen fastslået, at mutant er E3-mangelfuld (figur 3B, kun baggrunds-allestedsnærværende signal detekteret).
Efter genere RING og biokemisk validering af den E3-mangelfulde mutant, kan funktionelle undersøgelser konstrueres til at bestemme den E3-associerede biologiske rolle af den testede ringen E3 ubiquitin Ligase. I tilfælde af RHA1B, denne fyrretræsnematoden Effector undertrykker plante immun signalering, som manifesteret ved undertrykkelse af Gpa2-udløste HR celledød. Som præsenteret i figur 4A, i MODSÆTNING til Wild type RHA1B, forstyrrede RHA1BC135S mutant, der manglede E3 ligaseaktivitet, ikke hr-celledød. Da det mest almindelige resultat af protein allestedsnærværende er dets proteasom-medierede nedbrydning, kan mutationer, der er bosiddende i RING domænet, også anvendes til at verificere en E3-afhængig evne til at udløse nedbrydning af deres direkte og/eller indirekte substrater. Således betydeligt, vestlige blotting resultater i figur 4B bekræfter, at Gpa2 ikke ophobes i nærværelse af vildtype RHA1B men RHA1BC135S havde ingen indvirkning på Gpa2 protein stabilitet.
Figur 1: skematisk gengivelse af princippet og trin, der er involveret i site-instrueret mutagenese. (A) ring-ch/H2 domæne med bevaret cys og hans aminosyrer fremhævet. B) et eksempel på design af mutagene primere. C) trin på stedet, som er rettet mod mutagenicose. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentativ in vitro-analyse af allestedsnærværende. (A) topgel viser allestedsnærværende assay, herunder alle negative kontroller, og bund gel viser lige belastning. B) intervallet af forventede resultater afhængigt af E2-enzymer. Dette tal er blevet modificeret fra Kud et al8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: resultater af allestedsnærværende analyse for RING-og K-mutanter (RHA1BC135S og RHA1BK146R). A) resultaterne af in vitro-allestedsnærværende RHA1BC135S og RHA1BK146R. (B) i planta allestedsnærværende analyseresultater for RHA1BC135S og RHA1BK146R. Dette tal er blevet modificeret fra Kud et al8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentativ funktionel undersøgelse for E3-afhængige biologiske funktioner. Et eksempel på funktionelle undersøgelser, der viser den E3-afhængige biologiske funktion. A) den E3-afhængige hr-celledød undertrykkelse og (B) nedbrydning af en plante immunoreceptor Gpa2. Dette tal er blevet modificeret fra Kud et al8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| PCR-opsætning | |
| 1 μL | plasmid (~ 100 ng) |
| 1,5 μL | F mutagen primer (10 μM) |
| 1,5 μL | R mutagen primer (10 μM) |
| 1 μL | dNTPs (10 mM) |
| 5 μL | buffer (10x) |
| 1 μL | Ultra PFU-polymerase (2,5 U/μl) |
| 39 μL | ddH2O |
| 50 μL | SAMLET MÆNGDE |
Tabel 1: Opsætning af PCR-reaktion
| termo cycler program | |||
| 1 | 95 °C | 30 s | |
| 2 | 95 °C | 30 s | |
| 3 | 60 °C | 30 s | |
| 4 | 72 °C | 5 min | Gentag 2-4 30 gange |
| 5 | 72 °C | 5 min | |
Tabel 2: PCR termo cycler program
| ligations reaktion, der er oprettet for eksemplet RHA1B | ||
| 1,5 μL | pmal-C2:: MBP lineariseret vektor ved fordøjelse med bamhi og SalI (60 ng) | |
| 7 μL | RHA1B/RHA1BC135S eller RHA1BK146R Indsæt fordøjet med BamHI og SalI (25 ng) | |
| 1 μL | T4-ligasebuffer (10x) | |
| 0,5 μL | T4-ubiquitinligase (400 U/μL) | |
| 10 μL | SAMLET MÆNGDE | |
Tabel 3: Ligations reaktion oprettet for eksemplet RHA1B.
