Summary
Este protocolo fornece um método fácil de manusear para cultura as células intestinais do pepino do mar Apostichopus japonicus e é compatível com uma variedade de amostras de tecido amplamente disponíveis de organismos marinhos, incluindo Echinodermata, Mollusca e Crustáceos.
Abstract
As células cultivadas primárias são usadas em uma variedade de disciplinas científicas como ferramentas excepcionalmente importantes para a avaliação funcional de substâncias biológicas ou caracterização de atividades biológicas específicas. No entanto, devido à falta de meios e protocolos de cultura celular universalmente aplicáveis, métodos de cultura celular bem descritos para organismos marinhos ainda são limitados. Enquanto isso, a contaminação microbiana que ocorre comumente e as propriedades polítas das células marinhas de invertebrados impedem ainda mais o estabelecimento de uma estratégia eficaz de cultura celular para invertebrados marinhos. Aqui, descrevemos um método fácil de manusear para cultivar células intestinais do pepino do mar Apostichopus japonicus; além disso, fornecemos um exemplo de in vitro apoptose indução e detecção em células intestinais de cultura primária. Além disso, este experimento fornece detalhes sobre o método de coleta de células e meio de cultura apropriado. O protocolo descrito é compatível com uma variedade de amostras de tecido amplamente disponíveis de organismos marinhos, incluindo Echinodermata, Mollusca e Crustáceo, e pode fornecer células suficientes para múltiplas aplicações experimentais in vitro. Esta técnica permitiria aos pesquisadores manipular eficientemente culturas de células primárias a partir de invertebrados marinhos e facilitar a avaliação funcional de materiais biológicos direcionados nas células.
Introduction
Cultivar células condições artificialmente controladas, e não em seu ambiente natural, fornece materiais experimentais uniformes para estudos biológicos, especialmente para espécies que não podem ser facilmente cultivadas em um ambiente de laboratório. Os invertebrados marinhos são responsáveis por mais de 30% de todas as espécies animais1,e fornecem inúmeros materiais biológicos para a realização de pesquisas sobre os mecanismos regulatórios de processos biológicos específicos, como regeneração2,3,resposta ao estresse4,e adaptação ambiental5,6.
O pepino do mar, Apostichopus japonicus,é uma das espécies mais estudadas echinoderm que habitam águas temperadas ao longo da costa do Pacífico Norte. É bem conhecido como uma espécie comercialmente importante e maricultured em grande escala no Leste Asiático, especialmente na China7. Inúmeras questões científicas sobre A. japonicus, incluindo os mecanismos regulatórios subjacentes regeneração intestinal após a evisceração8 e degeneração na aestivation9, controle metabólico10,11, e resposta imune12,13 estresses térmicos ou patogênicos, têm atraído a atenção dos pesquisadores. No entanto, em comparação com animais modelo bem estudados, a pesquisa básica, especialmente no nível celular, é limitada por gargalos técnicos, como a falta de métodos avançados de cultura celular.
Os pesquisadores têm dedicado muito esforço para estabelecer linhas celulares, mas eles também enfrentaram muitos desafios e nenhuma linha celular de qualquer invertebrado marinho foi estabelecida ainda14. No entanto, as culturas celulares primárias de invertebrados marinhos avançaram nas últimas décadas15,16,e eles proporcionaram uma oportunidade para a experimentação no nível celular. Por exemplo, a intesina regenerante de A. japonicus tem sido utilizada como uma fonte de células para culturas celulares de longo prazo que forneceu um método prático para a cultura celular primária de invertebrados marinhos17. Este protocolo combinou e otimizou abordagens da cultura de células invertebradas e desenvolveu um método de cultura primária amplamente adequado para pepino do mar ou outros invertebrados marinhos.
