Summary
Denne protokollen gir en lett-å-håndtere metode for å kulturen i tarm celler fra havet agurk Apostichopus japonicus og er kompatibel med en rekke allment tilgjengelige vevsprøver fra Marine organismer, inkludert Echinodermata, Mollusca, og krepsdyr.
Abstract
Primære kultivert celler brukes i en rekke vitenskapelige disipliner som eksepsjonelt viktige verktøy for funksjonell evaluering av biologiske stoffer eller karakterisering av spesifikke biologiske aktiviteter. Men på grunn av mangelen på universelt gjeldende cellekultur Media og protokoller, godt beskrevet cellekultur metoder for Marine organismer er fortsatt begrenset. I mellomtiden, vanlig forekommende mikrobiell forurensning og polytropic egenskaper av marine virvelløse celler ytterligere hindre etablering av en effektiv cellekultur strategi for Marine virvelløse dyr. Her beskriver vi en lett-å-håndtere metode for dyrking intestinal celler fra havet agurk Apostichopus japonicus; i tillegg gir vi et eksempel på in vitro apoptose induksjon og deteksjon i primære kultivert tarm celler. Videre gir dette eksperimentet detaljer om riktig kultur medium og celle innsamlingsmetode. Den beskrevne protokollen er kompatibel med en rekke tilgjengelige vevsprøver fra Marine organismer, inkludert Echinodermata, Mollusca og krepsdyr, og den kan gi tilstrekkelige celler til flere in vitro-eksperimentelle applikasjoner. Denne teknikken vil gjøre forskerne i stand til å effektivt manipulere primær cellekulturer fra Marine virvelløse dyr og for å lette den funksjonelle evalueringen av målrettede biologiske materialer på celler.
Introduction
Dyrking celler under kunstig kontrollerte forhold, og ikke i sitt naturlige miljø, gir ensartet eksperimentelle materialer for biologiske studier, spesielt for arter som ikke kan lett kultivert i et laboratoriemiljø. Marine virvelløse dyr utgjør mer enn 30% av alle dyrearter1, og de gir mange biologiske materialer for å gjennomføre forskning på regulatoriske mekanismer for spesifikke biologiske prosesser, for eksempel regenerering2,3, stress respons4, og miljø tilpasning5,6.
Havet agurk, Apostichopus japonicus, er en av de mest studerte echinoderm arter bor tempererte farvann langs nord-Stillehavet kysten. Det er velkjent som en kommersielt viktig Art og maricultured i stor skala i Øst-Asia, spesielt i Kina7. Tallrike vitenskapelige spørsmål om A. japonicus, inkludert regulatoriske mekanismer underliggende intestinal regenerering etter evisceration8 og degenerasjon i aestivation9, metabolsk kontroll10,11, og immunrespons12,13 under termisk eller patogene påkjenninger, har tiltrukket seg oppmerksomheten til forskere. Men sammenlignet med godt studert modell dyr, grunnleggende forskning, spesielt på cellenivå, er begrenset av tekniske flaskehalser, for eksempel mangelen på avanserte cellekultur metoder.
Forskere har viet mye arbeid med å etablere cellelinjer, men de har også møtt mange utfordringer og ingen cellelinje fra noen Marine virvelløse har blitt etablert ennå14. Imidlertid har primær cellekulturer fra Marine virvelløse dyr Avansert i siste ti år15,16, og de har gitt en mulighet for eksperimentering på cellenivå. For eksempel har regenererende intesine fra A. japonicus blitt utnyttet som en kilde til celler for langsiktige cellekulturer som ga en praktisk metode for primær cellekultur av marine virvelløse dyr17. Denne protokollen kombinert og optimalisert virvelløse cellekultur tilnærminger og utviklet en allment egnet primær kultur metode for sjø agurk eller andre marine virvelløse dyr.
Apoptose er en iboende celle selvmords program utløst av ulike eksogene og endogene stimuli. Koordinert apoptose er avgjørende for mange biologiske systemer18,19, og det har vært innblandet i intestinal regresjon av havet agurk under aestivation9. For å undersøke apoptotisk prosessen i organismer av interesse, er en rekke metoder, inkludert Hoechst farging og mikroskopi analyser, etablert og hell brukt20. Her gjennomførte vi apoptose induksjon og deteksjon i primære kultivert tarm celler av havet agurk å vurdere brukbarheten av primær celler i biologiske studier av marine virvelløse dyr. Deksametason, en av de mest brukte syntetiske glukokortikosteroider21, ble brukt til å indusere apoptose i kulturperler tarm celler fra havet agurk, og signifikant Hoechst 33258 signal ble oppdaget i farget celler av fluorescerende mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cellekultur medium forberedelse
-
Tilberedning av Coelomic væske
- Coelomic væske samling: Under sterile betingelser, analysere en sunn sjø agurk (våt vekt på 85-105 g), samle coelomic væske, og lagre den i et sterilt glass kolbe.