Discussion
At belyse det biokemiske og mekaniske grundlag for RING type E3 ubiquitin-ligaser kan i høj grad bidrage til vores forståelse af deres biologiske betydning i udvikling, stress signalering og vedligeholdelse af homøostase. Den her beskrevne protokol par en mutagenese tilgang med in vitro og i planta funktionelle undersøgelser. Ved at indføre en enkelt aminosyresubstitution i de rester af RING domænet, der bevares, gennem site-Direct mutagenese, kan den resulterende E3-mangelfuld mutant testes parallelt med vildt type protein for at forbinde enzymatisk aktivitet med funktionalitet.
Det er afgørende for korrekt at identificere RING domænet, især dets bevaret cys og hans rester. Online værktøjer såsom PROSITE kan bruges til at gøre det10. For at destabilisere RING domænet, der er ansvarligt for rekruttering af E2-enzymet, erstattes cys normalt med ser, som er dets nærmeste strukturelle udskiftning, som mangler evnen til at skabe en disulfid-obligation, der anvendes til zink koordination. Lorick et al. viste, at mutationen i nogen af disse kritiske cys-rester ville afskaffe den allestedsnærværende aktivitet i de enkelte under enheds RING-type E3-ligaser5. Selv om nogle cys-rester også er vigtige for stat-E3 ligasekomplekser, der indeholder ring type proteiner, skyldes den mangesidede og dynamiske tredimensionale struktur af disse allestedsnærværende komplekser og den forskellige rolle af ring type proteiner, at enkelte udskiftninger af bevaret restkoncentrationer i ring domænet i multi Unit E3 ubiquitinligase ikke har haft succes med at generere en ubiquitinligase mangelfuld fæ
For den site-instrueret mutagenese, vi fandt, at ved hjælp af mindre plasmid vektorer og lavere amplifikation cyklusser normalt gav højere effektivitet for mutagenese. PFU-enzymet kan erstattes med enhver anden high-fidelity og høj processivitet DNA-Polymerase. Desuden, hvis genet af interesse indeholder sjældne codons, en anden E. coli plet, Rosetta, kan bruges til at opnå højere udbytte af det rekombinante protein. Derudover kan både inkubationstiden og temperaturen for IPTG-induktion optimeres yderligere. Lavere temperaturer reducere E. coli division sats, som kan være gunstige for ekspression af visse proteiner. Selv om højere koncentration af IPTG kunne forbedre protein ekspression, det hæmmer også E. coli division processer og anbefales ikke.
Enkelt-under enheds RING type E3-ligaser fungerer ikke kun som et Molekylær stilladset, der placerer E2-UB-mellem produktet i umiddelbar nærhed af substratet, men stimulerer også ubiquitin-overførselsaktiviteten i deres E2s. Da en E2/E3-kombination er vigtig for længden og sammenhængen i polyubiquitin-kæden, der afgør et modificeret substrat skæbne, skal enhver overvejelse af RING type E3s desuden omfatte deres enzymatiske partnere, E2s12. Som vist i figur 3Ber ikke alle TESTEDE E2s kompatible med RHA1B Ligase. Derfor bør in vitro-allestedsnærværende assays transporteres parallelt med flere E2-enzymer, der repræsenterer forskellige E2-klasser for at undgå falsk negative resultater.
Præsenteret her er den in vitro enzymatiske assay, der registrerer selv-allestedsnærværende evne af testede RING-type proteiner. Men med små modifikationer, denne protokol kan let tilpasses til påvisning in vitro allestedsnærværende af substrater. Til dette formål bør den in vitro-allestedsnærværende blanding fra trin 2,15 suppleres med det rekombinante protein af det potentielle E3-ligasesubstrat (500 ng). Efter en inkubation på 2 timer ved 30 °C bør allestedsnærværende proteiner opsamles med 15 μL anti-HA-affinitets matrix (hvis der anvendes HA-UB eller anti-FLAG-affinitets matrix, hvis FLAG-UB anvendes) ved agitation i 2 timer ved 4 °C. Efter vask perlerne 4X gange med den kolde UB vask buffer (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, 1x PMSF), kassere alle, men 40 μL af bufferen og flytte til trin 2,16. Det allestedsnærværende signal, detekteret af antistoffer, der er specifikke for epitope-mærkede UB og substrat, der er fremspirende fra molekylvægten af substrat proteinet, bekræfter substrat/enzym specificiteten.
