En reviderad metod för att inducera sekundära lymfödem i bakdelen av möss
Summary
Denna djurmodell gör det möjligt för forskare att inducera statistiskt signifikanta sekundära lymfödem i bakbenen av möss, varar minst 8 veckor. Modellen kan användas för att studera patofysiologin i lymfödem och för att undersöka nya behandlingsalternativ.
Abstract
Djurmodeller är av största vikt i forskningen av lymfödem för att förstå patofysiologin av sjukdomen, men också att utforska potentiella behandlingsalternativ. Denna musmodell gör det möjligt för forskare att inducera betydande lymfödem varar minst 8 veckor. Lymfödem induceras med hjälp av en kombination av fraktionerad strålbehandling och kirurgisk ablation av lymphatics. Denna modell kräver att mössen får en dos av 10 grå (Gy) strålning före och efter operationen. Den kirurgiska delen av modellen innebär ligering av tre lymfkärlen och utvinning av två lymfkörtlar från musen bakben. Att ha tillgång till mikrokirurgiska verktyg och ett Mikroskop är viktigt, på grund av de små anatomiska strukturer av möss. Fördelen med denna modell är att det resulterar i statistiskt signifikanta lymfödem, vilket ger en god grund för att utvärdera olika behandlingsalternativ. Den er också en stor och lätt tillgänglig valen för mikrokirurgisk bildning. Begränsningen av denna modell är att förfarandet kan vara tidskrävande, särskilt om inte praktiseras i förväg. Modellen resulterar i objektivt kvantifierbara lymfödem hos möss, utan att orsaka allvarlig morbiditet och har testats i tre separata projekt.
Introduction
Lymfödem kännetecknas av en ansamling av lymfa vätska som leder till lokaliserad vävnad svullnad, som främst uppstår på grund av nedsatt eller störd flöde av lymfvätska i lymfkärlen1. Lymfflödet kan försämras eller störas av infektion, obstruktion, skada eller medfödda defekter i lymfsystemet2. Dessa etiologier resultera i ackumulering av lymf vätskan, vilket leder till ett kroniskt tillstånd av inflammation, vilket resulterar i efterföljande fibros, samt avsättning av fettvävnad3. Lymfödem kan kategoriseras som primära eller sekundära lymfödem. Primära lymfödem orsakas av utvecklingsstörningar eller genetisk mutation2,4. Sekundära lymfödem uppstår på grund av underliggande systemisk sjukdom, kirurgi eller trauma2,4. Sekundära lymfödem är den vanligaste formen av lymfödem i världen2. I utvecklade länder, den vanligaste orsaken till sekundära lymfödem är onkologisk terapi såsom Adjuvant strålbehandling och lymfkörtel dissektion5. Lymfödem är vanligast bland bröstcancerpatienter, men kan också utvecklas hos patienter med gynekologisk, melanom, urogenital eller halscancer6. Det har föreslagits att av alla kvinnor som diagnostiserats med bröstcancer, 21% kommer att utveckla lymfödem7.
Lymfödem kan vara stressande för patienten både fysiskt och psykiskt. Patienter med lymfödem har en ökad risk för infektion5,8,9, dålig livskvalitet och kan utveckla social ångest och symtom på depression10. Komplikationer av kroniska lymfödem leder till höga kostnader för vård och en ökad sjukdomsbörda9,11. Fynd har också föreslagit att lymfödem kan vara förknippade med ökad risk för dödsfall efter bröstcancerbehandling12. Konservativ förvaltning såsom komprimering av det drabbade området, Manuell lymfdränage och allmän hudvård förblir den första linjen strategi. Det finns för närvarande ingen botande behandling6. Även om framsteg har gjorts inom området kirurgisk och medicinsk terapi, finns det fortfarande utrymme för förbättringar. Mer forskning, ge insikt i patofysiologi och progression av sjukdomen, behövs för att kliniker att ge bättre behandlingsalternativ för patienterna5.
Djurmodeller används i preklinisk forskning för att förstå sjukdomens patofysiologi och utveckla potentiella behandlingsalternativ. Flera olika lymfödem djurmodeller har fastställts i hundar13,14, kaniner15, får16, svin17,18 och gnagare19,20, 21,22,23,24. Den gnagare modellen verkar vara den mest kostnadseffektiva modellen, när man undersöker återuppbyggnaden av lymfatiska funktion, på grund av gnagare är lättillgänglig och relativt lågpris25. Majoriteten av möss modellerna har fokuserat på att inducera lymfödem i svansen på möss21,22,23. Svansen modellen är mycket tillförlitlig, men den exakta kirurgiska tekniken för att inducera lymfödem varierar avsevärt i tidigare publicerat material. Detta resulterar i variationer i varaktighet och robusthet av de utvecklade lymfödem presenteras i känd litteratur25. Olika tekniker används också för att inducera lymfödem i bakbenen modellen och de ger också varierande resultat, men bakbenen modellen kan vara lättare att förstå från ett translationell perspektiv. Tidigare lymfödem modeller har hämmats av spontan lymfödem upplösning och därför en reproducerbar och permanent lymfödem modell behövs25. Forskare har tidigare försökt att öka dosen av strålning, för att förhindra spontan lymfödem upplösning, men detta har ofta lett till efterföljande svår morbiditet25.