- Coelomic celle fjerning: Sentrifuger den coelomic væsken i 50 mL sentrifugerør ved 1 700 x g i 5 min og Overfør supernatanten til en ny steril glass kolbe; neste, samle celle-fri coelomic væske av havet agurk.
- Komplement komponenter inaktive: Ruge den sterile glass flasken, som inneholder havet agurk coelomic væsken, i et vannbad på 40 – 50 ° c i 20 – 40 minutter for å få komplement komponenter-deaktivert coelomic væske.
- Mikrobe fjerning: Fjern bakterier og chlamydia ved filtrering gjennom 0,22 μm membran filtre. Deretter fjerner mycoplasma og andre Fine partikler ved filtrering ved hjelp 0,1 μm membran filtre for å oppnå coelomic væske forbehandling løsning.
- Justering av saltinnhold: Juster saltinnholdet i den coelomic væske forbehandling løsningen til 30‰ (målt ved salinometer) ved å tilsette 20% høy konsentrasjons presterilized og filtrert NaCl-løsning (fortynnet av forbehandlet coelomic væske) eller DDW (dobbelt destillert vann). Overfør havet agurk coelomic væske i en steril flaske, forsegle flasken, og oppbevar væsken ved 4 ° c for videre eksperimenter.
-
Leibovitz ' s L-15 cellekultur medium optimalisering
- Veie 5,05 g av NaCl, 0,135 g av KCl, 0,15 g CaCl2, 0,25 g av na2så4, 0,975 g av MgCl2, 0,25 g av glukose, og 6,25 mg taurin og fortynne dem i 40 ml av Leibovitz ' s L-15 medium i en 50 ml steril sentrifuger tube. Agitere røret på en shaker for 1 h for å sikre at salter har oppløst helt.
- Tilsett 2,5 mL L-glutamin (100 mg/mL) og 500 μL av VE-oppløsning (1,75 mg/L) i tidligere tilberedte Leibovitz L-15 medium og ytterligere filter mediet gjennom 0,22 μm membran filtre.
- Juster det totale medium volumet til 500 mL med friskt Leibovitz L-15 medium og med 100 mL tidligere fremstilt coelomic væske; Juster deretter pH-verdien til 7,6 ved hjelp av NaOH-løsningen. Hold operasjons prosessen i et sterilt miljø. Den sammensatte forholdet mellom coelomic væske kan være 10%-50%, og 20% er tilstrekkelig for A. japonicus intestinal celler kultur.
2. intestinal Cell forberedelse
-
Sea agurk tarmen prosessering
- Dop sunne sjø agurker i en is boks. Analysere og samle den fremre tarmen, deretter delen vevsprøvene vertikalt og fjerne det indre innholdet.
- Vask vevsprøvene i fosfat bufret saltvann (PBS) to ganger og desinfisere dem ved nedsenkning i en vandig etanol løsning (75% av volum) for ikke lenger enn 2 s.
- Vask vevsprøvene i PBS tre ganger for å fjerne etanol og overføre ca 100 mg Vevsprøve i en 2,0 mL steril mikrosentrifugen tube.
-
Celle samling
- Legg 1,5 mL av pre-optimalisert kultur medium til sjøen agurk intestinal vev blokk og hakke blokken med sterilisert kirurgisk saks til løsningen er skyet.
Merk: for valgfri forenklet protokoll, tilsett 0,5 mL pre-optimalisert kultur medium til sjøen agurk intestinal vev blokk og kutt blokken med sterilisert kirurgisk saks i 1 mm3. Direkte overføre prøvene til kultur retter etterfulgt av påfølgende incubating trinn. - Tilsett 400 μL av Trypsin (0,25%), bland oppløsningen ved inversjon og ruge den i 5 min ved romtemperatur; deretter filtrerer du oppløsningen ved hjelp av en 100 μm celle sil.
Merk: det er valgfritt å legge til Trypsin for celle dispersjon ved behandling av forskjellige vevsprøver. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) bør være inneholdt i Trypsin løsning for å redusere den hemmende aktiviteten fra ca2 + og mg2 + i kultur medium. - Samle Filtrer til en ny steril 2,0 mL mikrosentrifugen tube, sentrifuger på 1 700 x g i 3 min, kast supernatanten, deretter resuspend pellet i kultur medium (supplert med antibiotika) og vask den to ganger.