A poptose é um programa de suicídio de células intrínsecas desencadeado por vários estímulos exógenos e endógenos. A apoptose coordenada é crucial para muitos sistemas biológicos18,19,e tem sido implicada na regressão intestinal de pepino do mar durante a aestivation9. Para investigar o processo apoptotesco em organismos de interesse, uma série de métodos, incluindo a coloração Hoechst e ensaios microscopia, foram estabelecidos e aplicados com sucesso20. Aqui, realizamos aindução e detecção de apoptose em células intestinais primárias de pepino do mar para avaliar a usabilidade das células primárias em estudos biológicos de invertebrados marinhos. A dexametasona, um dos glicocorticosteroides sintéticos comumente usados21,foi usada para induzir apoptose em células intestinais cultivadas a partir de pepino do mar, e o sinal hoechst 33258 significativo foi detectado com sucesso nas células manchadas por microscopia fluorescente.
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Protocol
1. Preparação média da cultura celular
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Preparação de fluidocomicos
- Coleta de fluidos coelomicos: Em condições estéreis, dissecar um pepino do mar saudável (peso molhado de 85-105 g), coletar líquido coelomic, e armazená-lo em um frasco de vidro estéril.
- Remoção de células coelomicas: Centrífuga o fluido coelomicem-se em tubos de centrífuga de 50 mL a 1.700 x g por 5 min e transfira o supernatant para um novo frasco de vidro estéril; Em seguida, recolher o líquido coelomic livre de células do pepino do mar.
- Complemente a inativação de componentes: Incubar o frasco de vidro estéril, contendo o líquido coelomic o pepino do mar, em um banho de água de 40-50 °C por 20-40 min para obter fluido coelomic inativado por componentes complementares.
- Remoção de micróbios: Remover bactérias e clamídia por filtragem através de filtros de membrana de 0,22 μm. Em seguida, retire o micoplasma e outras partículas finas por filtragem usando filtros de membrana de 0,1 μm para obter solução de pré-tratamento de fluido coelomico.
- Ajuste da salinidade: Ajuste a salinidade da solução de pré-tratamento coelomico fluido para 30(medida por salinometer) adicionando 20% de alta concentração pré-esterilizada e filtrada solução NaCl (diluída por fluido coelomico pré-tratado) ou DDW (água destilada dupla). Transfira o líquido coelomic do pepino do mar em um frasco estéril, sela o frasco, e armazene o líquido em 4 °C para umas experiências mais adicionais.
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Otimização média de cultura celular L-15 de Leibovitz
- Pesar 5,05 g de NaCl, 0,135 g de KCl, 0,15 g de CaCl2, 0,25 g de Na2SO4, 0,975 g de MgCl2, 0,25 g de glicose, e 6,25 mg de taurina e diluí-los em 40 mL de L-15 de Leibovitz médio em um tubo de 50 mL estéril centeri. Agitao o tubo em um shaker por 1 h para garantir que os sais tenham dissolvido completamente.
- Adicione 2,5 mL de L-glutamina (100 mg/mL) e 500 μL da solução VE (1,75 mg/L) no l-15 médio de Leibovitz previamente preparado e filtrar ainda mais o meio através de filtros de membrana de 0,22 μm.
- Ajuste o volume médio total para 500 mL com o l-15 médio fresco de Leibovitz e com 100 mL de fluido coelomico previamente preparado; Em seguida, ajuste o pH para 7,6 usando a solução NaOH. Mantenha o processo de operação em um ambiente estéril. A relação de composição do líquido coelomic pode ser 10%-50%, e 20% é suficiente para a cultura das pilhas intestinais do japonicus de A..
2. Preparação de células intestinais
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Processamento do intestino do pepino do mar
- Anestesie pepinos saudáveis do mar em uma caixa de gelo. Dissecar e coletar os intestinos anteriores, em seguida, seção as amostras de tecido verticalmente e remover o conteúdo interno.
- Lave as amostras de tecido em soro lógico tampão de fosfato (PBS) duas vezes e desinfete-as por imersão em uma solução de etanol aquoso (75% em volume) por não mais de 2 s.
- Lave as amostras de tecido na PBS três vezes para remover etanol e transferir cerca de 100 mg de amostra de tecido em um tubo de microcentrífuga estéril de 2,0 mL.
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Coleção celular
- Adicione 1,5 mL do meio de cultura pré-otimizado ao bloco de tecido intestinal de pepino do mar e pique o bloco com tesoura cirúrgica esterilizada até que a solução esteja turva.
