Summary
Dit diermodel stelt onderzoekers in staat om statistisch significant secundair lymfoedeem in het achterlijf van muizen te induceren, met een minimumduur van 8 weken. Het model kan worden gebruikt om de pathofysiologie van lymfoedeem te bestuderen en nieuwe behandelingsopties te onderzoeken.
Abstract
Diermodellen zijn van het allergrootste belang bij het onderzoek naar lymfoedeem om de pathofysiologie van de ziekte te begrijpen, maar ook om mogelijke behandelingsopties te onderzoeken. Dit muismodel stelt onderzoekers in staat om significant lymfoedeem te induceren dat ten minste 8 weken duurt. Lymfoedeem wordt geïnduceerd met behulp van een combinatie van gefractioneerde radiotherapie en chirurgische ablatie van lymfe bewegingen. Dit model vereist dat de muizen een dosis van 10 grijze (Gy) straling krijgen voor en na de operatie. Het chirurgische deel van het model omvat de ligatie van drie lymfevaten en de extractie van twee lymfeklieren van de muis-hindledemaat. Toegang hebben tot microchirurgische gereedschappen en een microscoop is essentieel, vanwege de kleine anatomische structuren van muizen. Het voordeel van dit model is dat het resulteert in statistisch significant lymfoedeem, wat een goede basis vormt voor het evalueren van verschillende behandelingsopties. Het is ook een geweldige en gemakkelijk beschikbare optie voor microchirurgische training. De beperking van dit model is dat de procedure tijdrovend kan zijn, vooral als niet van tevoren beoefend. Het model resulteert in objectief kwantificeerbaar lymfoedeem bij muizen, zonder ernstige morbiditeit te veroorzaken en is getest in drie afzonderlijke projecten.
Introduction
Lymfoedeem wordt gekenmerkt door een ophoping van lymfe vloeistof die leidt tot gelokaliseerde zwelling van het weefsel, die voornamelijk optreedt als gevolg van een verstoorde of verstoorde stroom van lymfe vloeistof in de lymfevaten1. De lymfestroom kan worden aangetast of verstoord door infectie, obstructie, letsel of aangeboren defecten in het lymfatische systeem2. Deze etiologieën resulteren in accumulatie van lymfatische vloeistof, wat leidt tot een chronische toestand van ontsteking, wat resulteert in latere fibrose, evenals de afzetting van vetweefsel3. Lymfoedeem kan worden gecategoriseerd als primair of secundair lymfoedeem. Primair lymfoedeem wordt veroorzaakt door ontwikkelingsafwijkingen of genetische mutatie2,4. Secundair lymfoedeem treedt op als gevolg van onderliggende systemische ziekte, chirurgie of trauma2,4. Secundair lymfoedeem is de meest voorkomende vorm van lymfoedeem in de wereld2. In ontwikkelde landen is de meest voorkomende oorzaak van secundair lymfoedeem oncologische therapie zoals adjuvante radiotherapie en lymfeklier dissectie5. Lymfoedeem komt het vaakst voor bij borstkankerpatiënten, maar kan zich ook ontwikkelen bij patiënten met gynaecologische, melanoom, urogenitaal of nekkanker6. Er is gesuggereerd dat van alle vrouwen gediagnosticeerd met borstkanker, 21% lymfoedeem zal ontwikkelen7.
Lymfoedeem kan zowel lichamelijk als psychologisch stressvol zijn voor de patiënt. Patiënten met lymfoedeem hebben een verhoogd risico op infectie5,8,9, slechte kwaliteit van leven en kunnen sociale angst en symptomen van depressie10ontwikkelen. De complicaties van chronisch lymfoedeem leiden tot hoge kosten van zorg en een verhoogde ziektelast9,11. De bevindingen hebben ook gesuggereerd dat lymfoedeem gepaard zou kunnen worden gebracht met een verhoogd risico op overlijden na behandeling van borstkanker12. Conservatief beheer zoals compressie van het getroffen gebied, handmatige lymfedrainage en algemene huidverzorging blijven de eerste lijn benadering. Er is momenteel geen curatieve behandeling6. Hoewel er vooruitgang is geboekt op het gebied van chirurgische en medische therapie, is er nog ruimte voor verbetering. Meer onderzoek, het verstrekken van inzicht in de pathofysiologie en progressie van de ziekte, is nodig om clinici in staat te stellen betere behandelingsopties te bieden voor de patiënten5.
Diermodellen worden in preklinisch onderzoek gebruikt om de pathofysiologie van ziekten te begrijpen en mogelijke behandelingsopties te ontwikkelen. Verschillende lymfoedeem-diermodellen zijn vastgesteld in de kannen13,14, konijnen15, schapen16, varkens17,18 en knaagdieren19,20, 21,22,23,24. Het knaagdier-model lijkt het meest kosteneffectieve model te zijn bij het onderzoeken van de reconstructie van de lymfatische functie, omdat knaagdieren gemakkelijk toegankelijk zijn en relatief laag geprijsd25. De meeste muizen modellen hebben zich geconcentreerd op het induceren van lymfoedeem in de staart van de muizen21,22,23. Het staart model is zeer betrouwbaar, maar de precieze chirurgische techniek voor het induceren van lymfoedeem varieert aanzienlijk in eerder gepubliceerd materiaal. Dit resulteert in schommelingen in de duur en robuustheid van het ontwikkelde lymfoedeem, gepresenteerd in de bekende litteratuur25. Er worden ook verschillende technieken gebruikt voor het induceren van lymfoedeem in het achterledemaat en ze leveren ook wisselende resultaten op, maar het achterlijf model kan vanuit een translationeel perspectief gemakkelijker te begrijpen zijn. Eerdere lymfoedeem-modellen zijn belemmerd door spontane lymfoedeem-resolutie en daarom is een reproduceerbaar en permanent lymfoedeem-model nodig25. Onderzoekers hebben eerder geprobeerd om de dosis van straling te verhogen, om de spontane lymfoedeem resolutie te voorkomen, maar dit heeft vaak geleid tot daaropvolgende ernstige morbiditeit25.