Merk: klargjør et nytt, forhånds optimalisert kultur medium supplert med 2% penicillin-Streptomycin oppløsning (10 000 U/mL penicillin og 10 mg/mL Streptomycin) og 1% Gentamicin (4 mg/mL) før begynnelsen av eksperimentet.
- Legg 1,5 mL av pre-optimalisert kultur medium til sjøen agurk intestinal vev blokk og hakke blokken med sterilisert kirurgisk saks til løsningen er skyet.
3. Cell kultur
-
Inkubator forhåndsinnstille: Forhåndsinnstilt inkubator for cellekultur og kjøre den på forhånd i minst 24 timer med temperatur på 18 ° c og mettet fuktighet.
Merk: feed CO2 inn i inkubator avhengig av celle kulturen medium egenskaper; no CO2 må leveres ved bruk av basis mediet til Leibovitz L-15. -
Første fase cellekultur
- For å hemme veksten av mikrober og for å fremme spredning i den innledende fasen av celle kulturen, tilsett 10 mL av penicillin-Streptomycin oppløsning (10 000 U/mL penicillin og 10 mg/mL Streptomycin) og 0,5 mL Gentamicin (40 mg/mL) i hver 500 mL pre-optimalisert kultur medium. Videre supplerer hvert 500 mL kultur medium med 0,6 mL insulin (10 mg/mL), 100 μL av insulin-lignende vekstfaktor (0,1 μg/μL) og 25 μL av Fibroblast vekstfaktor (0,1 μg/μL).
- Samle cellene i 1,5 mL rør, resuspend dem med 200 μL av indikert medium, og Pipet dem i φ 4 cm retter.
- Kultur cellene i en inkubator og tilsett 2,0 mL indikert medium til cellen dyrking retter etter 6 h. endre halvparten av mediet hver 12 h til nå neste etappe.
Merk: Håndter medium endre forsiktig, fordi cellene ikke er festet til rettene tett. Poly-D-lysin-belagte retter kan brukes for løst feste til parabolen cellene.
-
Andre fase cellekultur
- For å redusere de negative virkningene av antibiotika til den kultivert celler, redusere konsentrasjonen av indikerte antibiotika (penicillin, Streptomycin, og Gentamicin) i kulturen medium til halvparten.
Merk: bruken av insulin og vekstfaktorer avhenger av cellekultur forhold og er valgfritt. - Erstatt cellekultur medium; utføre medium endringer hver to til tre dager, avhengig av celle tettheten.
Merk: Observer de kultivert cellene daglig under et mikroskop og registrere vekstforhold.
- For å redusere de negative virkningene av antibiotika til den kultivert celler, redusere konsentrasjonen av indikerte antibiotika (penicillin, Streptomycin, og Gentamicin) i kulturen medium til halvparten.
-
Celle passaging
Merk: passasje og under kultur cellene, når den primære celle tettheten når 60%.- Vask de dyrkede cellene to ganger med PBS ved romtemperatur. Tilsett 200 μL av Trypsin oppløsning (0,25%) til hver tallerken og manuelt agitere fatet sikre hele bunnen er dekket. Kast den Trypsin oppløsningen og ruge cellene i 5 minutter ved romtemperatur.
- Vask cellene med 1,0 mL friskt kultur medium ved å pipettering og blanding cellene. Overfør 0,5 mL av celle fjæringen til en ny tallerken, tilsett 1,5 mL friskt medium, og ruge cellene ved 18 ° c.
Merk: celle skraper kan brukes til celle innsamling når Trypsin løsningen ikke klarer å fordøye og løsne celler fra rettene (noen cellelinjer er for lim). Men ikke utføre begge metoder samtidig. - Endre mediet etter 12 h og observere cellene under et mikroskop for å evaluere forholdene. Kultur cellene for videre eksperimentelle analyser.
4. apoptose induksjon og deteksjon i A. japonicus intestinal celler
-
Cell kultur og deksametason behandling
- Forbered intestinal celler etter tidligere innført protokollen og tilsett cellene dråpevis til en 12-brønn plate på et celle volum på 2 x 106 per brønn.
- Etter tre dager i kultur, etter trinnene i "første fase cellekultur", vaske cellene tre ganger med PBS og erstatte mediet med optimalisert medium (uten antibiotika og vekstfaktorer).
- Fortynne deksametason (DXMS) i kultur medium for å forberede fersk 2 μM og 200 μM DXMS løsninger før du begynner eksperimentene.
