Een herziene methode voor het induceren van secundair lymfoedeem in het achterlijf van muizen
Summary
Dit diermodel stelt onderzoekers in staat om statistisch significant secundair lymfoedeem in het achterlijf van muizen te induceren, met een minimumduur van 8 weken. Het model kan worden gebruikt om de pathofysiologie van lymfoedeem te bestuderen en nieuwe behandelingsopties te onderzoeken.
Abstract
Diermodellen zijn van het allergrootste belang bij het onderzoek naar lymfoedeem om de pathofysiologie van de ziekte te begrijpen, maar ook om mogelijke behandelingsopties te onderzoeken. Dit muismodel stelt onderzoekers in staat om significant lymfoedeem te induceren dat ten minste 8 weken duurt. Lymfoedeem wordt geïnduceerd met behulp van een combinatie van gefractioneerde radiotherapie en chirurgische ablatie van lymfe bewegingen. Dit model vereist dat de muizen een dosis van 10 grijze (Gy) straling krijgen voor en na de operatie. Het chirurgische deel van het model omvat de ligatie van drie lymfevaten en de extractie van twee lymfeklieren van de muis-hindledemaat. Toegang hebben tot microchirurgische gereedschappen en een microscoop is essentieel, vanwege de kleine anatomische structuren van muizen. Het voordeel van dit model is dat het resulteert in statistisch significant lymfoedeem, wat een goede basis vormt voor het evalueren van verschillende behandelingsopties. Het is ook een geweldige en gemakkelijk beschikbare optie voor microchirurgische training. De beperking van dit model is dat de procedure tijdrovend kan zijn, vooral als niet van tevoren beoefend. Het model resulteert in objectief kwantificeerbaar lymfoedeem bij muizen, zonder ernstige morbiditeit te veroorzaken en is getest in drie afzonderlijke projecten.
Introduction
Lymfoedeem wordt gekenmerkt door een ophoping van lymfe vloeistof die leidt tot gelokaliseerde zwelling van het weefsel, die voornamelijk optreedt als gevolg van een verstoorde of verstoorde stroom van lymfe vloeistof in de lymfevaten1. De lymfestroom kan worden aangetast of verstoord door infectie, obstructie, letsel of aangeboren defecten in het lymfatische systeem2. Deze etiologieën resulteren in accumulatie van lymfatische vloeistof, wat leidt tot een chronische toestand van ontsteking, wat resulteert in latere fibrose, evenals de afzetting van vetweefsel3. Lymfoedeem kan worden gecategoriseerd als primair of secundair lymfoedeem. Primair lymfoedeem wordt veroorzaakt door ontwikkelingsafwijkingen of genetische mutatie2,4. Secundair lymfoedeem treedt op als gevolg van onderliggende systemische ziekte, chirurgie of trauma2,4. Secundair lymfoedeem is de meest voorkomende vorm van lymfoedeem in de wereld2. In ontwikkelde landen is de meest voorkomende oorzaak van secundair lymfoedeem oncologische therapie zoals adjuvante radiotherapie en lymfeklier dissectie5. Lymfoedeem komt het vaakst voor bij borstkankerpatiënten, maar kan zich ook ontwikkelen bij patiënten met gynaecologische, melanoom, urogenitaal of nekkanker6. Er is gesuggereerd dat van alle vrouwen gediagnosticeerd met borstkanker, 21% lymfoedeem zal ontwikkelen7.
Lymfoedeem kan zowel lichamelijk als psychologisch stressvol zijn voor de patiënt. Patiënten met lymfoedeem hebben een verhoogd risico op infectie5,8,9, slechte kwaliteit van leven en kunnen sociale angst en symptomen van depressie10ontwikkelen. De complicaties van chronisch lymfoedeem leiden tot hoge kosten van zorg en een verhoogde ziektelast9,11. De bevindingen hebben ook gesuggereerd dat lymfoedeem gepaard zou kunnen worden gebracht met een verhoogd risico op overlijden na behandeling van borstkanker12. Conservatief beheer zoals compressie van het getroffen gebied, handmatige lymfedrainage en algemene huidverzorging blijven de eerste lijn benadering. Er is momenteel geen curatieve behandeling6. Hoewel er vooruitgang is geboekt op het gebied van chirurgische en medische therapie, is er nog ruimte voor verbetering. Meer onderzoek, het verstrekken van inzicht in de pathofysiologie en progressie van de ziekte, is nodig om clinici in staat te stellen betere behandelingsopties te bieden voor de patiënten5.
Diermodellen worden in preklinisch onderzoek gebruikt om de pathofysiologie van ziekten te begrijpen en mogelijke behandelingsopties te ontwikkelen. Verschillende lymfoedeem-diermodellen zijn vastgesteld in de kannen13,14, konijnen15, schapen16, varkens17,18 en knaagdieren19,20, 21,22,23,24. Het knaagdier-model lijkt het meest kosteneffectieve model te zijn bij het onderzoeken van de reconstructie van de lymfatische functie, omdat knaagdieren gemakkelijk toegankelijk zijn en relatief laag geprijsd25. De meeste muizen modellen hebben zich geconcentreerd op het induceren van lymfoedeem in de staart van de muizen21,22,23. Het staart model is zeer betrouwbaar, maar de precieze chirurgische techniek voor het induceren van lymfoedeem varieert aanzienlijk in eerder gepubliceerd materiaal. Dit resulteert in schommelingen in de duur en robuustheid van het ontwikkelde lymfoedeem, gepresenteerd in de bekende litteratuur25. Er worden ook verschillende technieken gebruikt voor het induceren van lymfoedeem in het achterledemaat en ze leveren ook wisselende resultaten op, maar het achterlijf model kan vanuit een translationeel perspectief gemakkelijker te begrijpen zijn. Eerdere lymfoedeem-modellen zijn belemmerd door spontane lymfoedeem-resolutie en daarom is een reproduceerbaar en permanent lymfoedeem-model nodig25. Onderzoekers hebben eerder geprobeerd om de dosis van straling te verhogen, om de spontane lymfoedeem resolutie te voorkomen, maar dit heeft vaak geleid tot daaropvolgende ernstige morbiditeit25.