Denna modell resulterar i statistiskt signifikanta lymfödem, utan att orsaka allvarlig morbiditet, genom att kombinera mikrokirurgi med strålning. Modellen har reviderats från en tidigare kirurgisk modell genom att tillsätta en dos av bestrålning som inducerar lymfödem, utan att orsaka allvarlig morbiditet26. Det erbjuder också en stor möjlighet för mikrokirurgisk träning. Att ha tillgång till mikrokirurgisk utrustning och ett Mikroskop är nödvändigt, på grund av de små anatomiska strukturer av möss. Det kirurgiska ingreppet kan utföras när användaren har fått lära sig grundläggande mikrokirurgiska tekniker, såsom suturering med mikrokirurgiska instrument. Operatörerna som utförde den här proceduren alla såg handledning videor av Acland om förutsättningarna för mikrokirurgiska färdigheter (1981) och grundläggande microsutur teknik (1985). Vi rekommenderar att du tränar kirurgiska ingrepp 8 − 10 gånger innan du använder det i forskning. Öva proceduren säkerställer att färre misstag görs och att förfarandet kan utföras mer effektivt. När behärskar, kan det kirurgiska ingreppet utföras i 45 minuter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns några kritiska steg i det här protokollet. För det första är det viktigt att forskarna vidtar säkerhetsåtgärder vid arbete med radioaktivitet. För det andra, under den kirurgiska delen av detta protokoll, är det viktigt att inleda förfarandet när musen har sövda och avsluta det utan onödiga pauser. Detta är viktigt för att undvika en överdrivet lång kirurgisk period för djuret och för att förhindra att anestesi förlorar effekt under operationen. Det rekommenderas att endast administrera en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Peter bollen, chef för biomedicinska laboratoriet för utlåning av utrustning som behövs för att spela in materialet sett genom Mikroskop.
Materials
| 10-0 Nylon suture | S&T | 12051-10 | |
| 6-0 Nylon suture – Dafilon | B Braun | C0933112 | |
| Coagulator – ICC 50 | ERBE | ||
| Cotton tipped applicators | Yibon medical co | ||
| Dissecting forceps | Lawton | 09-0190 | |
| Elastic retractors | Odense University Hospital | ||
| Electrical clipper | Aesculap | GT420 | |
| Fentanyl 0,315 mg/ml | Matrix | ||
| Heating pad – PhysioSuite | Kent Scientific Corp. | ||
| Isoflurane 1000mg Attane | Scan Vet | ||
| Isoflurane vaporizer – PPV | Penlon | ||
| Micro jewler forceps | Lawton | 1405-05 | |
| Micro Needle holder | Lawton | 25679-14 | |
| Micro scissors | Lawton | 10128-15 | |
| Micro tying forceps | Lawton | 43953-10 | |
| Microfine U-40 syringe 0,5ml | BD | 328821 | |
| Microlance syringe 25g | BD | ||
| Microlance syringe 27g | BD | ||
| Midazolam 5 mg/ml (hameln) | Matrix | ||
| Needle holder – Circle wood | Lawton | 08-0065 | |
| Non woven swabs | Selefa | ||
| Opmi pico microscope F170 | Zeiss | ||
| Patent blue V – 25 mg/ml | Guerbet | ||
| Scissors – Joseph | BD | RH1630 | |
| Siemens INVEON multimodality pre-clinical scanner | Siemens pre-clinical solutions | ||
| Source of radiation – D3100 | Gulmay | ||
| Stata Statistical Software: Release 15 | StataCorp LLC | ||
| Temgesic – 0,2 mg | Indivior | ||
| Vet eye ointment – viscotears | Bausch & Lomb |
References
- Lawenda, B. D., Mondry, T. E., Johnstone, P. A. S. Lymphedema: a primer on the identification and management of a chronic condition in oncologic treatment. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 59 (1), 8-24 (2009).
- Greene, A. K., Greene, A. K., Slavin, S. A., Brorson, H. Epidemiology and morbidity of lymphedema. Lymphedema: Presentation, Diagnosis, and Treatment. , 33-44 (2015).
- Hespe, G. E., Nores, G. G., Huang, J. J., Mehrara, B. J. Pathophysiology of lymphedema-Is there a chance for medication treatment?. Journal of Surgical Oncology. 115 (1), 96-98 (2017).
- Grada, A. A., Phillips, T. J. Lymphedema: Pathophysiology and clinical manifestations. Journal of the American Academy of Dermatology. 77 (6), 1009-1020 (2017).