- Legg DXMS løsninger i ulike konsentrasjoner til kultivert celler vokst med samme volum av dyrking medium; sett tre eksperimentelle grupper inkludert kontroll (CTL), 1 μM og 100 μM DXMS.
-
Hoechst farging
- Vask cellene med PBS tre ganger etter inkubasjons med/uten DXMS for de angitte tidsperiodene (0 h, 24 h, og 48 h).
- Tilsett 300 μL av Hoechst 33258-oppløsning per brønn til en 12-brønn plate og ruge ved 18 ° c i 30 min. forsiktig agitere platen for å dekke alle celler som sikrer deres farging.
- Fjern Hoechst farge løsning og fest cellene ved å legge 300 μL av en 4% paraformaldehyde løsning (i PBS) til hver brønn. Forsiktig agitere i 15 min.
Forsiktig: Paraformaldehyde er moderat giftig ved hudkontakt eller innånding, og det er utpekt som et sannsynlig kreftfremkallende stoff. Kjemiske røyk hetter, ventilerte balanse kabinetter eller andre vernetiltak bør brukes under veiing og håndtering av paraformaldehyde. - Vask de faste cellene tre ganger i PBS. Ikke kast PBS etter vask for å holde cellene tildekket.
-
Fluorescerende mikroskopi analyse
- Slå på den fluorescerende mikroskop maskinvaren inkludert kvikksølvlampe strøm, fluorescerende lys kraft, og PC. Logg inn på operativsystem kontoen, start programvaren og Kontroller konfigurasjonen.
- Plasser den preparerte platen på scenen i mikroskopet. Plasser prøven over objektiv objektivet ved hjelp av scene kontrolleren.
- Finn cellene av interesse under lyset mikroskop, bytte til fluorescerende mikroskopi, og ta bilder ved tuning parametrene.
Merk: for å observere Hoechst 33258 fluorescerende signal bundet til kjerner DNA, fluorescens mikroskopi bør gjennomføres med eksitasjon og utslipp på ca 352 NM og 461 NM, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her etablerte vi primære intestinal cellekultur av A. japonicus og passert cellene. Figur 1 viser runde celler i ulike stadier av dyrking. Og EdU farging analyser gir direkte bevis for å avdekke proliferativ aktivitet av disse runde celler i senere stadium (figur 2). Vi har også litt justert protokollen, dyrking hakket vev blokker i stedet for filtrert celler; Videre kan en spindel celle type være kultivert vellykket. Denne cellen type skjedd i nærheten det intestinal tissue avdelinger og det kan observeres etter fire dager av kulturen; den ble imidlertid ikke passert (Figur 3).
Den kultivert celler kan brukes til ulike biologiske eksperimentelle applikasjoner. Vi behandlet cellene med DXMS for ulike tidsperioder, etterfulgt av Hoechst 33258 farging for apoptotisk celle deteksjon. Figur 4 indikerer indusert apoptotisk signalet oppdaget fra havet agurk tarm celler av Hoechst 33258 farging og fluorescerende mikroskopi. Figur 5 demonstrerer de apoptotisk celle frekvensene for angitte tidsperioder under STIMULERING med DXMS.
Figur 1: mikroskopi av kultivert sjø agurk intestinal runde celler på ulike stadier. (A) celler festet til bunnen av rettene på den tredje dagen etter å ha blitt sådd. (B) celle spredning på den sjuende dagen. (C) celler festet til bunnen av rettene etter passaging. (D) celler som har mistet aktivitet og dør etter ti passasjer. "CM" indikerer celle massen, som oppstår under celle spredning. "BT" indikerer svart spor, som ble etterlatt av døde celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: celle spredning oppdaget ved at EdU farge analyser. Celle spredning analysene ble utført ved hjelp av Kit (tabell av materialer) i henhold til produsentens protokoll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: mikroskopi av kultivert hav agurk intestinal vev blokker og celle spredning. (A) vev blokker (TB) festet til parabolen bunnen på den første dagen etter kultur. (B) vev blokker og celler festet til parabolen bunnen på den andre dagen etter kultur. (C) vev blokker og perifert oppstod spindel celler (SC) på den fjerde dagen etter kultur. (D) proliferated spindel celler på den syvende dagen etter kultur. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: fluorescerende mikroskopi av tarm runde celler med indusert apoptose. "NC" indikerer kjernefysisk kondens fluorescerende signal. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: statistisk analyse av Hoechst-positive tarm runde celler. Fordeling av prosentandelen av kjernefysisk kondens fluorescerende signal-positive celler blant Hoechst farget A. japonicus intestinal celler sammen med dose eller tid løpet av eksperimentet (n = 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omfattende forskningsarbeid har vært viet til å etablere cellelinjer i siste ti år, men det er fortsatt vanskelig å gjøre en fremgang på langsiktig kultur av celler fra Marine virvelløse dyr14,22. Det har blitt rapportert at kultivert celler fra regenererende holothurian vev var levedyktig i en lengre periode og høy aktivitet av spredning kan påvises i bestemte celler17,23. Men for normal Marine virvelløse celler, er det ennå ingen praktisk cellekultur tilnærming er beskrevet. Protokollen som presenteres her gir en effektiv og lett interpretable metode for dyrking og passaging intestinal celler fra Marine virvelløse arter A. japonicus. Metoden kan enkelt tilpasses for primær cellekultur av mange forskjellige Marine virvelløse organismer som blekksprut og krabbe.