NOTA: Para protocolo simplificado opcional, adicione 0,5 mL de meio de cultura pré-otimizada ao bloco de tecido intestinal de pepino do mar e corte o bloco com tesoura cirúrgica esterilizada em 1 mm3. Transferir diretamente as amostras para pratos de cultura seguido sincubação subseqüentes passos. - Adicione 400 μL de trippsina (0,25%), misture a solução por inversão e incuba-a por 5 min à temperatura ambiente; então, filtre a solução usando um filtro de célula de 100 μm.
NOTA: É opcional adicionar tripsina para dispersão celular ao tratar diferentes amostras de tecido. O ácido tetraacecético (EDTA) deve ser contido na solução de tripsina para reduzir a atividade inibidora de Ca2+ e Mg2+ em meio cultural. - Colete o filtrado para um novo tubo estéril de microcentrífuga de 2,0 mL, centrífuga a 1.700 x g por 3 min, descarte o supernatant e, em seguida, resuspenda a pelota em meio de cultura (complementada com antibióticos) e lavá-la duas vezes.
NOTA: Prepare o meio de cultura pré-otimizado fresco complementado com 2% de solução penicilina-estreptomicina (10.000 u/mL penicilina e 10 mg/mL estreptomicina) e 1% gentamicina (4 mg/mL) antes do início do experimento.
- Adicione 1,5 mL do meio de cultura pré-otimizado ao bloco de tecido intestinal de pepino do mar e pique o bloco com tesoura cirúrgica esterilizada até que a solução esteja turva.
3. Cultura celular
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Predefinição da incubadora: Predefinir a incubadora para a cultura celular e executá-lo com antecedência por pelo menos 24 h com temperatura de 18 °C e umidade saturada.
NOTA: Feed CO2 na incubadora, dependendo da cultura celular propriedades médias; nenhum CO2 precisa ser fornecido ao usar o meio básico do L-15 de Leibovitz. -
Cultura celular do primeiro estágio
- Para inibir o crescimento de micróbios e promover a proliferação durante o estágio inicial da cultura celular, adicione 10 mL de solução penicilina-estreptomicina (10.000 u/mL penicilina e 10 mg/mL estreptomicina) e 0,5 mL de gentamicina (40 mg/mL) em cada 500 mL de meio de cultura pré-otimizada. Além disso, complemente cada meio de cultura de 500 mL com 0,6 mL de insulina (10 mg/mL), 100 μL de fator de crescimento semelhante à insulina (0,1 μg/μL) e 25 μL de fator de crescimento do fibroblasto (0,1 μg/μL).
- Colete as células em tubos de 1,5 mL, resuspendê-los usando 200 μL de meio indicado, e pipet-los em φ 4 cm pratos.
- Cultura as células em uma incubadora e adicionar 2,0 mL de meio indicado para a célula pratos de cultivo após 6 h. Mudar metade do meio a cada 12 h até chegar à próxima fase.
NOTA: Segure a mudança média suavemente, porque as células não estão ligadas aos pratos firmemente. Os pratos revestidos de poli-D-lisina podem ser usados para anexar vagamente as células do prato.
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Cultura celular de segunda fase
- Para reduzir os efeitos adversos dos antibióticos para as células cultivadas, reduzir a concentração de antibióticos indicados (penicilina, estreptomicina e gentamicina) na cultura média pela metade.
NOTA: O uso de insulina e fatores de crescimento depende das condições de cultura celular e é opcional. - Substituir o meio de cultura celular; conduzir mudanças médias a cada dois a três dias, dependendo da densidade celular.
NOTA: Observe as células cultivadas diariamente um microscópio e registre as condições de crescimento.
- Para reduzir os efeitos adversos dos antibióticos para as células cultivadas, reduzir a concentração de antibióticos indicados (penicilina, estreptomicina e gentamicina) na cultura média pela metade.
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Passagem celular
NOTA: Passagem e subcultura as células, quando a densidade celular primária atinge 60%.- Lave as células cultivadas duas vezes usando PBS à temperatura ambiente. Adicionar 200 μL de solução de tripsina (0,25%) para cada prato e agitam manualmente o prato garantindo que todo o fundo é coberto. Descarte a solução de trippsina e incubar as células por 5 min à temperatura ambiente.