Dit model resulteert in statistisch significant lymfoedeem, zonder ernstige morbiditeit te veroorzaken, door microchirurgie met straling te combineren. Het model is gewijzigd van een eerder chirurgisch model door een dosis bestraling toe te voegen die lymfoedeem induceert, zonder ernstige morbiditeit26te veroorzaken. Het biedt ook een geweldige kans voor microchirurgische training. Toegang hebben tot microchirurgische apparatuur en een microscoop is noodzakelijk, vanwege de kleine anatomische structuren van de muizen. De chirurgische ingreep kan worden uitgevoerd wanneer de gebruiker basis microchirurgische technieken heeft geleerd, zoals het hechten met microchirurgische instrumenten. De operators die deze procedure uitgevoerd alle keek instructievideo's door Acland op de voorwaarden van microchirurgische vaardigheden (1981) en basis microsuture techniek (1985). We raden aan om de chirurgische ingreep 8 − 10 keer te beoefenen voordat u deze in onderzoek gebruikt. Het beoefenen van de procedure zorgt ervoor dat er minder fouten worden gemaakt en dat de procedure efficiënter kan worden uitgevoerd. Wanneer onder de knie, de chirurgische ingreep kan worden uitgevoerd in 45 minuten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieren werden ondergebracht in de Dierenverzorgings faciliteit van de Universiteit van Zuid-Denemarken volgens de institutionele richtlijnen. Alle procedures waarbij dierproef personen zijn betrokken, zijn goedgekeurd door de Keuringsdienst voor dierproeven, ministerie van milieu en voedsel van Denemarken.
1. bestraling vóór de operatie
Opmerking: de bestraling van pre-chirurgie vindt plaats 7 dagen voor de operatie.
- Induceren van anesthesie.
- Plaats de muis in een inductie doos en stel de vaporizer in op 3% Isofluraan met een zuurstof debiet van 0,8 − 1,2 L/min om inhalatie anesthesie te induceren.
Opmerking: als alternatief, injecteerbare anesthetica kan worden gebruikt, maar voor de korte duur van de bestraling inducerende inhalatie anesthesie was voldoende. Voor het verkrijgen van de in dit artikel gepresenteerde resultaten, werden 9 weken oude vrouwelijke C57BL6 muizen gebruikt. - Zorg ervoor dat de muis volledig verdoofd door staart of paw pinch test.
- Plaats de muis in een inductie doos en stel de vaporizer in op 3% Isofluraan met een zuurstof debiet van 0,8 − 1,2 L/min om inhalatie anesthesie te induceren.
- Plaats de muis voor bestraling.
- Als volledig verdoofd, beweeg de muis van de inductie doos en plaats deze onder de bron van straling in rugligging en voorzichtig fixeren de achterpoten met tape.
NB: de muis blijft verdoofd voor de korte duur van de straling. - Plaats een 1,5 mm dik lood kussen om ervoor te zorgen dat alleen het gebied dat ondergaat chirurgie (d.w.z. het cirkelvormig gebied met een diameter van 25 mm rond de knie) wordt bestraald.
- Als volledig verdoofd, beweeg de muis van de inductie doos en plaats deze onder de bron van straling in rugligging en voorzichtig fixeren de achterpoten met tape.
- Dien een dosis van 10 GY-straling toe met een dosis snelheid van 5,11 Gy/min (100 kVp, 10 mA).
Let op: veiligheidsmaatregelen moeten worden genomen bij het werken met straling. Tijdens dit experiment werd alle bestraling uitgevoerd in een stralings geïsoleerde ruimte en werd de stralingsbron pas ingeschakeld als alle medewerkers de kamer hadden verlaten en verzegeld. - Plaats de muis terug in de kooi.
2. installatie van de apparatuur
Opmerking: chirurgie moet worden uitgevoerd in een ruimte gewijd aan chirurgische ingrepen. Het operatieve oppervlak moet steriel zijn.
- Reinig alle operatieve oppervlakken grondig met 70% ethanol. Draag smoothing en coveralls. Gebruik steriele chirurgische instrumenten en steriele handschoenen.
- Anesthesie voorbereiden.
- Teken 1 mL fentanyl (0,315 mg/mL), 1 mL midazolam (5 mg/mL) en 2 mL steriel water. Gebruik verschillende spuiten en naalden voor de verschillende componenten.
- Meng fentanyl en steriel water door de spuiten langzaam in een steriele glazen buis te legen. Wanneer gemengd, voeg midazolam om de werkoplossing te voltooien.
- Bereiden van analgesie.
- Trek 0,2 mL buprenorfine (0,3 mg/mL) en 2 mL zoutoplossing op.
- Meng de volumes door de spuiten langzaam in een steriele glazen buis te legen om de werkoplossing te voltooien.
- Zet de Microscoop aan en zorg dat de verlichting voldoende is en dat de Microscoop goed is afgesteld voor de ogen van de machinist.
Opmerking: alle chirurgische ingrepen moeten worden uitgevoerd onder een operatiemicroscoop. Een vergrotingsbereik van 4x − 25x volstaat.
3. voorbereiding
- Weeg de voor chirurgie van de muis door de muis in een lege container op een gewiste schaal te plaatsen.
- Anestheticum toedienen.
- Trek 0,1 mL anestheticum per 10 g lichaamsgewicht van de muis op. Injecteer het anestheticum subcutaan als een bolusinjectie.