Desuden er identifikation af E3 ubiquitinligase substrater in vivo normalt forbundet med flere udfordringer på grund af forbigående enzym substrat interaktion og hurtig nedbrydning af allestedsnærværende målprotein. Ved hjælp af en E3 ubiquitinligase mangelfuld mutant, som stadig interagerer med sit mål, men ikke længere allestedsnærværende det13, er et meget nyttigt alternativ til tilsætning af proteasomal inhibitor MG132, som ikke altid tilstrækkeligt interfererer med 26s proteasomet funktion.
Et almindeligt kendetegn ved RING type E3-ligaser er en tendens til at danne og fungere som homo-og/eller Heterodimere. Interessant, substitution i de bevaret rester af RING domænet er normalt forbundet med en dominerende negativ fænotype, hvor muteret RING-type E3 ubiquitinligase blokke enzymatisk aktivitet af en Native Wild type protein13. Således over ekspression af RING mutanter i planta kan være en alternativ tilgang til at banke ud E3 ubiquitinligase genet.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vores arbejde blev muliggjort af den finansielle støtte fra landbrugs-og fødevare forskningsinitiativet konkurrence tilskud (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) af USDA National Institute of Food and Agriculture, USDA-NIFA Farm Bill, nordvestlige kartoffel Og ISDA-Special afgrøden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Amylose resin | NEB | E8021S | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
| Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
| Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
| Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
| Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
| DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
| E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
| FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
| FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
| Glucose | VWR | 188 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
| Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
| Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
| Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
| IPTG | Roche | 10724815001 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Liquide nitrogen | university chemistore | ||
| Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
| Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
| monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
| monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
| Mortar | VWR | 89038-144 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
| Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
| Pestle | VWR | 89038-160 | |
| Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
| Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
| pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
| Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| T4 ligase | NEB | M0202S |
References
- Freemont, P. S., Hanson, I. M., Trowsdale, J. A novel gysteine-rich sequence motif. Cell. 64, 483-484 (1991).
- Borden, K. L. B. RING fingers and B-boxes: Zinc-binding protein-protein interaction domains. Biochemistry and Cell Biology. 76, 351-358 (1998).
- Barlow, P. N., Luisi, B., Milner, A., Elliott, M., Everett, R. Structure of the C3HC4 Domain by 1H-nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy: A New Structural Class of Zinc-finger. Journal of Molecular Biology. 237, 201-211 (1994).
- Borden, K. L. B., et al. The solution structure of the RING finger domain from the acute promyelocytic leukaemia proto-oncoprotein PML. The EMBO Journal. 14, 1532-1541 (1995).
- Lorick, K. L., et al. RING fingers mediate ubiquitin-conjugating enzyme (E2)-dependent ubiquitination. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96, 11364-11369 (1999).
- Jiménez-López, D., Muñóz-Belman, F., González-Prieto, J. M., Aguilar-Hernández, V., Guzmán, P. Repertoire of plant RING E3 ubiquitin ligases revisited: New groups counting gene families and single genes. PLoS ONE. 13, 1-28 (2018).
- Sacco, M. A., et al. The Cyst Nematode SPRYSEC Protein RBP-1 Elicits Gpa2- and RanGAP2-Dependent Plant Cell Death. PLoS Pathogens. 5, 1-14 (2009).
- Kud, J., et al. The potato cyst nematode effector RHA1B is a ubiquitin ligase and uses two distinct mechanisms to suppress plant immune signaling. PLoS Pathogens. 15, 1007720 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Sigrist, C. J. A., et al. New and continuing developments at PROSITE. Nucleic Acids Research. 41, 344-347 (2013).
- Dove, K. K., Stieglitz, B., Duncan, E. D., Rittinger, K., Klevit, R. E. Molecular insights into RBR E3 ligase ubiquitin transfer mechanisms. EMBO Reports. 17, 1221-1235 (2016).
- Metzger, M. B., Pruneda, J. N., Klevit, R. E., Weissman, A. M. RING-type E3 ligases: Master manipulators of E2 ubiquitin-conjugating enzymes and ubiquitination. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1843, 47-60 (2014).
- Xie, Q., et al. SINAT5 promotes ubiquitin-related degradation of NAC1 to attenuate auxin signals. Nature. 419, 167-170 (2002).