Dit model resulteert in statistisch significant lymfoedeem, zonder ernstige morbiditeit te veroorzaken, door microchirurgie met straling te combineren. Het model is gewijzigd van een eerder chirurgisch model door een dosis bestraling toe te voegen die lymfoedeem induceert, zonder ernstige morbiditeit26te veroorzaken. Het biedt ook een geweldige kans voor microchirurgische training. Toegang hebben tot microchirurgische apparatuur en een microscoop is noodzakelijk, vanwege de kleine anatomische structuren van de muizen. De chirurgische ingreep kan worden uitgevoerd wanneer de gebruiker basis microchirurgische technieken heeft geleerd, zoals het hechten met microchirurgische instrumenten. De operators die deze procedure uitgevoerd alle keek instructievideo’s door Acland op de voorwaarden van microchirurgische vaardigheden (1981) en basis microsuture techniek (1985). We raden aan om de chirurgische ingreep 8 − 10 keer te beoefenen voordat u deze in onderzoek gebruikt. Het beoefenen van de procedure zorgt ervoor dat er minder fouten worden gemaakt en dat de procedure efficiënter kan worden uitgevoerd. Wanneer onder de knie, de chirurgische ingreep kan worden uitgevoerd in 45 minuten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn enkele kritieke stappen in dit protocol. Ten eerste is het belangrijk dat de onderzoekers veiligheidsmaatregelen nemen bij het werken met radioactiviteit. Ten tweede, tijdens het chirurgische deel van dit protocol, is het belangrijk om de procedure te starten zodra de muis is verdoiliseerd en eindig zonder onnodige pauzes. Dit is belangrijk om te voorkomen dat een buitensporig lange chirurgische periode voor het dier en om te voorkomen dat de anesthesie verliest effect tijdens de operatie. Het wordt aanbevolen om…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Peter bollen, hoofd van het Biomedische Laboratorium voor het lenen van de apparatuur die nodig is om de beelden te registreren die door de microscopen worden gezien.
Materials
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture – Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator – ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad – PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer – PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder – Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V – 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors – Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation – D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic – 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment – viscotears | Bausch & Lomb |
References
- Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).
- Greene, A. K., Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. Epidemiology and morbidity of lymphedema. Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. , 33-44 (2015).
- Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. J. Pathophysiology of lymphedema-Is there a chance for medication treatment?. Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 96-98 (2017).
- Grada, A. A., Phillips, T. J. Lymphedema: Pathophysiology and clinical manifestations. Journal of the American Academy of Dermatology. 77 (6), 1009-1020 (2017).
- Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 209S-218S (2016).
- Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
- DiSipio, T., Rye, S., Newman, B., Hayes, S. Incidence of unilateral arm lymphoedema after breast cancer: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 14 (6), 500-515 (2013).
- Douglass, J., Graves, P., Gordon, S. Self-Care for Management of Secondary Lymphedema: A Systematic Review. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004740 (2016).
- Shih, Y. C. T., et al. Incidence, treatment costs, and complications of lymphedema after breast cancer among women of working age: a 2-year follow-up study. Journal of Clinical Oncology. 27 (12), 2007-2014 (2009).
- Ridner, S. H. The psycho-social impact of lymphedema. Lymphatic Research and Biology. 7 (2), 109-112 (2009).
- Gutknecht, M., et al. Cost-of-illness of patients with lymphoedema. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 31 (11), 1930-1935 (2017).
- Hayes, S., et al. Prevalence and prognostic significance of secondary lymphedema following breast cancer. Lymphatic Research and Biology. 9 (3), 135-141 (2011).
- Danese, C. A., Georgalas-Bertakis, M., Morales, L. E. A model of chronic postsurgical lymphedema in dogs’ limbs. Surgery. 64 (4), 814-820 (1968).
- Das, S. K., Franklin, J. D., O’Brien, B. M., Morrison, W. A. A practical model of secondary lymphedema in dogs. Plastic and Reconstructive Surgery. 68 (3), 422-428 (1981).
- Huang, G. K., Hsin, Y. P. An experimental model for lymphedema in rabbit ear. Microsurgery. 4 (4), 236-242 (1983).
- Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
- Lahteenvuo, M., et al. Growth factor therapy and autologous lymph node transfer in lymphedema. Circulation. 123 (6), 613-620 (2011).
- Honkonen, K. M., et al. Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema. Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).
- Wang, G. Y., Zhong, S. Z. A model of experimental lymphedema in rats’ limbs. Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).
- Oashi, K., et al. A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report. Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).
- Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
- Cheung, L., et al. An experimental model for the study of lymphedema and its response to therapeutic lymphangiogenesis. BioDrugs : Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy. 20 (6), 363-370 (2006).
- Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
- Tammela, T., et al. Therapeutic differentiation and maturation of lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation. Nature Medicine. 13 (12), 1458-1466 (2007).
- Frueh, F. S., et al. Animal models in surgical lymphedema research–a systematic review. Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).
- Jorgensen, M. G., et al. Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model. Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).
- Frueh, F. S., et al. High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb. Scientific Reports. 6, 34673 (2016).
- Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).
- Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage. Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).
- Komatsu, E., et al. Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model. Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).