- Laat de muis in een kooi rusten met voldoende beddengoed en onderdak gedurende ongeveer 10 minuten tot volledig verdoofd. Onderzoek de verdoving diepte door het beoordelen van spierontspanning en het uitvoeren van paw of staart knijpen test.
- Wanneer volledig verdoofd, scheren de achterpoot gekozen voor de procedure met behulp van elektrische Clippers. Zorg ervoor dat u overtollig haar afveegt.
- Zet het verwarmingsapparaat, zoals een verwarmingskussen, aan en dek het af met een chirurgische doek.
- Stel de stroom van zuurstof in op 0,8 L/min en verbind deze met een nosecone. Gebruik 100% zuurstof.
Opmerking: de neuskegel is alleen voor zuurstoftoevoer en niet anesthesie. - Breng oogheelkundige zalf en Injecteer 0,5 ml zoutoplossing subcutaan, bij voorkeur in de Scruff van de muis, om hypovolemie te voorkomen tijdens de operatie.
- Plaats de muis voor een operatie.
- Plaats de muis op de chirurgische doek in liggende positie. Plaats de neuskegel over de snuit.
- Fixeren het uiteinde van de achterpoten zachtjes met tape om te voorkomen dat de muis verschuift tijdens de operatie.
- Steriliseren de huid met behulp van alcohol/chloorhexidine of alcohol/Povidon jodium.
4. chirurgie
Notes: in dit voorbeeld is de linker achterledemaat (wanneer de muis in liggende positie wordt weergegeven) gekozen voor de procedure.
- Maak een cirkelvormige incisie.
- Til de huid met gladde Tang en knip een kleine opening ongeveer 5 mm proximale naar de popliteale Fossa.
- Schuif de scherpe schaar in de opening en clip naar de knie zodat de incisie net boven de knie eindigt. Zorg ervoor dat u de onderliggende vaten niet doorprikken door de huid met een tang te tillen tijdens het knippen.
- Beweeg de muis naar de liggende positie en blijf vanaf de knie naar de popliteale Fossa clippen totdat de omtrek incisie is voltooid.
- Ontleden de huid onder de knie.
- Voorzichtig botte ontleden het gebied onder de knie tot een paar millimeter boven de enkel, door het langzaam openen en sluiten van de micro schaar terwijl het optillen van de huid met Tang.
- Zorgvuldig Knip de resterende zichtbare verklevingen met behulp van micro schaar. Gebruik regelmatig een steriele zoutoplossing om het weefsel vochtig te houden gedurende de hele procedure.
- Ontleden de huid aan de proximale rand van de omtrek incisie zodat deze kan worden teruggetrokken met een elastische oprolmechanisme.
Opmerking: het oprolmechanisme geeft de machinist een beter zicht op het proximale lymfe vat en voorkomt dat de proximale velg verschuift tijdens de operatie. - Terwijl nog steeds in de liggende positie, draai de achterpoot zachtjes en fixeer het met tape, zodat de ischiatische ader zichtbaar is vanaf het meest proximale punt van het blootgestelde gebied tot het meest distale punt.
- Injecteer ongeveer 0,01 mL patent Blue V subcutaan tussen de tweede en derde teen met behulp van een Injectieflacon van 0,5 mL met een 30 G naald. Druk een paar keer zachtjes op de poot om het patent Blue V. Visualiseer de lymfevaten en lymfeklieren door de Microscoop terwijl het patent Blue V de lymfevaten vult.
Opmerking: als de blauwe kleur van de lymfevaten vervaagt tijdens de procedure, masseer dan zachtjes het poot werk om de opname te bevorderen, in plaats van meer patent Blue V te injecteren. overmatig gebruik van patent Blue V kan leiden tot lekkage en kleuring van het weefsel rond de lymfevaten die kunnen de procedure te compromitteren. - Zoek de belangrijke structuren: de popliteale lymfeklier (PLN), de twee lymfevaten distale naar de lymfeklier (DLV1 en DLV2), en het ene lymfe vat proximale naar de lymfeklier (PLV).
NB: alle lymfevaten bevinden zich naast de ischiatische ader. Het proximale lymfe vat wordt meestal mediaal in de ader aangetroffen, de twee distale lymfevaten worden mediaal en lateraal aan de ader aangetroffen. De afkortingen van de structuren worden gebruikt in de begeleidende video. - Vergrootglas om de PLV duidelijk te visualiseren en te ligeren met een 10-0 nylon hechtmiddel met micro-naald houder en microforceps. Druk een paar keer op de poot om ervoor te zorgen dat geen patent Blue V proximale aan de hecht passeert.
Opmerking: het kan nodig zijn om het vet rond de lymfevaten te trimmen. - Herhaal stap 4,7 om de twee distale lymfevaten te ligeren. Druk meerdere malen op de poot om er zeker van te zijn dat geen patent blauwe V proximale passeert aan de ligatuur. Als de lymfevaten in de buurt van de ischiatische ader liggen, probeer dan nog verder te distilleren.
Opmerking: in dit voorbeeld kan worden gezien dat een van de lymfevaten uitbarst als gevolg van de ligatuur die de lymfestroom belemmert. De lymfevaten zullen vaak verder van de ader afsplitsen. - Verwijder de lymfeklier van de popliteale.
- Lokaliseer de lymfeklier van de popliteale en knip een klein gaatje met een micro schaar om er toegang tot te krijgen en verwijder het met microforceps en micro schaar.
Opmerking: de lymfeklier heeft een glad parelachtig oppervlak in tegenstelling tot het omringende vetweefsel. - Om te testen of het verwijderde weefsel een lymfeklier is, plaatst u het in een reageerbuis gevuld met water.
Opmerking: als het weefsel bestaat uit vet, het weefsel zal drijven. Als het weefsel een lymfeklier is, zal het naar de bodem zinken.
