Målet med dette manuskriptet er å presentere en skisse for omfattende biokjemiske og funksjonelle studier av RING-type E3 ubiquitin ligases. Dette flertrinns rørledning, med detaljerte protokoller, validerer en enzymatisk aktivitet av testet protein og demonstrerer hvordan å koble aktiviteten til funksjon.
Ubiqitinering, som en posttranslational modifikasjon av proteiner, spiller en viktig regulerende rolle i homeostase av eukaryote celler. Den kovalente vedlegg av 76 aminosyre ubiquitin bestemmelsesord til et mål protein, avhengig av lengden og topologi av polyubiquitin kjeden, kan resultere i ulike utfall fra protein degradering til endringer i lokalisering og/eller aktivitet av modifisert protein. Tre enzymer sekvensielt katalysere den ubiqitinering prosessen: E1 ubiquitin-aktivering enzym, E2 ubiquitin-bøye enzym, og E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase bestemmer substrat spesifisitet og representerer derfor en meget interessant studie emne. Her presenterer vi en helhetlig tilnærming for å studere forholdet mellom enzymatisk aktivitet og funksjon av RING-type E3 ubiquitin ligase. Denne fire-trinns protokollen beskriver 1) hvordan å generere en E3 ligase mangelfull mutant gjennom site-regissert mutagenese rettet mot bevarte RING domene; 2 – 3) hvordan undersøke ubiqitinering aktivitet både in vitro og i planta; 4) hvordan du kobler de biokjemiske analyse til biologisk betydning av testet protein. Generering av en E3 ligase-mangelfull mutant som fortsatt samhandler med sitt substrat, men ikke lenger ubiquitinates det for fornedrelse forenkler testing av enzymet-substrat interaksjoner in vivo. Videre gir mutasjonen i det bevarte RING-domenet ofte en dominerende negativ fenotype som kan benyttes i funksjonelle knockout-studier som en alternativ tilnærming til en RNA-interferens-tilnærming. Våre metoder ble optimalisert for å undersøke den biologiske rollen til planten parasitt nematode effektor RHA1B, som hijacks verts ubiqitinering systemet i planteceller for å fremme Parasitism. Med liten modifisering av in vivo uttrykks system, kan denne protokollen brukes til analyse av enhver RING-type E3 ligase uavhengig av dens opprinnelse.
De aller fleste E3 ubiquitin ligases tilhører RING (Really jegnteresting NEW Gene)-type proteiner. RING-finger-domenet ble opprinnelig identifisert av Freemont et al. 1 og funksjonelt beskrevet som et domene formidling protein-protein interaksjon2. Den kanoniske RING finger er en spesiell type sink koordinerende domene definert som en konsensus sekvens av åtte bevarte cys (C) og hans (H) spesielt linjeavstand av andre aminosyrer rester (X), C-X2-c-x 9 – 39-c-X1 – 3-H-x2 – 3-c/H-x2-c-x4 – 48-c-x2-c. To Zn2 + -ioner stabiliseres av kjerne C og H-rester gjennom unik topologi for kryss seler med C1/c2 og C/H5/c6 som koordinerer den første Zn2 + ion, mensc 3/H4 og C7/c8 binder den andre (figur 1A)3,4. Avhengig av tilstedeværelsen av enten C eller H i den femte Zn2 +-koordinering området, to kanoniske underklasser av ring-finger proteiner ble definert: C3HC4 og C3H2C3 (ring-HC og ring-H2, henholdsvis). Fordi RING domenet til E3 ubiquitin ligase formidler samspillet mellom E2 bøye enzymer og underlag, har mutasjon av disse essensielle C-og H-rester blitt vist å forstyrre ligase aktivitet5. Ytterligere fem mindre vanlige underklasser av RING E3 ligases har blitt beskrevet (RING-v, RING-C2, RING-D, RING-S/T, og RING-G)6. RING-type E3 ubiquitin ligases kan videre deles inn i enkle og komplekse E3 enzymer. Den enkle singelen delenhet RING E3-ligases inneholder både substrat gjenkjennings stedet og E2-binding RING-domenet. I motsetning til dette har multisubunit RING-type E3-kompleks enten rekruttere substrat eller formidler binding av E2-ubiquitin mellomliggende til E3-komplekset. RINGEN domenet lys rester (er) som fungerer som en primær ubiquitin vedlegg nettsted (er) for selv-ubiqitinering kan også være viktig for E3 ligase aktivitet.
