Apoptose indução e detecção em uma cultura primária de células intestinais de pepino do mar
Summary
Este protocolo fornece um método fácil de manusear para cultura as células intestinais do pepino do mar Apostichopus japonicus e é compatível com uma variedade de amostras de tecido amplamente disponíveis de organismos marinhos, incluindo Echinodermata, Mollusca e Crustáceos.
Abstract
As células cultivadas primárias são usadas em uma variedade de disciplinas científicas como ferramentas excepcionalmente importantes para a avaliação funcional de substâncias biológicas ou caracterização de atividades biológicas específicas. No entanto, devido à falta de meios e protocolos de cultura celular universalmente aplicáveis, métodos de cultura celular bem descritos para organismos marinhos ainda são limitados. Enquanto isso, a contaminação microbiana que ocorre comumente e as propriedades polítas das células marinhas de invertebrados impedem ainda mais o estabelecimento de uma estratégia eficaz de cultura celular para invertebrados marinhos. Aqui, descrevemos um método fácil de manusear para cultivar células intestinais do pepino do mar Apostichopus japonicus; além disso, fornecemos um exemplo de in vitro apoptose indução e detecção em células intestinais de cultura primária. Além disso, este experimento fornece detalhes sobre o método de coleta de células e meio de cultura apropriado. O protocolo descrito é compatível com uma variedade de amostras de tecido amplamente disponíveis de organismos marinhos, incluindo Echinodermata, Mollusca e Crustáceo, e pode fornecer células suficientes para múltiplas aplicações experimentais in vitro. Esta técnica permitiria aos pesquisadores manipular eficientemente culturas de células primárias a partir de invertebrados marinhos e facilitar a avaliação funcional de materiais biológicos direcionados nas células.
Introduction
Cultivar células condições artificialmente controladas, e não em seu ambiente natural, fornece materiais experimentais uniformes para estudos biológicos, especialmente para espécies que não podem ser facilmente cultivadas em um ambiente de laboratório. Os invertebrados marinhos são responsáveis por mais de 30% de todas as espécies animais1,e fornecem inúmeros materiais biológicos para a realização de pesquisas sobre os mecanismos regulatórios de processos biológicos específicos, como regeneração2,3,resposta ao estresse4,e adaptação ambiental5,6.
O pepino do mar, Apostichopus japonicus,é uma das espécies mais estudadas echinoderm que habitam águas temperadas ao longo da costa do Pacífico Norte. É bem conhecido como uma espécie comercialmente importante e maricultured em grande escala no Leste Asiático, especialmente na China7. Inúmeras questões científicas sobre A. japonicus, incluindo os mecanismos regulatórios subjacentes regeneração intestinal após a evisceração8 e degeneração na aestivation9, controle metabólico10,11, e resposta imune12,13 estresses térmicos ou patogênicos, têm atraído a atenção dos pesquisadores. No entanto, em comparação com animais modelo bem estudados, a pesquisa básica, especialmente no nível celular, é limitada por gargalos técnicos, como a falta de métodos avançados de cultura celular.
Os pesquisadores têm dedicado muito esforço para estabelecer linhas celulares, mas eles também enfrentaram muitos desafios e nenhuma linha celular de qualquer invertebrado marinho foi estabelecida ainda14. No entanto, as culturas celulares primárias de invertebrados marinhos avançaram nas últimas décadas15,16,e eles proporcionaram uma oportunidade para a experimentação no nível celular. Por exemplo, a intesina regenerante de A. japonicus tem sido utilizada como uma fonte de células para culturas celulares de longo prazo que forneceu um método prático para a cultura celular primária de invertebrados marinhos17. Este protocolo combinou e otimizou abordagens da cultura de células invertebradas e desenvolveu um método de cultura primária amplamente adequado para pepino do mar ou outros invertebrados marinhos.
A poptose é um programa de suicídio de células intrínsecas desencadeado por vários estímulos exógenos e endógenos. A apoptose coordenada é crucial para muitos sistemas biológicos18,19,e tem sido implicada na regressão intestinal de pepino do mar durante a aestivation9. Para investigar o processo apoptotesco em organismos de interesse, uma série de métodos, incluindo a coloração Hoechst e ensaios microscopia, foram estabelecidos e aplicados com sucesso20. Aqui, realizamos aindução e detecção de apoptose em células intestinais primárias de pepino do mar para avaliar a usabilidade das células primárias em estudos biológicos de invertebrados marinhos. A dexametasona, um dos glicocorticosteroides sintéticos comumente usados21,foi usada para induzir apoptose em células intestinais cultivadas a partir de pepino do mar, e o sinal hoechst 33258 significativo foi detectado com sucesso nas células manchadas por microscopia fluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Extensos esforços de pesquisa têm sido dedicados ao estabelecimento de linhas celulares nas últimas décadas, no entanto, ainda é difícil fazer um progresso na cultura de longo prazo das células de invertebrados marinhos14,22. Tem sido relatado que as células cultivadas de regeneração de tecidos holothurian foram viáveis por um longo período de tempo e alta atividade de proliferação pode ser detectada em células específicas17</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Naiming Zhou da Universidade de Zhejiang por seu conselho técnico e por disponibilizar o equipamento de seu laboratório para uso. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela National Natural Science Foundation of China (números de subvenção 41876154, 41606150 e 41406137) e os Fundos fundamentais de pesquisa para universidades e institutos de pesquisa provinciais de Zhejiang [número de subvenção 2019JZ00007 ].
Materials
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
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