- Lokaliseer de lymfeklier van de popliteale en knip een klein gaatje met een micro schaar om er toegang tot te krijgen en verwijder het met microforceps en micro schaar.
- Verwijder de inguinale vetpad en lymfeklier.
- Voordat u het inguinale vetpad verwijdert, moet u een bipolaire coagulator gebruiken om de vaten die door het vet lopen te cauteriseren.
- Resect de inguinale Fat pad met behulp van microforceps en micro schaar. Knip de in het vet lopende, door de vetten uitgevoerde, zachtjes. Vervolgens voorzichtig het vetweefsel in het inguinale gebied opnieuw.
Opmerking: de lymfeklier die zich in het vet bevindt, wordt zelden gekleurd door Patent Blue V en kan moeilijk te onderscheiden zijn van het vet. Het verwijderen van het vetpad in één stuk is de beste manier om ervoor te zorgen dat de lymfeklier is verwijderd.
- Spoel het been grondig af met een steriele zoutoplossing en Bevestig door de Microscoop dat kleine haren en deeltjes grondig zijn verwijderd uit het chirurgische gebied om wond besmetting en infectie te voorkomen. Zorg ervoor dat er geen actieve bloeding is.
- Hecht de huid randen aan de spier dashboard met een 6-0 nylon hechtdraad met behulp van een tang en naald houder, waardoor een spleet van 2 − 3 mm wordt gebruikt om de oppervlakkige lymfe stroming te beperken.
Opmerking: de begeleidende video toont een voorbeeld van afgewerkte hechtingen. - Toedienen van analgesie. Trek 0,1 mL analgesie op per 30 g lichaamsgewicht van de muis. Injecteer de analgesie subcutaan als een bolusinjectie.
- Weeg de muis voor een vergelijking na de operatie.
- Plaats de muis in een kooi in een kast die wordt verwarmd voor herstel.
5. postoperatieve zorg
- Geef de muizen individuele kooien om te herstellen na een operatie met water en voedsel ad libitum.
- Dien een subcutane bolus dosis van 0,02 mL buprenorfine 3x per dag toe gedurende 3 dagen voor analgesie.
- Bewaak het dier dagelijks voor passende wondgenezing, verschijnselen van pijn en infectie. Als er tekenen van infectie aanwezig zijn, gebruik dan antibioticum zalf.
6. bestraling na de operatie
- Drie dagen na de operatie herhaalt u de procedure voor bestraling vóór de operatie (stappen 1.1 − 1.4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze procedure is eerder gebruikt in drie afzonderlijke experimenten. Alle experimenten zijn gemaakt door verschillende lead onderzoekers die allemaal co-auteurs zijn van dit artikel. In alle drie experimenten werd grote zorgvuldigheid in acht genomen om te voldoen aan dezelfde procedure als beschreven in dit protocol. In alle drie de experimenten werd secundair lymfoedeem geïnduceerd in één achterledemaat, terwijl de andere achterledemaat als een controle diende. De volumes van de achterbenen waren de belangrijkste uitkomst in alle drie de experimenten. Figuur 1 illustreert het studie ontwerp.
Alle muizen ondergingen micro-computertomografie (μCT) scans in de weken na de operatie om het volume van de achterbenen te meten. De μCT scans werden uitgevoerd op een multimodaliteit pre-klinische scanner (tabel van de materialen) en het volume van de achterpoten werd gemeten via de functie van de regio van belang (ROI) in de bijbehorende software zoals eerder beschreven26. Het distale tibiofibulaire gewricht was gelegen in driedimensionale (3D) axonale beelden met behulp van een eerder beschreven methode27. De ROI begon bij het distale tibiofibulaire gewricht en omvatte alle weefsel distale op dat punt. Het Hounsfield-gamma voor de analyse werd ingesteld op-500 tot 4000.
Alle gegevens werden geanalyseerd met behulp van statistische software (tabel met materialen). De meervoudige vergelijkingstest van sidak werd gebruikt om het volume van het geïnduceerde lymfoedeem hindledemaat te vergelijken met de controle achterledemaat. Een significant verschil tussen de achterledematen en het lymfoedeem hindledemaat wordt gedefinieerd als een P-waarde < 0,05.
Figuur 1: studie ontwerp en tijdspunten voor uitkomst metingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Experiment 126 inclusief 32 muizen verdeeld in groepen van vier. Een van de doelstellingen was het bestuderen van verschillende stralingsdoses en het vinden van de meest voorkeur dosis, voor het induceren van blijvend lymfoedeem zonder ernstige morbiditeit te veroorzaken. De groep die twee doses van 10 GY bestraling kreeg, bevatte vier muizen. Figuur 2 toont aan dat in alle 8 weken een consistente toestand van lymfoedeem werd bereikt. Tabel 1 geeft aan dat er een significant verschil in volume was tussen het lymfoedeem hindledemaat en de controle achterledemaat in weken 1, 7 en 8. Terwijl een consistente toestand van geïnduceerde lymfoedeem werd bereikt, was er gedurende alle 8 weken geen statistisch significant verschil tussen de achterpoten. Dit resultaat verschilt van de twee andere experimenten en kan worden verklaard als gevolg van de relatief kleinere steekproefgrootte van vier muizen. Het verhogen van het aantal metingen zou de kracht van het onderzoek vergroten en hierbij de waarschijnlijkheid van het opsporen van een verschil als er een verschil bestaat28.