- Lave as células com 1,0 mL de meio de cultura fresca por pipetting e resuspender as células. Transfira 0,5 mL de suspensão celular para um novo prato, adicione 1,5 mL de meio fresco e incubar as células a 18 °C.
NOTA: Raspadores de células podem ser usados para coleta de células quando a solução de tripsina não consegue digerir e separar as células dos pratos (algumas linhas celulares são muito adesivo). No entanto, não conduza ambos os métodos simultaneamente. - Mude o meio após 12 h e observe as células um microscópio para avaliar as condições. Cultura as células para ensaios experimentais.
4. Apoptose Indução e Detecção em Células Intestinais A. japonicus
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Cultura celular e tratamento de dexametasona
- Prepare as células intestinais seguindo o protocolo previamente introduzido e adicione as células dropwise a uma placa de 12 poços em um volume celular de 2 x 106 por poço.
- Após três dias na cultura, seguindo os passos da "cultura celular de primeiro estágio", lave as células três vezes com PBS e substitua o meio por meio otimizado (sem antibióticos e fatores de crescimento).
- Dexamethasone diluída (DXMS) no meio da cultura para preparar soluções frescas de 2 μM e 200 μM DXMS antes de começar as experiências.
- Adicionar soluções DXMS em diferentes concentrações às células cultivadas cultivadas com o mesmo volume de culturing médio; definir três grupos experimentais, incluindo controle (CTL), 1 μM e 100 μM DXMS.
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Mancha de Hoechst
- Lave as células com PBS três vezes após a incubação com/sem DXMS para os períodos de tempo indicados (0 h, 24 h e 48 h).
- Adicione 300 μL de Solução Hoechst 33258 por poço a uma placa de 12 poços e incubar a 18 °C por 30 minutos. Gentilmente agita a placa para cobrir todas as células garantindo sua coloração.
- Retire a solução de coloração Hoechst e corrigir as células, adicionando 300 μL de uma solução de paraformaldeído de 4% (em PBS) para cada poço. Agitar suavemente por 15 min.
CUIDADO: O paraformaldeído é moderadamente tóxico pelo contato ou inalação da pele, e é designado como um provável agente cancerígeno humano. Capas químicas de fumaça, compartimentos de equilíbrio ventilados ou outras medidas de proteção devem ser usadas durante a pesagem e manuseio do paraformaldeído. - Lave as células fixas três vezes na PBS. Não descarte o PBS após a lavagem para manter as células cobertas.
-
Análise da microscopia fluorescente
- Ligue o hardware do microscópio fluorescente, incluindo o poder da lâmpada de mercúrio, energia de luz fluorescente e PC. Faça login na conta do sistema operacional, inteça o software e verifique sua configuração.
- Coloque a placa preparada no estágio do microscópio. Posicione a amostra sobre a lente objetiva usando o controlador de palco.
- Encontre as células de interesse o microscópio de luz, mude para microscopia fluorescente e capture as imagens ajustando os parâmetros.
NOTA: Para observar o sinal fluorescente Hoechst 33258 vinculado ao DNA dos núcleos, a microscopia de fluorescência deve ser conduzida com excitação e emissão de aproximadamente 352 nm e 461 nm, respectivamente.
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Representative Results
Aqui, estabelecemos a cultura primária das células intestinais de A. japonicus e passamos as células. A Figura 1 mostra células redondas em diferentes estágios de cultivo. E os ensaios de coloração edu fornecer evidências diretas para revelar a atividade proliferativa dessas células redondas em fase posterior (Figura 2). Também ajustamos ligeiramente o protocolo, cultivando blocos de tecido picados em vez de células filtradas; além disso, um tipo de célula de fuso poderia ser cultivado com sucesso. Este tipo de célula ocorreu em torno dos blocos de tecido intestinal e pode ser observado após quatro dias de cultura; no entanto, ele não conseguiu ser passado(Figura 3).