En rekke nøkkelfaktorer påvirker den vellykkede anvendelsen av denne prosedyren. Forebygging av mikrobiell forurensning er av fremste betydning under hele prosessen, og spesielt i den første uken av kulturen. Akvatiske dyr vanligvis kontakt mange mikrober fra miljøet, som kolonisere deres vev, som Gill, tarmen, fin, og huden. Dermed vil det være umulig å sterilisere vevsprøvene før celle kulturen initiering. For å minimere risikoen for mikrobiell forurensning i celle kulturen, er 75% etanol nedsenking for Vevsprøve sterilisering viktig; Imidlertid bør behandlingstiden optimaliseres for ulike vevstyper. Videre, anvendelse av høye antibiotika konsentrasjoner i de tidlige stadiene av celle kulturen spiller også en viktig rolle i Hemming av mikrobiell vekst. Videre er medium formulering en viktig faktor for å bestemme spredning og levetid for kulturperler celler. Siden ernæringsmessige kravene i marine virvelløse celler er fortsatt ukjent, har den nåværende celle kulturen medium brukt vært hovedsakelig designet for virveldyr eller insekt cellelinjer14. Å levere tilstrekkelig ernæringsmessige materialer, forbehandlet coelomic væske fra sjø agurker kan brukes lik FBS i pattedyr cellekultur. I mellomtiden, for å lette celle spredning, kan flere pattedyr vekstfaktorer også brukes i kultur medium. Siden inkubasjons temperatur er en faktor som påvirker suksessen til Marine virvelløse cellekultur, incubating celler under optimal vekst temperatur av målet organisme bør vurderes. For eksempel kan temperaturen for A. japonicus cellekultur settes til 18 ° c, som er egnet for vekst24.
Tissue forbehandling kan påvirke vellykket kultivert og voksende celletyper. Svært forskjellige A. japonicus intestinal celler, rund eller spindel, kan fås fra seeding filtrert celler eller vev blokker under nøyaktig samme kultur prosedyre (komparative data fra figur 1 og Figur 3). Dermed bør optimalisere vev pretreating metode for spesifikk cellekultur type også gjennomføres i begynnelsen; den optimale prosedyren bør avgjøres i henhold til biologisk eksperimentell design.
Her har vi brukt DXMS behandling for apoptose induksjon i A. japonicus intestinal celler etter tre dager i kultur, og vi utførte Hoechst farging for apoptotisk signal deteksjon. Vellykket påvisning av Hoechst positive celler, etter 48 h stimulering med 1 μM DXMS, ga et praktisk eksempel for et biologisk eksperiment basert på de kulturelle cellene.
Den beskrevne protokollen er enkel å håndtere og kan brukes for å etablere en Marine virvelløse cellekultur. Den kultivert cellene bør gi biologisk materiale med konsistent genetisk bakgrunn for ulike videre biologiske eksperimentelle applikasjoner. Videre kan litt justerte protokoll prosedyrer endre den vellykkede voksende celletyper under kultur og gi ulike celle materialer for biologiske eksperimenter. Så, optimalisering av visse trinn i protokollen vil være nødvendig, avhengig av målrettede dyrearter og de spesifikke celletyper som trengs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Prof Naiming Zhou fra Zhejiang University for hans tekniske råd og for å gjøre utstyret av hans laboratorium tilgjengelig for bruk. Dette arbeidet ble økonomisk støttet av National Natural Science Foundation i Kina (gi tall 41876154, 41606150 og 41406137) og de grunnleggende forskningsmidler for Zhejiang Provincial universiteter og forskningsinstitutter [gi nummer 2019JZ00007 ].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
- Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
- Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
- Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
- Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
- Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
- Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
- Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
- Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
- Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
- Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
- Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
- Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
- Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
- Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
- Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
- Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
- Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
- Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
- Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
- Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
- Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
- Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
- Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
- Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).