Figuur 2: gemiddeld achterdeel volume: experiment 1. De metingen van 4 muizen uit de groep die twee doses van 10 GY bestraling kregen, zijn in dit cijfer opgenomen. Deze grafiek toont de gemiddelde achterdelen in mm3 in de 8 weken na de operatie. Alle muizen kregen een dosis van 10 GY bestraling vóór en na de operatie. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Week | Lymphedema-volume in mm3 (n = 4) | Controle volume in mm3 (n = 4) | P-waarde | 95% betrouwbaarheidsinterval |
| 1 | 218,53 ± 9,3 | 136,78 ± 2,48 | 0,002 | 53.77 − 109.73 |
| 2 | 202,25 ± 10,24 | 141,88 ± 8,02 | 0,066 | (-6.53) − 127.28 |
| 3 | 193,28 ± 10,80 | 141,20 ± 6,80 | 0,060 | (-3.7) − 107.85 |
| 4 | 194,95 ± 21,05 | 141,50 ± 8,03 | 0,224 | (-41.85) − 148.75 |
| 5 | 193,75 ± 7,07 | 141,70 ± 8,60 | 0,051 | (-0.27) − 104.37 |
| 6 | 193,23 ± 3,42 | 141,78 ± 10,29 | 0,054 | (-1.56) − 104.46 |
| 7 | 194,95 ± 7,26 | 143,23 ± 8,90 | 0,050 | 0.17 − 103.28 |
| 8 | 195,8 ± 9,65 | 152,18 ± 5,81 | 0,009 | 19.88 − 67.38 |
Tabel 1: de meervoudige vergelijkingen test van Sidak: experiment 1. Deze tabel toont de statistische vergelijking tussen de gemiddelde volumes van geïnduceerde lymfoedeem achterbenen en controle achterbenen gedurende de 8 weken na de operatie. Alle muizen kregen een dosis van 10 GY bestraling vóór en na de operatie. Waarden worden weergegeven als: gemiddelde ± SD in mm3. P-waarde < 0,05 wordt beschouwd als een significant verschil tussen de controle achterledematen en het lymfoedeem hindledemaat. n (aantal waarnemingen) = 4.
Experiment 2 omvatte 45 muizen. 15 muizen dienden als controle en kregen zoute injecties. De controles worden gebruikt als representatieve resultaten als we ervan uitgaan dat de zoute injecties geen effect op het volume van geïnduceerde lymfoedeem hadden. Figuur 3 toont aan dat het lymfoedeem minder stabiel was dan in experiment 1. Bovendien steeg het volume van de controle achterledematen gedurende de 8 weken. Dit vermindert het relatieve verschil dat in tabel 2wordt weergegeven. Er wordt gespeceleerd dat de muizen hun niet-bediende achterpoot meer gebruiken, in de weken na de operatie, en dat dit leidt tot hypertrofie en toename van het volume van de ledematen van de niet-bediende achterledemaat. Het belangrijkste is dat tabel 3 aantoont dat er statistisch significant verschil is tussen de lymfoedeem hindledemaat en de controle achterledemaat gedurende alle 8 weken na de operatie. Het hogere aantal muizen bewijst dat deze procedure statistisch significant lymfoedeem gedurende ten minste 8 weken kan induceren.
Figuur 3: gemiddeld achterdeel volume: experiment 2. In deze afbeelding zijn metingen van 15 muizen uit de controlegroep opgenomen. Deze grafiek toont de gemiddelde achterdelen in mm3 in de 8 weken na de operatie. Alle muizen kregen een dosis van 10 GY bestraling vóór en na de operatie. De foutbalken staan voor SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Experiment 1 | Experiment 2 | Experiment 3 | Experiment 1, 2 en 3 gecombineerd | |||||
| Week | Absoluut verschil (mm3) | Relatief verschil (%) | Absoluut verschil (mm3) | Relatief verschil (%) | Absoluut verschil (mm3) | Relatief verschil (%) | Absoluut verschil (mm3) | Relatief verschil (%) |
| 1 | 81,75 ± 7,20 | 0,60 ± 0,04 | 104,34 ± 25,96 | 0,76 ± 0,23 | 85,20 ± 35,05 | 0,64 ± 0,27 | 94,02 ± 29,57 | 0,69 ± 0,24 |
| 2 | 60,38 ± 17,21 | 0,43 ± 0,14 | 107,12 ± 44,33 | 0,79 ± 0,33 | 85,63 ± 37,94 | 0,63 ± 0,29 | 92,77 ± 41,68 | 0,68 ± 0,31 |
| 3 | 52,08 ± 14,35 | 0,37 ± 0,11 | 78,77 ± 39,45 | 0,57 ± 0,28 | 74,67 ± 49,57 | 0,54 ± 0,38 | 73,74 ± 41,51 | 0,53 ± 0,31 |
| 4 | 53,45 ± 24,51 | 0,38 ± 0,19 | 50,67 ± 29,94 | 0,36 ± 0,21 | 50,62 ± 16,35 | 0,37 ± 0,11 | 51,01 ± 24,03 | 0,37 ± 0,17 |
| 5 | 52,05 ± 13,46 | 0,37 ± 0,11 | 32,74 ± 24,66 | 0,22 ± 0,17 | 42,67 ± 11,81 | 0,31 ± 0,07 | 39,08 ± 20,02 | 0,27 ± 0,14 |
| 6 | 51,45 ± 13,63 | 0,36 ± 0,11 | 26,80 ± 22,35 | 0,18 ± 0,14 | 32,86 ± 10,90 | 0,22 ± 0,08 | 32,32 ± 18,96 | 0,21 ± 0,13 |
| 7 | 51,73 ± 13,26 | 0,36 ± 0,11 | 19,04 ± 17,22 | 0,12 ± 0,11 | - | - | 25,92 ± 21,15 | 0,17 ± 0,15 |
| 8 | 43,63 ± 6,11 | 0,29 ± 0,04 | 15,15 ± 11,70 | 0,10 ± 0,08 | - | - | 21,15 ± 15,96 | 0,14 ± 0,10 |
Tabel 2: absoluut en relatief verschil. Deze tabel toont het absolute verschil in volume tussen lymfoedeem-en controle achterpoten ± SD in mm3 en het relatieve verschil ± SD in procent.