As células cultivadas podem ser usadas para diferentes aplicações experimentais biológicas. Nós tratamos as pilhas com DXMS por períodos de tempo diferentes, seguidos pela mancha de Hoechst 33258 para a deteção apoptotic da pilha. A figura 4 indica o sinal apoptotesco induzido detectado a partir de células intestinais de pepino do mar por manchas hoechst 33258 e microscopia fluorescente. A figura 5 demonstra as taxas de células apoptoticas para períodos de tempo indicados em estimulação com DXMS.
Figura 1: Microscopia de células redondas intestinais cultivadas de pepino do mar em diferentes estágios. (A)Células presas ao fundo dos pratos no terceiro dia depois de serem semeadas. (B)Proliferação celular no sétimo dia. (C)Células presas ao fundo dos pratos após a páscoa. (D)Células que perderam a atividade e estão morrendo depois de dez passagens. "CM" indica massa celular, que ocorre durante a proliferação celular. "BT" indica a faixa preta, que foi deixada por células mortas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Proliferação celular detectada por ensaios de coloração edu. Os ensaios de proliferação celular foram realizados usando o kit(Tabela de Materiais)de acordo com o protocolo do fabricante. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Microscopia de blocos de tecido intestinal cultivados do pepino do mar e proliferação celular. (A)blocos de tecido (TB) ligados ao fundo do prato no primeiro dia após a cultura. (B) Blocos de tecidos e células ligadas ao fundo do prato no segundo dia após a cultura. (C)Blocos de tecidos e células de fuso perifericamente ocorreram (SC) no quarto dia após a cultura. (D)proliferaram células de fuso no sétimo dia após a cultura. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: Microscopia fluorescente de células redondas intestinais com apoptose induzida. "NC" indica sinal fluorescente de condensação nuclear. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 5: Análise estatística das células intestinais hoechst-positivas. Distribuição da porcentagem de células fluorescentes de condensação nuclear positivas entre as células intestinais de Hoechst manchadas de A. japonicus, juntamente com a dose ou o curso do tempo do experimento (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
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Discussion
Extensos esforços de pesquisa têm sido dedicados ao estabelecimento de linhas celulares nas últimas décadas, no entanto, ainda é difícil fazer um progresso na cultura de longo prazo das células de invertebrados marinhos14,22. Tem sido relatado que as células cultivadas de regeneração de tecidos holothurian foram viáveis por um longo período de tempo e alta atividade de proliferação pode ser detectada em células específicas17,23. No entanto, para as células invertebradas marinhas normais, ainda não há nenhuma abordagem prática de cultura celular foi descrita. O protocolo apresentado aqui fornece um método eficiente e facilmente interpretável para cultivar e passar células intestinais da espécie de invertebrado marinho A. japonicus. O método pode ser facilmente adaptado para a cultura celular primária de muitos organismos invertebrados marinhos diferentes, como chocos e caranguejo.
Uma série de fatores-chave afetam a aplicação bem-sucedida deste procedimento. A prevenção da contaminação microbiana é de extrema importância durante todo o processo e, especialmente, durante a primeira semana de cultura. Os animais aquáticos geralmente entram em contato com inúmeros micróbios do ambiente, que colonizam seus tecidos, como brânquia, intestino, barbatana e pele. Assim, será impossível esterilizar as amostras de tecido antes da iniciação da cultura celular. Para minimizar o risco de contaminação microbiana durante a cultura celular, 75% de imersão de etanol para esterilização de amostras de tecido é essencial; no entanto, o tempo de tratamento deve ser otimizado para diferentes tipos de tecido. Além disso, a aplicação de altas concentrações de antibióticos durante os estágios iniciais da cultura celular também desempenha um papel importante na inibição do crescimento microbiano. Além disso, a formulação média é um fator importante determinando a proliferação e a vida útil das células cultivadas. Uma vez que as necessidades nutricionais das células marinhas de invertebrados ainda são desconhecidas, o meio de cultura celular atual utilizado foram projetados principalmente para linhas de vértebras ou células de insetos14. Para fornecer materiais nutricionais suficientes, o líquido coelomico pré-tratado dos pepinos do mar pode ser usado semelhante ao FBS na cultura das células de mamíferos. Enquanto isso, para facilitar a proliferação celular, vários fatores de crescimento de mamíferos também podem ser aplicados no meio da cultura. Como a temperatura da incubação é um fator que afeta o sucesso da cultura de células invertebradas marinhas, deve ser considerada a incubação de células a temperatura ideal de crescimento do organismo-alvo. Por exemplo, a temperatura para a cultura celular de A. japonicus pode ser fixada em 18 °C, o que é adequado para seu crescimento24.