Ikke alle RING-inneholdende proteiner fungerer som E3-ligases. Dermed må Bioinformatic prediksjon av RING-finger domene og kapasitet for E2-avhengige protein ubiqitinering være biokjemisk validert og knyttet til den biologiske rollen til det testede proteinet. Her beskriver vi en trinnvis protokoll som beskriver hvordan du kan oppdage og funksjonelt karakterisere enzymatisk aktivitet av RING-type E3 ubiquitin ligases, både in vitro og i planta, gjennom en område styrt mutagenese tilnærming. Representanten resultatene fra denne rørledningen er vist for RING-type E3 ligase RHA1B. RHA1B er en effektor protein produsert av planten parasitt cyste nematode Globodera pallida å undertrykke plante immunitet og manipulere morfologi av plante rot celler. For å beskytte seg mot patogen/parasitt invasjon, har planter utviklet seg nukleotid-bindende domene og leucine gjenta (NB-LRR) type uimottakelig reseptorer som oppdager tilstedeværelsen av en patogen eller parasitt, og som en konsekvens, utvikle overfølsom respons (HR), som er en form for rask og lokaliserte celle død forekommer på infeksjonen stedet å arrestere kolonisering av patogener. En slik immun reseptor er potet Gpa2 protein som gir motstand mot noen isolerer av G. pallida (felt populasjoner D383 og D372)7.
Ved hjelp av presenterte protokoller, har det nylig blitt funnet at RHA1B forstyrrer anlegget immun signalering i en E3-avhengig måte ved å målrette anlegget Gpa2 immunoreceptor for ubiqitinering og degradering8.
Elucidating den biokjemiske og mekanistisk grunnlag av RING type E3 ubiquitin ligases kan bidra sterkt til vår forståelse av deres biologiske betydning i utvikling, stress signalering, og vedlikehold av homeostase. Protokollen beskrevet her par en mutagenese tilnærming med in vitro og i planta funksjonelle studier. Ved å innføre en enkelt aminosyre substitusjon i bevarte rester av RING domenet gjennom nettstedet-direkte mutagenese, den resulterende E3-mangelfull mutant kan testes parallelt med vill type protein for å koble enzymatisk aktivitet med funksjonalitet.
Det er avgjørende å riktig identifisere RING domene, spesielt sin bevarte cys og hans rester. Online verktøy som PROSITE kan brukes til å gjøre det10. Å destabilisere RING domenet ansvarlig for å rekruttere E2 enzymet, cys er normalt erstattes med ser, som er den nærmeste strukturelle erstatning mangler evnen til å skape en disulfide obligasjon brukes til sink koordinering. Lorick et al. viste at mutasjonen i noen av de kritiske cys rester ville avskaffe den ubiqitinering aktiviteten til singelen delenhet RING-type E3 ligases5. Selv om noen cys rester er også viktig for multiunit E3 ligase komplekser inneholder RING-type proteiner, på grunn av mangesidig og dynamisk tredimensjonal struktur av de ubiqitinering komplekser og annen rolle RING-type proteiner, enkelt erstatninger av bevarte rester i RINGEN domenet i multiunit E3 ligase har ikke vært vellykket i å generere en ligase mangelfull fenotype11.
For området-regissert mutagenese, fant vi at bruk av mindre plasmider vektorer og lavere forsterkning sykluser vanligvis gitt høyere effektivitet for mutagenese. Det PFU enzymet kan erstattes med alle andre High-Fidelity og høy processivity DNA polymerase. Videre, hvis genet av interesse inneholder sjeldne kodon, en annen E. coli stain, Rosetta, kan brukes til å oppnå høyere utbytte av rekombinant protein. I tillegg kan både inkubasjonstid og temperatur for IPTH induksjon bli ytterligere optimalisert. Lavere temperaturer redusere E. coli divisjon rente, som kan være gunstig for uttrykk for visse proteiner. Selv om høyere konsentrasjon av IPTH kan forbedre protein uttrykk, hemmer det også E. coli divisjon prosesser og anbefales ikke.
Single delenhet RING type E3 ligases fungerer ikke bare som et molekyl stillas som plasserer E2-UB-middels i umiddelbar nærhet av underlaget, men også stimulerer ubiquitin overføringsaktivitet i deres beslektet E2s. Videre, gitt at en E2/E3 kombinasjon er viktig for lengden og sammenhengene av polyubiquitin kjeden som bestemmer skjebnen til et modifisert substrat, enhver vurdering av RING-type E3s må inkludere sine enzymatisk partnere, E2s12. Som vist i Figur 3B, er ikke alle TESTEDE E2s kompatible med RHA1B-ligase. Derfor, in vitro ubiqitinering analyser bør gjennomføres parallelt med flere E2 enzymer som representerer ulike E2 klasser for å unngå falske negative resultater.