| Week | Lymphedema-volume in mm3 (n = 15) | Controle volume in mm3 (n = 15) |
P-waarde | 95% betrouwbaarheidsinterval |
| 1 | 241,82 ± 35,69 | 137,48 ± 21,54 | < 0,001 | 82.21 − 126.47 |
| 2 | 242,41 ± 45,13 | 135,29 ± 5,81 | < 0,001 | 69.33 − 144.89 |
| 3 | 216,85 ± 41,47 | 138,08 ± 5,31 | < 0,001 | 45.15 − 112.39 |
| 4 | 193,10 ± 31,27 | 142,43 ± 5,29 | < 0,001 | 25.15 − 76.18 |
| 5 | 180,03 ± 26,03 | 147,29 ± 6,45 | 0,002 | 11.72 − 53.76 |
| 6 | 179,89 ± 25,00 | 153,09 ± 6,56 | 0,004 | 7.74 − 45.85 |
| 7 | 176,45 ± 19,77 | 157,41 ± 7,49 | 0,008 | 4.35 − 33.71 |
| 8 | 166,97 ± 11,8 | 151,82 ± 10,07 | 0,002 | 5.18 − 25.12 |
Tabel 3: de meervoudige vergelijkingen test van Sidak: experiment 2. Deze tabel toont de statistische vergelijking tussen de gemiddelde volumes van geïnduceerde lymfoedeem achterbenen en controle achterbenen in de 8 weken na de operatie. Alle muizen kregen een dosis van 10 GY bestraling vóór en na de operatie. Waarden worden weergegeven als: gemiddelde ± SD in mm3. P-waarde < 0,05 wordt beschouwd als een significant verschil tussen de controle achterledematen en het lymfoedeem hindledemaat. n (aantal waarnemingen) = 15.
Experiment 3 omvatte 36 muizen. 12 muizen dienden als controle en kregen zoute injecties. De controles worden gebruikt als representatief resultaat, omdat we ervan uitgaan dat de zout injecties geen effect hadden op het volume van geïnduceerde lymfoedeem. In dit experiment werd het achterste volume van de muizen gedurende 6 weken gemeten in plaats van 8. Het experiment duurde slechts 6 weken als gevolg van logistieke moeilijkheden toen het experiment werd uitgevoerd. Figuur 4 toont een consistentere lymfoedeem dan experiment 2. Tabel 4 laat zien dat er in de 6 weken na de operatie statistisch significant lymfoedeem is.
Figuur 4: gemiddeld achterdeel volume: experiment 3. In deze afbeelding zijn metingen van 12 muizen uit de controlegroep opgenomen. Deze grafiek toont de gemiddelde achterdelen in mm3 in de 6 weken na de operatie. Alle muizen kregen een dosis van 10 GY bestraling vóór en na de operatie. De foutbalken staan voor SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Week | Lymphedema-volume in mm3 (n = 12) | Controle volume in mm3 (n = 12) | P-waarde | 95% betrouwbaarheidsinterval |
| 1 | 219,06 ± 35,00 | 133,86 ± 10,02 | < 0,001 | 51.66 − 118.74 |
| 2 | 220,90 ± 36,98 | 135,27 ± 5,89 | < 0,001 | 49.33 − 121.94 |
| 3 | 211,74 ± 47,30 | 137,07 ± 7,56 | 0,002 | 27.24 − 122.11 |
| 4 | 186,09 ± 20,36 | 135,47 ± 5,70 | < 0,001 | 34.98 − 66.27 |
| 5 | 182,35 ± 18,25 | 139,68 ± 7,45 | < 0,001 | 31.37 − 53.98 |
| 6 | 183,44 ± 12,11 | 150,58 ± 8,37 | < 0,001 | 22.42 − 43.29 |
Tabel 4: de meervoudige vergelijkingen test van Sidak: experiment 3. Deze tabel toont de statistische vergelijking tussen de gemiddelde volumes van geïnduceerde lymfoedeem achterbenen en controle achterbenen in de 6 weken na de operatie. Alle muizen kregen een dosis van 10 GY bestraling vóór en na de operatie. Waarden worden weergegeven als: gemiddelde ± SD in mm3. P-waarde < 0,05 wordt beschouwd als een significant verschil tussen de controle achterledematen en het lymfoedeem hindledemaat. n (aantal observaties) = 12.
In Figuur 5 en tabel 5 wordt het gemiddelde achtervolume van alle drie experimenten gecombineerd. Tabel 5 toont aan dat het gebruik van deze procedure resulteert in statistisch significant lymfoedeem dat ten minste 8 weken duurt. Gegevens uit de eerste 6 weken, zijn de gecombineerde metingen van 31 muizen uit experimenten 1, 2 en 3. In week 7 − 8 hadden we alleen gegevens uit experimenten 1 en 2, resulterend in gecombineerde metingen van 19 muizen.