O pré-tratamento tissue pode afetar os tipos de células cultivadas e proliferantes com sucesso. Células intestinais a. japonicus muito diferentes, redondas ou fuso, podem ser obtidas a partir da semeadura de células filtradas ou blocos de tecidos o procedimento de cultura exatamente o mesmo (dados comparativos da Figura 1 e Figura 3). Assim, a otimização do método de pré-tratamento do tecido para o tipo específico de cultura celular também deve ser realizada no início; o procedimento ideal deve ser decidido de acordo com o projeto experimental biológico.
Aqui, aplicamos o tratamento DXMS para indução de apoptose em células intestinais a. japonicus após três dias na cultura, e realizamos a coloração de Hoechst para detecção de sinal apoptotesco. A detecção bem-sucedida de células positivas hoechst, após a estimulação de 48 h por 1 μM DXMS, forneceu um exemplo prático para um experimento biológico baseado nas células cultivadas.
O protocolo descrito é fácil de manusear e pode ser usado para estabelecer uma cultura de células invertebradas marinhas. As pilhas cultivadas devem fornecer o material biológico o fundo genético consistente para aplicações experimentais biológicas mais adicionais diferentes. Além disso, os procedimentos de protocolo ligeiramente ajustados podem alterar os tipos de células que proliferam com sucesso durante a cultura e fornecer diferentes materiais celulares para experimentos biológicos. Assim, a otimização de certas etapas do protocolo será necessária, dependendo das espécies animais alvo e dos tipos específicos de células necessários.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Prof. Naiming Zhou da Universidade de Zhejiang por seu conselho técnico e por disponibilizar o equipamento de seu laboratório para uso. Este trabalho foi apoiado financeiramente pela National Natural Science Foundation of China (números de subvenção 41876154, 41606150 e 41406137) e os Fundos fundamentais de pesquisa para universidades e institutos de pesquisa provinciais de Zhejiang [número de subvenção 2019JZ00007 ].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 μm filter | Millipore | SLVV033RS | |
| 0.22 μm filter | Millipore | SLGP033RB | |
| 0.25% Trypsin | Genom | GNM25200 | |
| 100 μm filter | Falcon | 352360 | |
| 4 cm dishes | ExCell Bio | CS016-0124 | |
| 4% paraformaldehyde solution | Sinopharm Chemical Reagent | 80096618 | in PBS |
| Benchtop Centrifuges | Beckman | Allegra X-30R | |
| BeyoClick EdU-488 kit | Beyotime | C0071S | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | 10005817 | |
| Constant temperature incubator | Lucky Riptile | HN-3 | |
| Dexamethasone | Sinopharm Chemical Reagent | XW00500221 | |
| Electric thermostatic water bath | senxin17 | DK-S28 | |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 80176961 | 75% |
| Fibroblast Growth Factor(FGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Fluorescent microscope | Leica DMI3000B | DMI3000B | |
| Garamycin | Sinopharm Chemical Reagent | XW14054101 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent | 63005518 | |
| Hoechst33258 Staining solution | Beyotime | C1017 | |
| Insulin | Sinopharm Chemical Reagent | XW1106168001 | |
| Insulin like Growth Factor(IGF) | PEPROTECH | 100-11 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10016308 | |
| Leibovitz's L-15 | Genom | GNM41300 | |
| L-glutamine (100 mg/mL) | Genom | GNM-21051 | |
| MgCl2 | Sinopharm Chemical Reagent | XW77863031 | |
| Na2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10020518 | |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent | 10019718 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | pH7.2-7.4 |
| Penicillin-Streptomycin | Genom | GNM15140 | |
| PH meter | Bante | A120 | |
| Taurine | SIGMA | T0625 | |
| VE | Seebio | 185791 |
References
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