Presentert her er in vitro enzymatisk analysen som oppdager selv ubiqitinering evne til testet RING-type proteiner. Men med små modifikasjoner, kan denne protokollen enkelt tilpasses for å oppdage in vitro ubiqitinering av underlag. For dette formål bør in vitro ubiqitinering blanding fra trinn 2,15 suppleres med rekombinant protein av potensialet E3 ligase substrat (500 ng). Etter en 2 h inkubasjons ved 30 ° c, bør ubiquitinated protein fanges opp ved hjelp av 15 μL av anti-HA-affinitet matrise (hvis HA-UB brukes, eller anti-FLAG affinitet matrise hvis FLAG-UB brukes) ved omrøring for 2 h ved 4 ° c. Etter vask perlene 4X ganger med den kalde UB vaskebuffer (20 mM Tris pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,05% mellom 20, 1x PMSF), forkaste alle unntatt 40 μL av bufferen og gå til trinn 2,16. Den ubiqitinering signal, oppdages av antistoffer som er spesifikke for epitope UB og substrat, henholdsvis, dukker opp fra Molekylvekten av underlaget protein, bekrefter underlaget/enzym spesifisitet.
Videre identifisering av E3 ligase underlag in vivo er vanligvis forbundet med flere utfordringer på grunn av forbigående enzym-substrat interaksjon og rask nedbrytning av ubiquitinated mål protein. Bruke en E3 ligase mangelfull mutant, som fortsatt samhandler med sitt mål, men ikke lenger ubiquitinates det13, er et svært nyttig alternativ til tillegg av PROTEASOMAL inhibitor MG132, som ikke alltid er tilstrekkelig forstyrre 26s proteasomet funksjon.
En felles karakteristikk av RING-type E3 ligases er en tendens til å forme og fungere som homo-og/eller heterodimerer. Interessant, er substitusjon i de bevarte rester av RING-domenet vanligvis forbundet med en dominerende negativ fenotype hvor mutert RING-type E3 ligase blokkerer enzymatisk aktivitet av en innfødt vill type protein13. Dermed kan overuttrykte av RING mutanter i planta være en alternativ tilnærming til å banke ut E3 ligase genet.
The authors have nothing to disclose.
Vårt arbeid ble gjort mulig av finansiell støtte fra landbruk og mat Research Initiative konkurransedyktig stipend (2017-67014-26197; 2017-67014-26591) av USDA National Institute of Food and Agriculture, USDA-NIFA Farm Bill, Northwest Potato Consortium, og ISDA spesialist crop.
Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
Amylose resin | NEB | E8021S | |
ATP | Sigma-Aldrich | A1852 | |
Bacterial protease inhibitor | Sigma-Aldrich | P8465 | |
Bromphenol Blue | VWR | 97061-690 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Centrifuge | Beckman Coulter | model: Avanti J-25 | |
Commassie Blue | VWR | 97061-738 | |
Creatine phosphate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Creatine phosphokinase | Sigma-Aldrich | C3755 | |
DNA clean & concentrator Kit | ZYMO RESEARCH | D4029 | |
DpnI | NEB | R0176S | |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
E. coli BL21 | Thermo Fisher Scientific | C600003 | |
E. coli DH5α competent cells | Thermo Fisher Scientific | 18265017 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | 324504 | |
FeSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | F7002 | |
FLAG-Ub | BostonBiochem | U-120 | |
Glucose | VWR | 188 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
HA-Ub | BostonBiochem | U-110 | |
Heat block | VWR | model: 10153-318 | |
Incubator | VWR | model: 1525 Digital Incubator | |
Incubator shaker | Thermo Fisher Scientific | model: MaxQ 4000 | |
IPTG | Roche | 10724815001 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | |
Liquide nitrogen | university chemistore | ||
Maltose | Sigma-Aldrich | 63418 | |
MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | 63138 | |
MgSO4 7H2O | Sigma-Aldrich | 63138 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | model: 5424 | |
Miniprep plasmid purification kit | ZYMO RESEARCH | D4015 | |
monoclonal anti-FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F3165 | |
monoclonal anti-HA antibody | Sigma-Aldrich | H9658 | |
monoclonal anti-MYC antibody | Sigma-Aldrich | WH0004609M2 | |
Mortar | VWR | 89038-144 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | model: 2000 Spectrophotometer | |
Needle | Thermo Fisher Scientific | 14-826-5C | |
NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
PCR machine | Bio-Rad | model: C1000 | |
Pestle | VWR | 89038-160 | |
Pfu Ultra | Agilent Technologies | 600380 | |
Plant protease inhibitor coctail | Sigma-Aldrich | P9599 | |
pMAL-c2 | NEB | N8076S | |
PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
Polyvinylpolypyrrolidone | Sigma-Aldrich | P6755 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sonicator | Qsonica Sonicators | model: Q125 | |
Syringe | Thermo Fisher Scientific | 22-253-260 | |
Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
T4 ligase | NEB | M0202S |