Figuur 5: gecombineerd gemiddelde achterledematen volume: experiment 1, 2 en 3. In de eerste 6 weken na de operatie en bij 19 muizen in de daaropvolgende 2 weken werd een dertigtal muizen opgenomen. Deze grafiek toont de gemiddelde achterdelen in mm3 in de 8 weken na de operatie. Alle muizen kregen een dosis van 10 GY bestraling vóór en na de operatie. De foutbalken staan voor SD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Week | Lymphedema-volume in mm3 (week 1 − 6 n = 31) (Week 7 − 8 n = 19) |
Controle volume in mm3 (week 1 − 6 n = 31) (Week 7 − 8 n = 19) |
P-waarde | 95% betrouwbaarheidsinterval |
| 1 | 230,00 ± 34,46 | 135,99 ± 16,03 | < 0,001 | 78.19 − 109.84 |
| 2 | 228,90 ± 40,91 | 136,13 ± 6,32 | < 0,001 | 70.47 − 115.07 |
| 3 | 211,83 ± 41,15 | 138,09 ± 6,36 | < 0,001 | 51.53 − 95.95 |
| 4 | 190,63 ± 25,81 | 139,62 ± 6,54 | < 0,001 | 38.15 − 63.87 |
| 5 | 182,70 ± 21,52 | 143,62 ± 7,79 | < 0,001 | 28.36 − 49.79 |
| 6 | 182,98 ± 19,11 | 150,66 ± 8,36 | < 0,001 | 22.18 − 42.47 |
| 7 | 180,34 ± 19,31 | 154,43 ± 9,60 | < 0,001 | 11.61 − 40.22 |
| 8 | 173,04 ± 16,42 | 151,89 ± 9,19 | < 0,001 | 10.35 − 31.94 |
Tabel 5: de meervoudige vergelijkingen test van Sidak: experiment 1, 2 en 3 gecombineerd. Deze tabel toont de statistische vergelijking tussen de gemiddelde volumes van geïnduceerde lymfoedeem achterbenen en controle achterbenen van 31 muizen in de eerste 6 weken na de operatie en 19 muizen in de volgende 2 weken. Alle muizen kregen een dosis van 10 GY bestraling vóór en na de operatie. Waarden worden weergegeven als: gemiddelde ± SD in mm3. P-waarde < 0,05 wordt beschouwd als een significant verschil tussen de controle achterledematen en het lymfoedeem hindledemaat. n (aantal waarnemingen) = 31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn enkele kritieke stappen in dit protocol. Ten eerste is het belangrijk dat de onderzoekers veiligheidsmaatregelen nemen bij het werken met radioactiviteit. Ten tweede, tijdens het chirurgische deel van dit protocol, is het belangrijk om de procedure te starten zodra de muis is verdoiliseerd en eindig zonder onnodige pauzes. Dit is belangrijk om te voorkomen dat een buitensporig lange chirurgische periode voor het dier en om te voorkomen dat de anesthesie verliest effect tijdens de operatie. Het wordt aanbevolen om slechts één bolusinjectie van anestheticum te toedienen en de chirurgische ingreep in één zitting te voltooien. Het is ook een kritieke stap, niet te veel Patent blauwe V te beheren, als teveel patent Blue V zal het weefsel rond de lymfevaten verkleuren. Als het omringende weefsel verkleurd raakt, kan het bijna onmogelijk zijn om de lymfevaten te visualiseren en dit doet afbreuk aan de procedure. Zelfs als men erin slaagt om de lymfevaten te visualiseren, zal het verkleurde weefsel het moeilijk maken om te beoordelen of het patent blauw V proximale aan de ligatuur passeert of niet. Dit is problematisch omdat de exploitant er zeker van moet zijn dat de geplaatste ligaturen de lymfestroom vernauwing, om ervoor te zorgen dat de procedure succesvol zal zijn. Het is ook belangrijk om een tussenruimte van 2 − 3 mm te laten bij het sluiten van de wond. Als tijdelijke huid kloof is vaak nodig om het menselijk wond genezingsproces na te bootsen29.
De beperkingen van deze methode zijn dat het een tijdrovende procedure is die toegang tot een microscoop en eerdere microchirurgische training vereist. Bij het uitvoeren van het chirurgische deel van dit protocol is het belangrijk om de tijd tussen de chirurgische ingrepen te plannen. Er wordt veel tijd gewacht op het verdomen van het dier, het scheren van de achterpoot en het in het algemeen voorbereiden op elke chirurgische ingreep. Daarom is het raadzaam om huisvesting en anestheticum van tevoren te bereiden. Het is belangrijk op te merken dat om er zeker van te zijn dat chronisch lymfoedeem is geïnduceerd, Histopathologie moet worden geanalyseerd. We hebben geen histopathologie opgenomen in dit artikel, wat een beperking is. Zonder histopathologie die het feit ondersteunt dat er histologische veranderingen zijn opgetreden met de lymfevaten, kunnen de veranderingen in het volume in de achterledematen alleen worden beschreven als oedeem. Het artikel dat alle gegevens bevat over de vier muizen uit experiment 126 omvat histopathologie en laat zien dat er significante veranderingen waren in de histopathologie met behulp van deze techniek. Het artikel bevat ook lymfatische beeldvorming. Dezelfde procedure werd gebruikt op de muizen in experiment 2 en 3, maar de histopathologie toonde geen significant verschil tussen lymfoedeem hindledemaat en controle achterledemaat in deze experimenten. Verdere onderzoeken, waaronder Histopathologie, zijn nodig voor dit model om te verduidelijken of lymfoedeem wordt geïnduceerd op een histologisch niveau. Experimenten 2 en 3 zijn nog niet gepubliceerd en daarom kunnen we er niet naar verwijzen.
Tijdens het gebruik van μCT-scans voor het meten van het achterledematen volume kan worden beweerd dat het meer objectief is dan het gebruik van de water verplaatsings methode of omtrek metingen, het heeft nog steeds zijn beperkingen. De meettechniek is duur, tijdrovend en vereist toegang tot een μCT-scanner en het analyseren van software.