- Chang, D. W., Masia, J., Garza, R., Skoracki, R., Neligan, P. C. Lymphedema: Surgical and Medical Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 209S-218S (2016).
- Carl, H. M., et al. Systematic Review of the Surgical Treatment of Extremity Lymphedema. Journal of Reconstructive Microsurgery. 33 (6), 412-425 (2017).
- DiSipio, T., Rye, S., Newman, B., Hayes, S. Incidence of unilateral arm lymphoedema after breast cancer: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Oncology. 14 (6), 500-515 (2013).
- Douglass, J., Graves, P., Gordon, S. Self-Care for Management of Secondary Lymphedema: A Systematic Review. PLoS Neglected Tropical Diseases. 10 (6), e0004740 (2016).
- Shih, Y. C. T., et al. Incidence, treatment costs, and complications of lymphedema after breast cancer among women of working age: a 2-year follow-up study. Journal of Clinical Oncology. 27 (12), 2007-2014 (2009).
- Ridner, S. H. The psycho-social impact of lymphedema. Lymphatic Research and Biology. 7 (2), 109-112 (2009).
- Gutknecht, M., et al. Cost-of-illness of patients with lymphoedema. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 31 (11), 1930-1935 (2017).
- Hayes, S., et al. Prevalence and prognostic significance of secondary lymphedema following breast cancer. Lymphatic Research and Biology. 9 (3), 135-141 (2011).
- Danese, C. A., Georgalas-Bertakis, M., Morales, L. E. A model of chronic postsurgical lymphedema in dogs’ limbs. Surgery. 64 (4), 814-820 (1968).
- Das, S. K., Franklin, J. D., O’Brien, B. M., Morrison, W. A. A practical model of secondary lymphedema in dogs. Plastic and Reconstructive Surgery. 68 (3), 422-428 (1981).
- Huang, G. K., Hsin, Y. P. An experimental model for lymphedema in rabbit ear. Microsurgery. 4 (4), 236-242 (1983).
- Tobbia, D., et al. Lymphedema development and lymphatic function following lymph node excision in sheep. Journal of Vascular Research. 46 (5), 426-434 (2009).
- Lahteenvuo, M., et al. Growth factor therapy and autologous lymph node transfer in lymphedema. Circulation. 123 (6), 613-620 (2011).
- Honkonen, K. M., et al. Lymph node transfer and perinodal lymphatic growth factor treatment for lymphedema. Annals of Surgery. 257 (5), 961-967 (2013).
- Wang, G. Y., Zhong, S. Z. A model of experimental lymphedema in rats’ limbs. Microsurgery. 6 (4), 204-210 (1985).
- Oashi, K., et al. A new model of acquired lymphedema in the mouse hind limb: a preliminary report. Annals of Plastic Surgery. 69 (5), 565-568 (2012).
- Slavin, S. A., Van den Abbeele, A. D., Losken, A., Swartz, M. A., Jain, R. K. Return of lymphatic function after flap transfer for acute lymphedema. Annals of Surgery. 229 (3), 421-427 (1999).
- Cheung, L., et al. An experimental model for the study of lymphedema and its response to therapeutic lymphangiogenesis. BioDrugs : Clinical Immunotherapeutics, Biopharmaceuticals and Gene Therapy. 20 (6), 363-370 (2006).
- Rutkowski, J. M., Moya, M., Johannes, J., Goldman, J., Swartz, M. A. Secondary lymphedema in the mouse tail: Lymphatic hyperplasia, VEGF-C upregulation, and the protective role of MMP-9. Microvascular Research. 72 (3), 161-171 (2006).
- Tammela, T., et al. Therapeutic differentiation and maturation of lymphatic vessels after lymph node dissection and transplantation. Nature Medicine. 13 (12), 1458-1466 (2007).
- Frueh, F. S., et al. Animal models in surgical lymphedema research–a systematic review. Journal of Surgical Research. 200 (1), 208-220 (2016).
- Jorgensen, M. G., et al. Quantification of Chronic Lymphedema in a Revised Mouse Model. Annals of Plastic Surgery. 81 (5), 594-603 (2018).
- Frueh, F. S., et al. High-resolution 3D volumetry versus conventional measuring techniques for the assessment of experimental lymphedema in the mouse hindlimb. Scientific Reports. 6, 34673 (2016).
- Biau, D. J., Kerneis, S., Porcher, R. Statistics in brief: the importance of sample size in the planning and interpretation of medical research. Clinical Orthopaedics and Related Research. 466 (9), 2282-2288 (2008).
- Korula, P., Varma, S. K., Sunderrao, S. Inhibition of wound contraction by point-to-point adherent splintage. Plastic and Reconstructive Surgery. 95 (4), 725-730 (1995).
- Komatsu, E., et al. Lymph Drainage During Wound Healing in a Hindlimb Lymphedema Mouse Model. Lymphatic Research and Biology. 15 (1), 32-38 (2017).