Een van de grootste uitdagingen met de knaagdieren lymfoedeem modellen in het algemeen, zijn spontane lymfoedeem resolutie, tenzij overmatige straling werd uitgevoerd25. Bij het ontwikkelen van dit model testten we verschillende stralingsdoses om een dosis te vinden die blijvend lymfoedeem zou veroorzaken zonder ernstige morbiditeit26. Eerder zijn lymfoedeem modellen niet gestandaardiseerd in de methoden van inductie-of uitkomst beoordelingen van lymfoedeem. Oashi et al.20 gebruikten een enkelvoudige dosis van 30 Gy bestraling en elk lymfatisch vat werd op drie afzonderlijke punten ligd. In die studie duurde de chirurgische ingreep 90 min om uit te voeren. Hoewel de in dit artikel gepresenteerde methode kan worden beschouwd als tijdrovend, het chirurgische deel van de procedure kan nog steeds worden uitgevoerd ongeveer tweemaal zo snel als de methode gepresenteerd door Oashi et al.20. Ze hadden ook een follow-up periode van 6 maanden, die aanzienlijk langer is dan een van de in dit artikel gepresenteerde studies. Ze bevatten echter slechts één muis en ze handmatig gemeten ledematen omtrek om de zwelling te beoordelen, terwijl de in dit artikel gepresenteerde volumes werden gemeten op 31 muizen met behulp van μCT-scans en 3D-analyse software. Komatsu et al.30 verwijderde de inguinale lymfeklieren en de bijbehorende perifere lymfevaten en vetweefsel met behulp van een elektrisch mes. Het gebruik van een elektrisch mes kan een eenvoudigere aanpak zijn die geen microchirurgische training vereist, maar het geïnduceerde oedeem verdween na dag 4, terwijl de in dit artikel gepresenteerde methode een consistent lymfoedeem biedt dat ten minste 8 weken duurt.
Dit protocol zal hopelijk onderzoekers in staat stellen de beperkingen en voordelen van het herziene lymfoedeem-model in overweging te nemen. Het protocol moet ook onderzoekers helpen om het model met succes te repliceren. De methode kan worden gebruikt in toekomstige observationele en interventionele studies om de pathofysiologie van lymfoedeem en onderzoek nieuwe behandelingsopties te begrijpen. In toekomstige studies, het zou ook interessant zijn om een follow-up langer dan 8 weken om te observeren hoe lang het geïnduceerde lymfoedeem duurt. Het zou ook interessant zijn om het effect van het uitvoeren van meer gerichte bestraling van de muizen vóór en na de operatie te observeren. Dit kan worden gedaan door het uitvoeren van een CT-scan en het plannen van een doelvolume. In toekomstige studies kan dit model ook worden ondersteund door fluorescentie geleide lymfatische beeldvorming, perometrie of bioimpedantie studies. Deze methode biedt statistisch significant lymfoedeem van ten minste 8 weken, dat rechtstreeks is gemeten via CT volumetrisch in drie afzonderlijke experimenten door verschillende lood onderzoekers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Peter bollen, hoofd van het Biomedische Laboratorium voor het lenen van de apparatuur die nodig is om de beelden te registreren die door de microscopen worden gezien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture - Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator - ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad - PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer - PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder - Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V - 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors - Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation - D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic - 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment - viscotears | Bausch & Lomb |
References
- Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).
- Greene, A. K. Epidemiology and morbidity of lymphedema. Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. , Springer International Publishing. New York, NY. 33-44 (2015).
- Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. J. Pathophysiology of lymphedema-Is there a chance for medication treatment? Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 96-98 (2017).
- Grada, A. A., Phillips, T. J. Lymphedema: Pathophysiology and clinical manifestations. Journal of the American Academy of Dermatology. 77 (6), 1009-1020 (2017).
- Chang, D. W., Masia, J., Garza, R. 3rd, Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 209S-218S (2016).
- Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
- DiSipio, T., Rye, S., Newman, B., Hayes, S. Incidence of unilateral arm lymphoedema after breast cancer: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 14 (6), 500-515 (2013).
- Douglass, J., Graves, P., Gordon, S. Self-Care for Management of Secondary Lymphedema: A Systematic Review. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004740 (2016).
- Shih, Y. C. T., et al. Incidence, treatment costs, and complications of lymphedema after breast cancer among women of working age: a 2-year follow-up study. Journal of Clinical Oncology. 27 (12), 2007-2014 (2009).
- Ridner, S. H.
- Gutknecht, M., et al.
- Hayes, S., et al. Prevalence and prognostic significance of secondary lymphedema following breast cancer. Lymphatic Research and Biology. 9 (3), 135-141 (2011).
- Danese, C. A., Georgalas-Bertakis, M., Morales, L. E. A model of chronic postsurgical lymphedema in dogs' limbs. Surgery. 64 (4), 814-820 (1968).
- Das, S. K., Franklin, J. D., O'Brien, B. M., Morrison, W. A. A practical model of secondary lymphedema in dogs. Plastic and Reconstructive Surgery. 68 (3), 422-428 (1981).
- Huang, G. K., Hsin, Y. P. An experimental model for lymphedema in rabbit ear. Microsurgery. 4 (4), 236-242 (1983).
- Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
- Lahteenvuo, M., et al. Growth factor therapy and autologous lymph node transfer in lymphedema. Circulation. 123 (6), 613-620 (2011).
- Honkonen, K. M., et al. Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema. Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).
- Wang, G. Y., Zhong, S. Z. A model of experimental lymphedema in rats' limbs. Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).
- Oashi, K., et al. A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report. Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).
- Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
- Cheung, L., et al. An experimental model for the study of lymphedema and its response to therapeutic lymphangiogenesis. BioDrugs : Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy. 20 (6), 363-370 (2006).
- Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
- Tammela, T., et al. Therapeutic differentiation and maturation of lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation. Nature Medicine. 13 (12), 1458-1466 (2007).
- Frueh, F. S., et al. Animal models in surgical lymphedema research--a systematic review. Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).
- Jorgensen, M. G., et al. Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model. Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).
- Frueh, F. S., et al. High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb. Scientific Reports. 6, 34673 (2016).
- Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).
- Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage. Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).
- Komatsu, E., et al. Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model. Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).
